Practicum: DNA-extractie uit ui – Biologie Klas 4/5 VWO

In dit practicum voor klas 4/5 VWO isoleer je DNA uit uicellen door stapsgewijs de celwand, celmembraan en kernmembraan te verbreken en de celinhoud te zuiveren. Je maakt het DNA zichtbaar als witte, draderige neerslagen en koppelt de uitvoering aan de moleculaire opbouw van DNA, de functie van enzymen en de principes van gentechnologie.

Leerdoel

Na dit practicum kun je de stappen van een DNA-extractie beschrijven en op moleculair niveau verklaren, de werking van detergenten (SDS), zout (NaCl) en protease in de extractie toelichten, de dubbelhelixstructuur van DNA koppelen aan het gedrag van DNA in alcohol, en kritisch reflecteren op de zuiverheid van het geïsoleerde materiaal (DNA versus RNA en eiwitten).

Cursusniveau en vakgebied

Niveau: VWO klas 4/5 | Vak: Biologie | Domein: Zelfregulatie – DNA, eiwitsynthese, erfelijkheid (examenstof), gentechnologie (oriëntatie)

⚠️ CMR-vrije uitvoering – vervanging van gevaarstoffen

Klassieke DNA-extractieprotocollen schrijven soms chloroform of fenol/chloroform voor als onteiwitingsstap, en ethanol 96% (ongedenatureerd, CMR-aanvraag vereist) als precipitant. Deze stoffen staan op de SZW CMR-lijst van kankerverwekkende, mutagene en reproductietoxische stoffen en zijn in het voortgezet onderwijs niet toegestaan zonder uitgebreide risicoanalyse (Arbocatalogus VO, Voion).

In dit practicum wordt chloroform en fenol volledig weggelaten door proteasebehandeling (vleessapmarinade of kiwi-extract) toe te voegen als eiwitafbraakstap. Als precipitant wordt gekoeld isopropanol (propaan-2-ol) gebruikt in plaats van ethanol. Het practicum is hiermee volledig uitvoerbaar zonder CMR-stoffen.

• Onteiwiting (i.p.v. chloroform/fenol): voeg 2 mL natuur-kiwisap of ananassap (bevatten actinidine resp. bromelaïne, beide proteases) toe aan het filtraat en incubeer 5–10 minuten bij kamertemperatuur voor stap 4.
• Precipitant (i.p.v. ethanol 96%): gebruik gekoeld isopropanol (propaan-2-ol, minimaal 70 %; bij voorkeur 99 %). DNA precipiteert hierin even effectief.

Let op: isopropanol is ontvlambaar (gevaarsklasse F). Bewaar ver van open vuur en gebruik in een goed geventileerde ruimte. Draag handschoenen en een veiligheidsbril.

Achtergrondinformatie

DNA bevindt zich in de celkern, die omgeven is door een dubbel kernmembraan, en is strak opgerold rondom histoneiwitten (nucleosomen). Om het DNA te isoleren moeten meerdere barrières worden doorbroken:

1. Mechanisch: versnijden en wrijven van de ui verbreekt de celwanden (cellulose) en scheurt de celmembraan deels.
2. Detergent (SDS – natriumdodecylsulfaat, aanwezig in afwasmiddel): lost de fosfolipiden-dubbellagen van cel- en kernmembraan op → DNA en kerneiwitten komen vrij in oplossing.
3. Zout (NaCl): neutraliseert de sterk negatief geladen fosfaatgroepen op het DNA-ruggengraat. Hierdoor klitten de DNA-moleculen minder, lossen ze beter op in de waterige buffer, en worden ze beter neergeslagen door alcohol later.
4. Protease (kiwi-/ananassap): breekt histonen en andere kerneiwitten af → het DNA komt los van zijn eiwitgeraamte en is zuiverder neergeslagen.
5. Isopropanol (koud): DNA is een polaire molecuul maar slecht oplosbaar in alcoholen. Bij toevoeging van koude isopropanol daalt de polariteit van het oplosmiddel → DNA precipiteert als witte draden (trekken aan met een tandenstoker). Eiwitten en RNA lossen grotendeels wél op in alcohol en blijven in oplossing.

Uien zijn geschikt voor dit practicum omdat ze grote, goed zichtbare cellen hebben en geen storende kleurstoffen bevatten (in tegenstelling tot bijv. rode ui bij hogere zoutconcentraties). Bovendien zijn uien diploïd (2n = 16) met een betrekkelijk groot genoom per cel, wat voldoende DNA oplevert voor zichtbare precipitatie.

Benodigdheden – samenstelling practicum-kit (per groep van 2)

Veiligheid

• Draag gedurende het gehele practicum veiligheidsbril, handschoenen en een labjas.
• Isopropanol is ontvlambaar (GHS02). Bewaar en gebruik ver van open vuur en hete platen. Gebruik alleen in een goed geventileerde ruimte.
• Afvalverwerking: isopropanol opvangen in een aangewezen chemisch afvalvat. Niet in het riool.
• Kiwi-/ananassap: niet innemen; bevat enzymen die irriterend kunnen zijn voor slijmvliezen. Was handen na contact.

Werkwijze

1. Mechanische disruptie: Snijd de ui fijn (blokjes van ∼ 5 mm). Doe in mortier met een snufje zand en wrijf 2 minuten krachtig. Alternatief: doe snippers in een plastic zakje en kneed/stamp 3 minuten.
2. Extractie: Breng het uimateriaal over in een bekerglas. Voeg 50 mL extractiebuffer toe (water + NaCl + afwasmiddel). Roer voorzichtig (niet schuimen). Zet het bekerglas 10 minuten in een waterbad van 60 °C. Roer elke 2 minuten zacht.
3. Afkoelen: Haal het bekerglas uit het waterbad en koel 5 minuten af in een ijsbad tot ≤ 10 °C. Koude omstandigheden zijn nodig voor efficiënte precipitatie in de volgende stap.
4. Proteasebehandeling (VWO-uitbreiding): Voeg 2 mL vers kiwi- of ananassap toe aan het koude extract. Meng zacht en laat 5–10 minuten staan bij kamertemperatuur. De aanwezige proteases breken histonen en overige kerneiwitten af, waardoor het DNA losser in oplossing zit.
5. Filtratie: Vouw een koffiefilter in een trechter boven een schone reageerbuis. Giet het ui-extract er langzaam doorheen. Verzamel ∼ 10 mL helder filtraat. Gooi het filterresidu weg.
6. Alcoholprecipitatie: Houd de reageerbuis schuin. Giet langzaam 10–15 mL ijskoud isopropanol langs de wand van de buis erboven op het filtraat. Niet schudden. Er vormt zich een witte, troebele laag op de grenslaag (interface) na 1–3 minuten: dit is het DNA.
7. DNA ophalen: Steek een houten tandenstoker in de witte draadmassa aan de interface en draai langzaam. De witte draden wikkelen zich om de tandenstoker.

Verwerkingsvragen

1. Verklaar op moleculair niveau waarom NaCl noodzakelijk is voor een succesvolle DNA-precipitatie met alcohol. Betrek hierbij de chemische structuur van het DNA-ruggengraat in uw antwoord.
2. Welke rol spelen de histonen in een levende cel? Waarom is het nodig deze te verwijderen vóór precipitatie?
3. Het geïsoleerde materiaal bevat naast DNA ook RNA en celresten. Noem twee eigenschappen van DNA die toch zorgen dat het zichtbaar neerslaat, terwijl RNA in oplossing blijft.
4. (VWO 5, verdieping) Bij een PCR-analyse na extractie blijkt de reactie te worden geremd. Geef twee mogelijke verklaringen voor deze remming op basis van de gebruikte extractiemethode.

Uitwerking

V1: Het DNA-ruggengraat bestaat uit fosfaatgroepen die bij fysiologische pH volledig geïoniseerd zijn (negatief geladen: PO₄⁻). In water worden deze ladingen gesolvateerd door watermoleculen → DNA blijft in oplossing. NaCl levert Na⁺-ionen die zich binden aan de fosfaatgroepen en de negatieve lading afschermen (ionpairing). Hierdoor neemt de hydrofilie van DNA af. Wanneer vervolgens alcohol wordt toegevoegd, daalt de diëlectrische constante van het oplosmiddel sterk → de ionparen worden onstabiel, de afscherming verdwijnt deels, en de DNA-ketens aggregeren en neerslaan als witte precipitaat.

V2: Histonen zijn positief geladen eiwitten (rijk aan lysine en arginine) die DNA via elektrische aantrekking compacteren tot nucleosomen. In een levende cel zorgt deze compactie voor regulering van gentranscriptie en beschermt het DNA tegen beschadiging. Als histonen niet worden verwijderd, slaan ze samen met het DNA neer als een onzuiver mengsel van eiwit-DNA-complexen, waardoor het DNA moeilijk los te trekken is en niet bruikbaar is voor verdere moleculaire analyses.

V3: (1) DNA-moleculen zijn aanzienlijk groter dan RNA-moleculen (genomisch DNA vs. mRNA/tRNA/rRNA). Lange, vertakte DNA-ketens klitten aan elkaar en vormen een zichtbaar netwerk; kortere RNA-moleculen doen dat niet. (2) DNA is dubbelstrengs en stijver van structuur dan enkelstrengs RNA. De grotere molecuulmassa en de dubbelhelixstructuur vergroten de neiging tot aggregatie bij dalende polariteit van het oplosmiddel.

V4 (verdieping): (1) Polysachariden uit de celwand van de ui (pectines, cellulose-fragmenten) co-precipiteren met het DNA in de alcoholstap. Deze polymeren remmen DNA-polymerase in de PCR-reactie. (2) Resterende SDS (detergent) uit het afwasmiddel kan niet volledig worden verwijderd door de eenvoudige extractie. SDS denatureert het hittestabiele DNA-polymerase (Taq-polymerase) al bij lage concentraties (>0,01 %) en remt daarmee de amplificatie.

Niveauverdieping – VWO 5

Leerlingen in klas 5 VWO kunnen de extractie uitbreiden met een kwantitatieve analyse:

• DNA-zuiverheidsmeting: Meet de absorptie van het opgeloste DNA (na her-oplossen in TE-buffer) bij 260 nm en 280 nm met een spectrofotometer. Een verhouding A₂₆₀/A₂₈₀ tussen 1,8 en 2,0 duidt op zuiver DNA; lagere waarden wijzen op eiwitverontreiniging.
• Foutenanalyse: Bereken de theoretische DNA-opbrengst op basis van het genomgewicht van ui (∼ 15 pg DNA/cel, 2n = 16) en vergelijk met de werkelijk geïsoleerde hoeveelheid. Bespreek verliesposten per stap.
• Vergelijking met gel-elektroforese: Indien beschikbaar kan het extract worden aangebracht op een agarosegel (1 %) om de fragmentgrootte en zuiverheid te visualiseren.

Benodigde laboratoriumartikelen van Labvakhandel

Labvakhandel levert alle benodigde materialen voor dit practicum: reageerbuizen, bekerglazen, mortieren, koffiefilters, isopropanol en persoonlijke beschermingsmiddelen voor DNA-extractie-experimenten in het voortgezet biologieonderwijs.

Bekijk het assortiment voor biologie of neem contact op voor advies.

Meer practicumopdrachten

Ontdek alle practica in de Labvakhandel kennisbank — voor biologie, scheikunde en natuurkunde.