Een goed preparaat is de basis voor een scherp en informatief microscopisch beeld. Biologisch weefsel en cellen zijn van nature vrijwel kleurloos en bieden weinig contrast onder de microscoop. Met de juiste voorbereiding en kleuring worden structuren zichtbaar die anders onopgemerkt blijven. In dit artikel bespreken we de meest gebruikte preparaattypen, fixatiemethoden en kleuringen.
De keuze van het preparaattype hangt af van het te onderzoeken materiaal, de gewenste informatie en of het preparaat tijdelijk of permanent bewaard moet worden.
Het natpreparaat is de eenvoudigste en snelste methode. Een druppel vloeistof met het te onderzoeken materiaal — bijvoorbeeld slootwater met algen, speeksel of een bacteriekweek — wordt op een objectglas geplaatst. Een dekglas wordt schuin aangelegd tegen de druppel en langzaam neergelaten om luchtbellen te voorkomen.
Natpreparaten zijn geschikt voor het bestuderen van levende organismen en cellen in hun natuurlijke omgeving. Het nadeel is dat ze snel uitdrogen en niet bewaard kunnen worden. Voor tijdelijk uitstel van indrogen kan de rand van het dekglas worden afgesloten met paraffine of nagellak.
Bij een uitstrijkpreparaat wordt een dun, gelijkmatig laagje materiaal uitgestreken over het objectglas. Dit wordt toegepast bij:
Na het uitstrijken wordt het preparaat aan de lucht gedroogd en vervolgens gefixeerd en gekleurd. Uitstrijkpreparaten zijn geschikt voor enkelvoudige cellagen en geven een goed overzicht van celmorfologie.
Voor het microscopisch onderzoek van weefselstructuren worden dunne sneden — coupes — gesneden met een microtoom of cryostaat. De dikte bedraagt doorgaans 3 tot 10 micrometer. Het bereidingsproces omvat meerdere stappen:
Paraffinecoupe s zijn geschikt voor permanente preparaten en routinehistologie. Cryosneden worden gebruikt wanneer snel resultaat nodig is — bijvoorbeeld tijdens een operatie voor vriescoupe-diagnostiek — of wanneer antigenen voor immunohistochemie bewaard moeten blijven.
Bij een squashpreparaat wordt zacht weefsel — zoals worteltips voor chromosoomonderzoek — na fixatie en kleuring zacht samengedrukt onder het dekglas, zodat een dunne cellaag ontstaat. Een peltpreparaat maakt gebruik van afgeschild of afgestroopt weefsel, zoals bladepidermis voor het zichtbaar maken van huidmondjes.
Een microscopisch preparaat moet zo dun zijn dat licht er doorheen kan vallen. Drie redenen maken dunheid essentieel:
Fixatie vóór kleuring is om drie redenen noodzakelijk:
Het protocol verschilt per preparaattype. Voor een uitstrijkpreparaat (bijv. bloeduitstrijk of bacterie-uitstrijk):
Fixatie stopt de biologische afbraakprocessen in het weefsel en behoudt de morfologische structuur. Fixatie moet zo snel mogelijk na het verwijderen van het weefsel plaatsvinden. De meest gebruikte fixatiemiddelen zijn:
Kleuringen maken specifieke celstructuren en weefsels zichtbaar door selectieve binding van kleurstof aan celcomponenten. De keuze van de kleuring hangt af van wat u wilt aantonen.
Microscopische kleurstoffen worden ingedeeld naar hun elektrische lading, die bepaalt aan welke celstructuren zij binden:
Dit principe verklaart de HE-kleuring: hematoxyline is een basische kleurstof die celkernen (DNA = negatief) blauw-paars kleurt; eosine is een zure kleurstof die cytoplasma (eiwitten = positief) roze kleurt.
Sommige kleurstoffen vertonen metachromatisme: zij kleuren bepaalde structuren in een andere kleur dan de eigen kleurstofkleur. Toluidineblauw (blauw) kleurt heparine en mastcelgranula metachromatisch paars-rood, omdat de hoge densiteit van negatieve ladingen in deze moleculen de kleurstof aggregeert en de absorptiegolflengte verschuift. Metachromatisme is diagnostisch nuttig voor de identificatie van mastcellen en mucineproducerende cellen.
De HE-kleuring is de meest gebruikte kleuring in de histologie en pathologie. Het is een tweestapskleuring:
Met de HE-kleuring zijn de meeste weefselstructuren goed te onderscheiden. Het is de standaardkleuring voor diagnostisch weefselonderzoek.
De Gram-kleuring is een essentieel hulpmiddel in de microbiologie en onderscheidt grampositieve van gramnegatieve bacterïen op basis van de celwandsamenstelling. Het protocol verloopt in vier stappen:
Grampositieve bacterïen — met een dikke peptidoglycanlaag — retineren het kristalviolet-jodiumcomplex en kleuren blauw-paars. Gramnegatieve bacterïen verliezen de primaire kleurstof bij de ontkleuring en nemen de tegenkleuring (safranine) op: zij kleuren rood. De Gram-uitslag is bepalend voor de keuze van antibiotica.
De Giemsa-kleuring wordt toegepast voor bloeduitstrijken, beenmergpreparaten en malariadiagnostiek. De kleurstof bestaat uit een mengsel van methyleen blauw, azure en eosine. Resultaat:
De PAS-kleuring maakt koolhydraatrijke structuren zichtbaar. Periodiek zuur oxideert vrije hydroxylgroepen in polysacchariden tot aldehyden, die vervolgens reageren met het Schiff-reagens en een magenta-rode kleur geven. De kleuring wordt gebruikt voor:
De Ziehl-Neelsen-kleuring — ook zuurvaste kleuring — wordt gebruikt voor het aantonen van zuurvaste mycobacterïen zoals Mycobacterium tuberculosis en Mycobacterium leprae. De dikke wasachtige celwand van deze bacterïen maakt gewone kleuringen ongeschikt. Bij de Ziehl-Neelsen-kleuring wordt carbol-fuchsine verhit ingebracht; de zuurvaste bacterïen retineren de rode kleurstof na behandeling met zoutzuuralcohol en kleuren rood. De achtergrond wordt blauw gekleurd met methyleen blauw.
Toluidineblauw is een eenvoudige basiskleurstof die nucleïnezuren en zure mucopolysacchariden blauw-paars kleurt. De kleuring is snel uit te voeren en wordt gebruikt voor snelle oriëntatie op weefselstructuur, voor mast-cellen (die metachromatisch paars kleuren) en voor kraakbeenweefsel.
Naast klassieke lichtmicroscopische kleuringen worden in de cel- en moleculaire biologie steeds vaker fluorescentiekleuringen toegepast. Deze kleurstoffen absorberen licht op een specifieke golflengte (excitatie) en zenden licht uit op een langere golflengte (emissie), waardoor ze oplichten tegen een donkere achtergrond. Fluorescentiekleuringen bieden hogere specificiteit en gevoeligheid dan conventionele kleurstoffen en zijn deels bruikbaar op levende cellen. Ze vereisen een fluorescentiemicroscoop met geschikte filtercombinaties.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) is een fluorescentiekleuring die zich in de kleine groef van dubbelstrengs DNA intercaleert. Bij binding aan AT-rijke sequenties wordt de stof geëxciteerd door UV-licht (360 nm) en zendt intens blauw fluorescent licht uit (emissie ~460 nm). DAPI is de standaardkleuring voor kernvisualisatie in fluorescentiemicroscopie en wordt gebruikt voor celtelling, celcyclusanalyse en kernmorfologie. DAPI kan worden toegepast op zowel gefixeerde als levende cellen, al penetreert het levende cellen minder efficiënt dan gefixeerde.
Hoechst 33258 en Hoechst 33342 zijn bisbenzimidazool-verbindingen die, net als DAPI, binden aan AT-rijke DNA-sequenties in de kleine groef. Beide geven blauwe fluorescentie bij UV-excitatie. Het verschil: Hoechst 33342 is celpermeabel en kan levende cellen kleuren zonder fixatie; Hoechst 33258 penetreert levende cellen minder goed en wordt vaker op gefixeerde cellen toegepast. Beide kleuringen worden gebruikt voor kernkleuring, chromosoomanalyse en het onderscheiden van levende van dode cellen in combinatie met andere kleurstofmethoden.
Ethidium Bromide (EtBr) intercaleert in dubbelstrengs DNA en geeft oranje-rode fluorescentie bij excitatie met UV-licht (302 of 366 nm). In de celbiologie wordt EtBr gebruikt om cellen in de late stadia van apoptose of necrose te kleuren: het penetreert alleen cellen met een beschadigde celmembraan en kleurt de kern fluorescerend rood-oranje. In combinatie met acridine-oranje (dat levende cellen groen kleurt) is EtBr een standaardmethode voor het onderscheiden van levende, apoptotische en dode cellen. EtBr is ook de meest gebruikte kleurstof voor het zichtbaar maken van DNA-banden in agarosegel-elektroforese. Let op: ethidium bromide is mutageen en moet worden behandeld als gevaarlijke stof conform de geldende arbo- en afvalregelgeving.
Rhodamine is een familie van fluorescentiekleurstoffen met rode tot oranje-rode excitatie en emissie (excitatie ~550 nm, emissie ~570–620 nm afhankelijk van het derivaat). Rhodamine B en Rhodamine 123 zijn de meest gebruikte varianten in de microscopie. Rhodamine 123 accumuleert selectief in actieve mitochondriën vanwege de negatieve mitochondriale membraanpotentiaal en wordt gebruikt als marker voor mitochondriale activiteit in levende cellen. Rhodamine B wordt toegepast als algemene eiwitkleuring in fluorescentiemicroscopie en als tegenkleuring bij meervoudige kleuring.
Nile Red is een solvatochrome fluorescente kleurstof die oplost in hydrofobe omgevingen en accumuleert in intracellulaire lipidedruppels. In een apolaire omgeving (lipiden) geeft Nile Red gele tot oranje fluorescentie (excitatie ~550 nm, emissie ~630 nm); in een meer polaire omgeving verschuift de emissie naar rood. De kleuring is bruikbaar op levende cellen en is de standaardmethode voor het aantonen van neutrale lipiden en vetten in cellen — onder andere in adipocyten, leverweefsel en algencellen voor biobrandstofonderzoek. Nile Blue, de precursor van Nile Red, kleurt zure lipiden (fosfolipiden) blauw en wordt soms gecombineerd met Nile Red voor differentiatie van lipideklassen.
Een belangrijk onderscheid bij fluorescentiekleuringen is of ze bruikbaar zijn op levende cellen (vital stains) of uitsluitend op gefixeerde preparaten. Kleuringen die levende cellen kunnen kleuren moeten celpermeabel, niet-toxisch bij lage concentraties en bij voorkeur reversibel zijn. De volgende tabel geeft een overzicht:
Hematoxyline is de enige gangbare natuurlijke kleurstof in de histologie. Alle andere routinekleuringen gebruiken synthetische kleurstoffen. De schaarsheid en prijsschommelingen van logwoodhout hebben ertoe geleid dat er intensief wordt gezocht naar synthetische vervangers voor hematoxyline, maar geen alternatief heeft tot nu toe de brede acceptatie van het origineel bereikt.
In volgorde van toepassingfrequentie in een routinelaboratorium:
Permanente preparaten worden na de kleuring ingebed onder een dekglas met een inbeddingsmedium op basis van hars (zoals DPX of Entellan). Het inbeddingsmedium heeft een brekingsindex vergelijkbaar met glas en voorkomt uitdroging en vervaging van de kleuring. Goed ingebedde preparaten zijn jarenlang houdbaar bij bewaring op een droge, donkere locatie.
Zie ook: Optisch onderzoek & microscopie | Preparaatmappen & dozen | Objectglazen & dekglazen | De lichtmicroscoop: onderdelen, werking en onderhoud
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
