Practicum: DNA knippen met restrictie-enzymen – Biologie Klas 5/6 VWO

In dit practicum knip je lambda-DNA (λ-DNA) met een restrictie-enzym (HindIII, eventueel aangevuld met een tweede enzym) en bereid je tegelijk de agarosegel voor die je in het vervolgpracticum gebruikt. Je werkt met micropipetten en reactievaatjes, zoals in een echt DNA-lab, en je koppelt de uitvoering aan de werking van enzymen, herkenningssequenties en DNA-profielen.

Dit is deel 1 van 2. Het knippen van het DNA en het gieten van de gel passen samen in één les van 45 minuten, want de gel moet stollen terwijl het DNA wordt geknipt. In deel 2 (Practicum: Gelelektroforese van DNA) laat je de fragmenten over de gel lopen.

Leerdoel

Na dit practicum kun je beschrijven hoe een restrictie-enzym DNA herkent en knipt, voorspellen hoeveel fragmenten ontstaan bij een gegeven aantal knipplaatsen, uitleggen waarom temperatuur, buffer en controlemonsters belangrijk zijn bij een enzymreactie, en verklaren waarom de reactie wordt gestopt met EDTA.

Cursusniveau en vakgebied

Vak: Biologie | Domein: Zelfregulatie – DNA (restrictie-enzym, PCR, DNA-profiel) en enzymwerking (invloed van temperatuur) | Duur: 1 les van 45 minuten (+ ca. 15 minuten voorbereiding door de TOA of docent)

Voorbereiding door docent of TOA

• Verdun het λ-DNA met steriel water tot een werkoplossing van 200 ng/µL (bewaar op ijs; per groep ca. 20 µL).
• Maak per groep een aliquot van elk restrictie-enzym (ca. 5 µL per enzym) en bewaar dit op ijs. Restrictie-enzymen worden bij −20 °C bewaard en gaan niet op kamertemperatuur.
• Controleer bij elk enzym de sterkte (U/µL), de bijgeleverde buffer en de aanbevolen incubatietijd van de leverancier en pas het pipetteerschema aan volgens de algemene regels onder de benodigdheden.
• Zet het waterbad of de heatblock op 37 °C.
• Maak 1× TAE-buffer (zie benodigdheden) en zet de gel-bakjes met kammen klaar.
• Smelt de agarose (zie stap 6 van de werkwijze) en houd die op 55–60 °C in een waterbad.

Controle vóór de eerste les (docent of TOA)

Dit practicum is een gangbare methode, maar de uitkomst hangt af van uw enzym, gelkamer en kleurstof. Voer daarom vóór de eerste les één proefrun uit met de materialen die u gaat gebruiken, en herhaal die bij nieuw materiaal. Reken op ca. 1,5 uur voor beide delen van de proef samen.

Noteer na afloop: sterkte en buffer van het enzym, benodigde incubatietijd, stollingstijd van de gel.

⚠️ CMR-vrije uitvoering – vervanging van gevaarstoffen

Klassieke gelelektroforese-opstellingen gebruiken ethidiumbromide (Muta. 2, H341) om DNA zichtbaar te maken, en TBE-buffer, waarin boorzuur zit (Repr. 1B, H360FD). Deze stoffen vallen onder de CMR-stoffen (kankerverwekkend, mutageen of reproductietoxisch) en zijn in het voortgezet onderwijs niet toegestaan zonder uitgebreide risicoanalyse (Arbocatalogus VO, Voion).

• Kleuring (i.p.v. ethidiumbromide): methyleenblauw, een gewone kleurstof die met het blote oog zichtbaar is. Dit gebeurt in deel 2. Controleer het actuele veiligheidsinformatieblad van uw leverancier.
• Buffer (i.p.v. TBE): TAE-buffer (Tris, azijnzuur, EDTA), zonder boorzuur.

In dit deel van het practicum worden geen CMR-stoffen gebruikt. De enzymen, buffers en het DNA zijn niet CMR-ingedeeld.

Achtergrondinformatie

Restrictie-enzymen komen oorspronkelijk uit bacteriën, die er vreemd DNA (bijvoorbeeld van virussen) mee onschadelijk maken. Elk restrictie-enzym herkent een specifieke nucleotidenvolgorde van vier tot acht nucleotiden, de herkenningssequentie, en knipt het DNA op die plaats door. In dit practicum gebruik je:

• HindIII (uit Haemophilus influenzae): herkent A↓AGCTT;
• eventueel een tweede enzym, bijvoorbeeld EcoRI (uit Escherichia coli): herkent G↓AATTC.

Beide sequenties zijn palindromen: op de complementaire streng staat in dezelfde leesrichting dezelfde volgorde. De pijl geeft de plaats van het knippen aan.

λ-DNA is het genoom van bacteriofaag lambda, een virus dat E. coli infecteert. Het is een lineair, dubbelstrengs DNA-molecuul van ongeveer 48.500 basenparen (bp). Het is geschikt voor onderwijs omdat de knipplaatsen van veel restrictie-enzymen bekend zijn. Het is niet gevaarlijk voor mensen.

Enzymwerking: net als andere enzymen werken restrictie-enzymen het best bij een bepaalde temperatuur en pH (voor deze enzymen 37 °C en pH 7–8). De buffer levert het juiste milieu en ook magnesiumionen (Mg²⁺), die nodig zijn voor het knippen. De reactie wordt gestopt door EDTA, dat de magnesiumionen bindt, of door het enzym te denatureren.

Verwachte fragmenten: na knippen van λ-DNA ontstaan bij volledige digestie de volgende fragmenten (in bp). Het aantal fragmenten is het aantal knipplaatsen + 1, omdat het DNA lineair is.

Benodigdheden – per groep van 2 tot 3 leerlingen

Noot: het gelvolume hangt af van uw gelbakje. Reken met 1 g agarose per 100 mL TAE (1 %). Voor een gel van 7 × 10 cm en 3–4 mm dikte is ca. 30 mL nodig.

Algemene regels – werkt met elke leverancier

Dit practicum is niet aan een merk gebonden. Gebruik onderstaande regels om het schema aan te passen als uw enzym, buffer of laadbuffer een andere sterkte heeft dan hierboven aangenomen.

• DNA: 1 µg λ-DNA per reactie (hier 5 µL van 200 ng/µL).
• Buffer: altijd de buffer die bij het enzym is geleverd. Volume = reactievolume ÷ sterkte (10×: 2 µL op 20 µL; 5×: 4 µL).
• Enzym: 10–20 eenheden (U) per µg DNA. Hier 2 µL van 10 U/µL = 20 U. Bij 20 U/µL neemt u 1 µL (en 1 µL extra water). Het enzymvolume is nooit meer dan 10 % van het reactievolume (de glycerol in de enzymoplossing remt de reactie).
• Water: vult de reactie aan tot 20 µL (zie schema).
• Incubatie: 37 °C. Standaard enzymen hebben 30–60 minuten nodig, snelle ("fast") enzymen 5–15 minuten. Volg de aanbeveling van de leverancier. Past dat niet in de les, laat dan de TOA de reactie afronden voordat de laadbuffer wordt toegevoegd.
• Laadbuffer (stoppen): volume = reactievolume ÷ (sterkte − 1). Bij 6×: 4 µL op 20 µL.
• Pipetteren: alle volumes in dit practicum liggen tussen 2 en 20 µL, dus één micropipet voor 2–20 µL per groep volstaat.

Veiligheid

• Draag gedurende het gehele practicum een veiligheidsbril, handschoenen en een labjas.
• Gesmolten agarose kan oververhit raken en uit de erlenmeyer spuiten. Dit smelten doet de docent of TOA, met hittebestendige handschoenen en een losjes afgedekte erlenmeyer. Giet de gel pas bij 55–60 °C.
• Restrictie-enzymen en DNA zijn voor mensen onschadelijk, maar werk met schone tips en handschoenen om verontreiniging te voorkomen. Nieuwe tip voor elk reagens.
• Pipetteer nooit met de mond.
• Afvalverwerking: reactievaatjes en tips als gewoon laboratoriumafval, tenzij het schoolreglement anders bepaalt.

Werkwijze

Tijdsplanning (45 minuten): 0–5 min: instructie en veiligheid • 5–17 min: reacties pipetteren • 17–22 min: reacties naar het waterbad en gel gieten • 22–42 min: reacties incuberen, gel stolt, vragen maken • 42–45 min: reactie stoppen en opruimen.

Deel A – DNA knippen

1. Labelen: Schrijf op twee of drie reactievaatjes met de marker: 1 (geen enzym), 2 (HindIII) en eventueel 3 (tweede enzym), plus de groepsletter.
2. Pipetteren: Pipetteer de volumes uit het schema hieronder in de vaatjes, in deze volgorde: water → 10× buffer → DNA → enzym als laatste (enzymen blijven op ijs). Gebruik voor elk reagens een nieuwe tip.

   Vaatje	Steriel water	10× buffer	DNA (200 ng/µL)	Enzym	Totaal
   1 (controle, geen enzym)	13 µL	2 µL	5 µL	–	20 µL
   2 (HindIII)	11 µL	2 µL	5 µL	2 µL	20 µL
   3 (tweede enzym, optioneel)	11 µL	2 µL	5 µL	2 µL	20 µL

   Gebruik voor elk enzym de bij dat enzym geleverde buffer. Verschilt de sterkte van buffer of enzym van de aanname hierboven, pas het schema dan aan volgens de algemene regels bij de benodigdheden. De docent geeft de juiste volumes.

3. Mengen: Sluit de vaatjes en meng door ze 5 keer zacht aan te tikken. Draai de vloeistof naar beneden met een korte spin (of tik het vaatje op tafel). Niet schudden.
4. Incuberen: Zet de vaatjes in het waterbad of de heatblock van 37 °C. Noteer de starttijd. Laat de reactie 20 minuten lopen.

Deel B – Gel gieten (tijdens de incubatie)

Tip: gieten en laten stollen duren samen ca. 25 minuten en passen daardoor krap in de les. Laat de TOA de gels liever vóór de les gieten en sla dan stap 5 t/m 7 over; stap 8 (bewaren) blijft gelden. Dat scheelt ook het smelten van agarose in de les.

5. Gelbakje opbouwen: Plaats het bakje met dammen of tape in de gietstand en steek de kam met minimaal 8 wells erin. Controleer dat de kam horizontaal staat en het bakje waterpas ligt.
6. Agarose (door docent of TOA): Doe 0,30 g agarose in 30 mL 1× TAE in een erlenmeyer. Verwarm in de magnetron (korte intervallen van 20 seconden, tussendoor voorzichtig draaien) tot de oplossing volledig helder is. Koel af tot 55–60 °C.
7. Gieten: Giet de agarose in één keer in het bakje tot een laag van 3–4 mm. Prik luchtbellen door met een tip. Laat de gel 20 tot 25 minuten onaangeroerd stollen.
8. Bewaren: Laat de kam in de gel zitten. Bewaar de gel in het bakje, afgedekt met folie en een beetje TAE, in de koelkast tot de volgende les (maximaal 1 week).

Deel C – Reactie stoppen

9. Stoppen: Haal na 20 minuten de vaatjes uit het waterbad. Voeg aan elk vaatje 4 µL 6× laadbuffer toe (EDTA bindt Mg²⁺, waardoor het enzym stopt). Meng zacht.
10. Bewaren: Zet de vaatjes in de koelkast (maximaal 1 week) of in de vriezer (−20 °C). Noteer welk vaatje welk monster bevat. Ruim de tafel op.

Verwerkingsvragen

1. (HAVO 5 / VWO) Leg uit wat een restrictie-enzym doet en waarom een bacterie zulke enzymen heeft.
2. (HAVO 5 / VWO) Vaatje 1 bevat geen enzym. Waarom is dit vaatje nodig, en wat verwacht je in deel 2 te zien?
3. (HAVO 5 / VWO) De reactie verloopt bij 37 °C. Wat gebeurt er met de enzymwerking bij 4 °C en bij 70 °C? Verklaar met behulp van de bouw van een enzym.
4. (VWO) HindIII knipt λ-DNA op 7 plaatsen. Hoeveel fragmenten ontstaan er? Leg uit waarom het aantal fragmenten niet gelijk is aan het aantal knipplaatsen.
5. (VWO) Waarom worden de enzymen op ijs bewaard en pas als laatste toegevoegd?
6. (VWO 6, verdieping) De herkenningssequentie van HindIII is 6 nucleotiden lang. Bereken hoe vaak zo’n sequentie gemiddeld voorkomt in willekeurig DNA van 48.500 bp (gebruik 4⁶) en vergelijk dit met de werkelijke 7 knipplaatsen.
7. (VWO 6, verdieping) In het practicum DNA-extractie uit ui isoleer je genomisch DNA. Waarom is dat DNA minder geschikt dan λ-DNA om te knippen en op gel te laten lopen?

Uitwerking

V1: Een restrictie-enzym herkent een specifieke nucleotidenvolgorde (vier tot acht nucleotiden) in dubbelstrengs DNA en knipt beide strengen door op die plaats. Bacteriën gebruiken ze als afweer tegen vreemd DNA, bijvoorbeeld van bacteriofagen. Het eigen DNA van de bacterie is beschermd doordat het op de herkenningsplaatsen gemethyleerd is.

V2: Vaatje 1 is de negatieve controle. Het bevat dezelfde buffer en hetzelfde DNA, maar geen enzym, en is net zo lang geïncubeerd. In deel 2 zie je dan een bovenste band van het ongeknipte (of mechanisch licht beschadigde) lange DNA. Dat toont aan dat de fragmenten in de andere vaatjes door het enzym ontstaan, en niet door de buffer, de temperatuur of verontreiniging.

V3: Bij 4 °C bewegen moleculen langzaam, dus het enzym werkt (veel) trager, maar het enzym is niet kapot. Bij 70 °C verbreekt de warmte de zwakke bindingen die de tertiaire structuur van het enzym vasthouden. De actieve plaats vervormt (denaturatie) en het substraat past niet meer. Dit effect is onomkeerbaar.

V4: Er ontstaan 8 fragmenten. Het λ-DNA is lineair: elke knipplaats verdeelt een stuk in twee, dus n knipplaatsen geven n + 1 fragmenten (bij een ringvormig DNA-molecuul, zoals een plasmide, zouden het er n zijn).

V5: Restrictie-enzymen worden bij −20 °C bewaard en blijven op ijs stabiel en veel trager. Door het enzym als laatste toe te voegen, start de reactie pas als alle andere componenten gemengd zijn. Daarna gaan alle vaatjes tegelijk naar 37 °C, zodat ze dezelfde starttijd en dezelfde incubatietijd hebben.

V6: Bij willekeurig DNA met vier nucleotiden is de kans op een specifieke reeks van 6 nucleotiden 1/4⁶ = 1/4096 per plaats. In 48.500 bp verwacht je dus ca. 48.500/4096 ≈ 11,8 plaatsen. De werkelijke 7 knipplaatsen komen daar redelijk bij in de buurt. Het verschil past bij het feit dat nucleotiden in echt DNA niet gelijk verdeeld zijn en het genoom niet willekeurig is (de GC-inhoud van het genoom speelt hierbij een rol).

V7: Genomisch DNA uit ui is vele malen groter (miljarden bp) en bevat een enorm aantal knipplaatsen. Na knippen ontstaat een uitgesmeerd continu patroon (een smear) in plaats van losse banden. Het ruwe extract bevat bovendien RNA, polysachariden en eiwitresten, en de DNA-concentratie is te laag en onbekend om op gel zichtbaar te maken. λ-DNA heeft maar een paar knipplaatsen en levert scherpe, voorspelbare banden.

Niveauverdieping

• HAVO 5: beperk de opdracht tot het knippen van DNA en het begrip enzymwerking. Voorspel hoeveel banden je in deel 2 verwacht.
• VWO 5: voeg een extra vaatje toe met een dubbel-digest van EcoRI en HindIII (alleen als beide enzymen in dezelfde buffer werken; zie de informatie van de leverancier). Voorspel het aantal en de lengtes van de fragmenten.
• VWO 6: zoek de herkenningssequenties van een derde restrictie-enzym op en voorspel het bandenpatroon. Koppel aan het maken van een DNA-profiel (STR-loci die met restrictie-enzymen of PCR worden geknipt of vermeerderd).

Benodigde laboratoriumartikelen

Voor dit practicum heeft u onder meer micropipetten en pipetpunten, steriele reactievaatjes, een waterbad, TAE-buffer en gelelektroforese-apparatuur nodig. Bekijk het assortiment voor biotechnologie & moleculaire biologie en de moleculaire biologie kits en reagentia, of neem contact op voor advies.

Gerelateerde practica

• Practicum: Gelelektroforese van DNA – deel 2 van 2
• DNA-extractie uit ui – genomisch DNA isoleren (VWO 5)
• Gel-elektroforese – DNA-vingerafdruk (VWO 5)
• PCR en genotypering (VWO 6)
• Gel-elektroforese – DNA-analyse (HAVO 5)

Meer practicumopdrachten

Ontdek alle practica in de Labvakhandel kennisbank — voor biologie, scheikunde en natuurkunde.