Een goed preparaat is de basis voor een scherp en informatief microscopisch beeld. Biologisch weefsel en cellen zijn van nature vrijwel kleurloos en bieden weinig contrast onder de microscoop. Met de juiste voorbereiding en kleuring worden structuren zichtbaar die anders onopgemerkt blijven. In dit artikel bespreken we de meest gebruikte preparaattypen, fixatiemethoden en kleuringen.
De keuze van het preparaattype hangt af van het te onderzoeken materiaal, de gewenste informatie en of het preparaat tijdelijk of permanent bewaard moet worden.
Het natpreparaat is de eenvoudigste en snelste methode. Een druppel vloeistof met het te onderzoeken materiaal — bijvoorbeeld slootwater met algen, speeksel of een bacteriekweek — wordt op een objectglas geplaatst. Een dekglas wordt schuin aangelegd tegen de druppel en langzaam neergelaten om luchtbellen te voorkomen.
Natpreparaten zijn geschikt voor het bestuderen van levende organismen en cellen in hun natuurlijke omgeving. Het nadeel is dat ze snel uitdrogen en niet bewaard kunnen worden. Voor tijdelijk uitstel van indrogen kan de rand van het dekglas worden afgesloten met paraffine of nagellak.
Bij een uitstrijkpreparaat wordt een dun, gelijkmatig laagje materiaal uitgestreken over het objectglas. Dit wordt toegepast bij:
Na het uitstrijken wordt het preparaat aan de lucht gedroogd en vervolgens gefixeerd en gekleurd. Uitstrijkpreparaten zijn geschikt voor enkelvoudige cellagen en geven een goed overzicht van celmorfologie.
Voor het microscopisch onderzoek van weefselstructuren worden dunne sneden — coupes — gesneden met een microtoom of cryostaat. De dikte bedraagt doorgaans 3 tot 10 micrometer. Het bereidingsproces omvat meerdere stappen:
Bij een paraffinecoupe wordt het weefsel gefixeerd, uitgedroogd en ingebed in paraffine voordat het wordt gesneden. Dit proces duurt doorgaans 12 tot 24 uur maar levert preparaten op die jarenlang bewaard kunnen worden en uitstekend geschikt zijn voor de meeste kleuringen en immunohistochemie. Een cryosnede wordt gemaakt door vers of licht gefixeerd weefsel direct in te vriezen en te snijden in een cryostaat bij −20 tot −30 °C. Het voordeel is snelheid: een cryosnede is binnen minuten gereed, wat onmisbaar is bij vriescoupe-diagnostiek tijdens operaties. Nadeel is dat cryosneden minder scherpe morfologie geven dan paraffinecoupes. Voor immunohistochemie waarbij antigenen gevoelig zijn voor formalinefixatie, zijn cryosneden soms de enige optie om de antigeenstructuur intact te houden.
Paraffinecoupes zijn geschikt voor permanente preparaten en routinehistologie. Cryosneden worden gebruikt wanneer snel resultaat nodig is — bijvoorbeeld tijdens een operatie voor vriescoupe-diagnostiek — of wanneer antigenen voor immunohistochemie bewaard moeten blijven. Voor het snij- en prepareergereedschap dat bij de coupevoorbereiding hoort, zie ons artikel over scalpels en dissectie-instrumenten.
Bij een squashpreparaat wordt zacht weefsel — zoals worteltips voor chromosoomonderzoek — na fixatie en kleuring zacht samengedrukt onder het dekglas, zodat een dunne cellaag ontstaat. Een peltpreparaat maakt gebruik van afgeschild of afgestroopt weefsel, zoals bladepidermis voor het zichtbaar maken van huidmondjes.
Bij een natpreparaat wordt het materiaal in een druppel vloeistof onder een dekglas onderzocht, waardoor levende organismen zichtbaar zijn in hun natuurlijke omgeving. Een uitstrijkpreparaat wordt droog uitgestreken op het objectglas, daarna gefixeerd en gekleurd. Uitstrijkpreparaten zijn daardoor niet geschikt voor levend materiaal, maar geven een veel beter overzicht van celmorfologie en zijn onmisbaar voor bacterie- en bloedonderzoek. Natpreparaten zijn eenvoudig en snel maar niet permanent; uitstrijkpreparaten kunnen na kleuring jarenlang bewaard worden.
Een microscopisch preparaat moet zo dun zijn dat licht er doorheen kan vallen. Drie redenen maken dunheid essentieel:
Fixatie vóór kleuring is om drie redenen noodzakelijk:
Het protocol verschilt per preparaattype. Voor een uitstrijkpreparaat (bijv. bloeduitstrijk of bacterie-uitstrijk):
Fixatie stopt de biologische afbraakprocessen in het weefsel en behoudt de morfologische structuur. Fixatie moet zo snel mogelijk na het verwijderen van het weefsel plaatsvinden. De meest gebruikte fixatiemiddelen zijn:
Formaline (4% gebufferd formaldehyde) is de standaardfixatief voor routinehistologie: het penetreert snel, is goedkoop en behoudt de weefselarchitectuur goed genoeg voor lichtmicroscopie en immunohistochemie. Glutaaraldehyde fixeert langzamer maar vormt sterkere dwarsverbindingen tussen eiwitten, waardoor ultrastructuren op nanometerSchaal intact blijven. Daardoor is glutaaraldehyde de voorkeursfixatief voor elektronenmicroscopie, terwijl formaline de voorkeur heeft voor alles wat lichtmicroscopie betreft. Een praktisch verschil: glutaaraldehyde heeft meer tijd nodig om dieper weefsel te bereiken, zodat kleine stukjes weefsel (1–2 mm) worden aangeraden voor optimale fixatie.
Kleuringen maken specifieke celstructuren en weefsels zichtbaar door selectieve binding van kleurstof aan celcomponenten. De keuze van de kleuring hangt af van wat u wilt aantonen.
Microscopische kleurstoffen worden ingedeeld naar hun elektrische lading, die bepaalt aan welke celstructuren zij binden:
Dit principe verklaart de HE-kleuring: hematoxyline is een basische kleurstof die celkernen (DNA = negatief) blauw-paars kleurt; eosine is een zure kleurstof die cytoplasma (eiwitten = positief) roze kleurt.
Sommige kleurstoffen vertonen metachromatisme: zij kleuren bepaalde structuren in een andere kleur dan de eigen kleurstofkleur. Toluidineblauw (blauw) kleurt heparine en mastcelgranula metachromatisch paars-rood, omdat de hoge densiteit van negatieve ladingen in deze moleculen de kleurstof aggregeert en de absorptiegolflengte verschuift. Metachromatisme is diagnostisch nuttig voor de identificatie van mastcellen en mucineproducerende cellen.
De HE-kleuring is de meest gebruikte kleuring in de histologie en pathologie. Het is een tweestapskleuring:
Met de HE-kleuring zijn de meeste weefselstructuren goed te onderscheiden. Het is de standaardkleuring voor diagnostisch weefselonderzoek.
Hematoxyline kleurt alle structuren met een negatieve lading: celkernen (door binding aan DNA en RNA), nucleoli en ribosomen kleuren blauw-paars. Eosine kleurt structuren met een positieve lading: het cytoplasma van cellen, spiervezels, collageen en andere bindweefselelementen kleuren roze tot rood. Structuren die sterk blauw-paars kleuren worden basofiel genoemd; structuren die roze-rood kleuren zijn eosinofiel of acidofiel. De combinatie maakt het mogelijk om in één preparaat celkernen en celinhoud direct van elkaar te onderscheiden.
De Gram-kleuring is een essentieel hulpmiddel in de microbiologie en onderscheidt grampositieve van gramnegatieve bacterïen op basis van de celwandsamenstelling. Het protocol verloopt in vier stappen:
Grampositieve bacterïen — met een dikke peptidoglycanlaag — retineren het kristalviolet-jodiumcomplex en kleuren blauw-paars. Gramnegatieve bacterïen verliezen de primaire kleurstof bij de ontkleuring en nemen de tegenkleuring (safranine) op: zij kleuren rood. De Gram-uitslag is bepalend voor de keuze van antibiotica.
Het verschil zit in de opbouw van de celwand. Grampositieve bacteriën hebben een dikke, meervoudige peptidoglycanlaag direct om de celmembraan. Die laag houdt het kristalviolet-jodiumcomplex vast na ontkleuring met alcohol, zodat de bacteriën blauw-paars blijven. Gramnegatieve bacteriën hebben een dunnere peptidoglycanlaag en een extra buitenmembraan van lipopolysacchariden. De alcohol lost die buitenmembraan op en spoelt het kleurstofcomplex weg, waarna de bacteriën de rode tegenkleuring safranine opnemen. Dit verschil in celwandarchitectuur bepaalt ook de gevoeligheid voor antibiotica: penicillines en cefalosporinen zijn effectiever tegen grampositieve bacteriën, terwijl gramnegatieve bacteriën door hun buitenmembraan extra beschermd zijn.
Een mordant is een hulpstof die de hechting van een kleurstof aan het weefsel versterkt door een brug te vormen tussen kleurstof en celstructuur. Bij de Gram-kleuring is Lugol (jodiumoplossing) de mordant: jodium vormt samen met kristalviolet een onoplosbaar complex in de cel. Bij hematoxyline vervullen aluminiumzouten (aluin) deze rol: ze vormen met de actieve kleurstof hemateine een lak die stevig aan de celkern bindt. Zonder mordant hecht de kleurstof onvoldoende en spoelt bij het wassen weer weg.
De Giemsa-kleuring wordt toegepast voor bloeduitstrijken, beenmergpreparaten en malariadiagnostiek. De kleurstof bestaat uit een mengsel van methyleen blauw, azure en eosine. Resultaat:
De Giemsa-kleuring is de standaardmethode voor het beoordelen van bloeduitstrijken en beenmergpreparaten. Door de combinatie van methyleen blauw, azure en eosine kleuren verschillende celtypen elk in een karakteristieke kleur: rode bloedcellen roze-rood, lymfocyten met een donkerpaarse kern en smal blauw cytoplasma, neutrofiele granulocyten met een paars gelobde kern en bleekroze cytoplasma, en eosinofiele granulocyten met opvallend oranje-rode granula. Die kleurverschillen maken een differentiaal telling van witte bloedcellen mogelijk. Daarnaast is Giemsa de aangewezen kleuring voor malariadiagnostiek: de parasieten van Plasmodium spp. zijn binnen de erytrocyten herkenbaar aan hun paarse kern en blauw cytoplasma, en de ringvorm, trofozoïet en schizontstadia zijn van elkaar te onderscheiden.
De PAS-kleuring maakt koolhydraatrijke structuren zichtbaar. Periodiek zuur oxideert vrije hydroxylgroepen in polysacchariden tot aldehyden, die vervolgens reageren met het Schiff-reagens en een magenta-rode kleur geven. De kleuring wordt gebruikt voor:
De PAS-kleuring (Periodic Acid-Schiff) is specifiek voor structuren die veel polysacchariden bevatten. Het principe bestaat uit twee stappen: periodiek zuur breekt de koolstof-koolstof-binding tussen aangrenzende hydroxylgroepen in polysacchariden open en vormt zo aldehydegroepen. Die aldehyden reageren vervolgens met het Schiff-reagens tot een felroze tot magenta product dat onder de microscoop goed zichtbaar is. Structuren zonder vrije hydroxylgroepen kleuren niet aan. In de routinepathologie wordt de PAS-kleuring veel gebruikt voor nierbiopten (basaalmembranen), het aantonen van glycogeen in leverweefsel bij glycogeenstapelingsziekten en het herkennen van schimmels in weefselpreparaten.
De Ziehl-Neelsen-kleuring — ook zuurvaste kleuring — wordt gebruikt voor het aantonen van zuurvaste mycobacterïen zoals Mycobacterium tuberculosis en Mycobacterium leprae. De dikke wasachtige celwand van deze bacterïen maakt gewone kleuringen ongeschikt. Bij de Ziehl-Neelsen-kleuring wordt carbol-fuchsine verhit ingebracht; de zuurvaste bacterïen retineren de rode kleurstof na behandeling met zoutzuuralcohol en kleuren rood. De achtergrond wordt blauw gekleurd met methyleen blauw.
Mycobacteriën bevatten in hun celwand grote hoeveelheden mycolïnezuren: langketenige vetzuren die de celwand sterk hydrofoob maken. Die wasachtige laag zorgt ervoor dat waterige kleurstoffen de cel normaal gesproken niet binnenkomen. Bij de Ziehl-Neelsen-kleuring wordt carbol-fuchsine (fuchsine opgelost in carbolzuur) onder verhitting aangebracht, waardoor de kleurstof de waslaag toch binnendringt. Vervolgens wordt het preparaat behandeld met zoutzuuralcohol (de “ontkleurer”). Gewone bacteriën en achtergrondsweefsel verliezen de kleurstof bij deze stap; mycobacteriën houden hem vast dankzij hun lipiderijke wand — vandaar de naam “zuurvaste” bacteriën. De rode kleur van de mycobacteriën steekt duidelijk af tegen de blauwe achtergrondkleuring (methyleen blauw).
Toluidineblauw is een eenvoudige basiskleurstof die nucleïnezuren en zure mucopolysacchariden blauw-paars kleurt. De kleuring is snel uit te voeren en wordt gebruikt voor snelle oriëntatie op weefselstructuur, voor mastcellen (die metachromatisch paars kleuren) en voor kraakbeenweefsel.
Naast klassieke lichtmicroscopische kleuringen worden in de cel- en moleculaire biologie steeds vaker fluorescentiekleuringen toegepast. Deze kleurstoffen absorberen licht op een specifieke golflengte (excitatie) en zenden licht uit op een langere golflengte (emissie), waardoor ze oplichten tegen een donkere achtergrond. Fluorescentiekleuringen bieden hogere specificiteit en gevoeligheid dan conventionele kleurstoffen en zijn deels bruikbaar op levende cellen. Ze vereisen een fluorescentiemicroscoop met geschikte filtercombinaties.
DAPI (4',6-diamidino-2-fenylindool) is een fluorescentiekleuring die zich in de kleine groef van dubbelstrengs DNA intercaleert. Bij binding aan AT-rijke sequenties wordt de stof geëxciteerd door UV-licht (360 nm) en zendt intens blauw fluorescent licht uit (emissie ~460 nm). DAPI is de standaardkleuring voor kernvisualisatie in fluorescentiemicroscopie en wordt gebruikt voor celtelling, celcyclusanalyse en kernmorfologie. DAPI kan worden toegepast op zowel gefixeerde als levende cellen, al penetreert het levende cellen minder efficiënt dan gefixeerde.
Hoechst 33258 en Hoechst 33342 zijn bisbenzimidazool-verbindingen die, net als DAPI, binden aan AT-rijke DNA-sequenties in de kleine groef. Beide geven blauwe fluorescentie bij UV-excitatie. Het verschil: Hoechst 33342 is celpermeabel en kan levende cellen kleuren zonder fixatie; Hoechst 33258 penetreert levende cellen minder goed en wordt vaker op gefixeerde cellen toegepast. Beide kleuringen worden gebruikt voor kernkleuring, chromosoomanalyse en het onderscheiden van levende van dode cellen in combinatie met andere kleurstofmethoden.
DAPI en Hoechst-kleuringen (33258 en 33342) binden alledrie aan AT-rijke sequenties in de kleine groef van dubbelstrengs DNA en geven blauwe fluorescentie bij UV-excitatie — in dat opzicht zijn ze sterk vergelijkbaar. De belangrijkste praktische verschillen: Hoechst 33342 is aanzienlijk beter celpermeabel dan DAPI en kan daardoor levende cellen kleuren zonder voorafgaande fixatie, wat DAPI niet of nauwelijks kan. Hoechst 33258 zit daar tussenin en wordt vaker op gefixeerde cellen gebruikt. DAPI geeft over het algemeen een iets scherpere kernkleuring en is minder toxisch bij lage concentraties, maar vereist gefixeerd materiaal voor optimale resultaten. In de praktijk wordt Hoechst 33342 gekozen wanneer levende cellen gekleurd moeten worden; DAPI is de standaard voor gefixeerde preparaten.
Ethidium Bromide (EtBr) intercaleert in dubbelstrengs DNA en geeft oranje-rode fluorescentie bij excitatie met UV-licht (302 of 366 nm). In de celbiologie wordt EtBr gebruikt om cellen in de late stadia van apoptose of necrose te kleuren: het penetreert alleen cellen met een beschadigde celmembraan en kleurt de kern fluorescerend rood-oranje. In combinatie met acridine-oranje (dat levende cellen groen kleurt) is EtBr een standaardmethode voor het onderscheiden van levende, apoptotische en dode cellen. EtBr is ook de meest gebruikte kleurstof voor het zichtbaar maken van DNA-banden in agarosegel-elektroforese. Let op: ethidium bromide is mutageen en moet worden behandeld als gevaarlijke stof conform de geldende arbo- en afvalregelgeving.
Ethidium bromide is een mutageen: het intercaleert in DNA en kan daardoor DNA-schade veroorzaken in levende cellen. In laboratoriumconcentraties is het acuut toxisch effect beperkt, maar langdurige of herhaalde blootstelling via huid, inademing of inslikken moet worden vermeden. Bij het werken met EtBr gelden de volgende basismaatregelen: gebruik altijd nitrilhandschoenen (latex biedt onvoldoende bescherming), werk bij voorkeur in een afzuigkast bij het bereiden van oplossingen, en vermijd het aanraken van oppervlakken buiten de directe werkzone. EtBr-afval — inclusief gels, pipetpunten en handschoenen — moet worden ingezameld als chemisch afval conform de geldende arbo- en milieuregelgeving; lozing via het riool is niet toegestaan. Alternatieven zoals SYBR Safe of GelRed zijn minder mutageen en worden in veel laboratoria als veiliger vervanging toegepast.
Rhodamine is een familie van fluorescentiekleurstoffen met rode tot oranje-rode excitatie en emissie (excitatie ~550 nm, emissie ~570–620 nm afhankelijk van het derivaat). Rhodamine B en Rhodamine 123 zijn de meest gebruikte varianten in de microscopie. Rhodamine 123 accumuleert selectief in actieve mitochondriën vanwege de negatieve mitochondriale membraanpotentiaal en wordt gebruikt als marker voor mitochondriale activiteit in levende cellen. Rhodamine B wordt toegepast als algemene eiwitkleuring in fluorescentiemicroscopie en als tegenkleuring bij meervoudige kleuring.
Nile Red is een solvatochrome fluorescente kleurstof die oplost in hydrofobe omgevingen en accumuleert in intracellulaire lipidedruppels. In een apolaire omgeving (lipiden) geeft Nile Red gele tot oranje fluorescentie (excitatie ~550 nm, emissie ~630 nm); in een meer polaire omgeving verschuift de emissie naar rood. De kleuring is bruikbaar op levende cellen en is de standaardmethode voor het aantonen van neutrale lipiden en vetten in cellen — onder andere in adipocyten, leverweefsel en algencellen voor biobrandstofonderzoek. Nile Blue, de precursor van Nile Red, kleurt zure lipiden (fosfolipiden) blauw en wordt soms gecombineerd met Nile Red voor differentiatie van lipideklassen.
Een belangrijk onderscheid bij fluorescentiekleuringen is of ze bruikbaar zijn op levende cellen (vital stains) of uitsluitend op gefixeerde preparaten. Kleuringen die levende cellen kunnen kleuren moeten celpermeabel, niet-toxisch bij lage concentraties en bij voorkeur reversibel zijn. De volgende tabel geeft een overzicht:
Hematoxyline is de enige gangbare natuurlijke kleurstof in de histologie. Alle andere routinekleuringen gebruiken synthetische kleurstoffen. De schaarsheid en prijsschommelingen van logwoodhout hebben ertoe geleid dat er intensief wordt gezocht naar synthetische vervangers voor hematoxyline, maar geen alternatief heeft tot nu toe de brede acceptatie van het origineel bereikt.
In volgorde van toepassingsfrequentie in een routinelaboratorium:
Permanente preparaten worden na de kleuring ingebed onder een dekglas met een inbeddingsmedium op basis van hars (zoals DPX of Entellan). Het inbeddingsmedium heeft een brekingsindex vergelijkbaar met glas en voorkomt uitdroging en vervaging van de kleuring. Goed ingebedde preparaten zijn jarenlang houdbaar bij bewaring op een droge, donkere locatie.
Zie ook: Optisch onderzoek & microscopie | Preparaatmappen & dozen | Objectglazen & dekglazen | De lichtmicroscoop: onderdelen, werking en onderhoud
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
