Practicum: Gelelektroforese van DNA – Biologie Klas 5/6 VWO

In dit practicum laat je de DNA-fragmenten uit het vorige practicum over een agarosegel lopen. Onder invloed van een elektrisch veld worden de fragmenten op lengte gescheiden. Je maakt de banden zichtbaar met methyleenblauw, bepaalt de lengte van de fragmenten met een ijkgrafiek en koppelt de techniek aan het maken van een DNA-profiel.

Dit is deel 2 van 2. Je hebt in Practicum: DNA knippen met restrictie-enzymen het λ-DNA geknipt en de gel gegoten. In deze les (45 minuten) laad je de gel en laat je de fragmenten lopen. De kleuring en ontkleuring gebeuren buiten de les (zie voorbereiding). De verwerking doe je in een tweede lesdeel of als huiswerk.

Leerdoel

Na dit practicum kun je uitleggen waarom DNA in een gel naar de positieve pool beweegt en waarom kleine fragmenten sneller lopen dan grote, een gelelektroforese zelfstandig uitvoeren, uit de afgelegde afstanden een ijkgrafiek maken en daarmee de lengte van onbekende fragmenten bepalen, en de betrouwbaarheid van je resultaat beoordelen.

Cursusniveau en vakgebied

Vak: Biologie | Domein: Zelfregulatie – DNA (restrictie-enzym, DNA-profiel, PCR, sequencen) | Duur: 1 les van 45 minuten + verwerking van ca. 30 minuten

Voorbereiding door docent of TOA

• Maak 1× TAE-buffer in voldoende hoeveelheid om de gel in de kamer net onder te zetten (kijk in de handleiding van uw kamer; meestal 250–300 mL).
• Maak een kleurbad van 0,02 % (w/v) methyleenblauw in demiwater (0,2 g per liter) in een bakje waar de gel plat in past. Zet demiwater klaar voor het ontkleuren.
• Plakkerige uiteinden loslaten: λ-DNA heeft aan beide uiteinden korte, enkelstrengs stukjes (cos-uiteinden) die bij kamertemperatuur aan elkaar kunnen plakken. Het 23130 bp-fragment en het 4361 bp-fragment vormen dan samen een extra band van ca. 27,5 kb en de 4361-band wordt zwakker. Verwarm daarom vlak voor de les alle monstervaatjes 5 minuten op 65 °C (waterbad of heatblock) en zet ze direct daarna op ijs.
• Controleer de voeding en het aansluiten van de kabels voor de les. Zet de spanning op 100–120 V (constante spanning).
• Plan de kleuring: de gel gaat direct na de run minimaal 30 minuten in het kleurbad (of tot de volgende dag) en daarna in demiwater om te ontkleuren (zie werkwijze).

Controle vóór de eerste les (docent of TOA)

Dit practicum is een gangbare methode, maar de uitkomst hangt af van uw enzym, gelkamer en kleurstof. Voer daarom vóór de eerste les één proefrun uit met de materialen die u gaat gebruiken, en herhaal die bij nieuw materiaal. Reken op ca. 1,5 uur voor beide delen van de proef samen.

Noteer na afloop: elektrodeafstand, spanning, looptijd, kleurduur, aantal zichtbare banden in de HindIII-baan.

⚠️ CMR-vrije uitvoering – vervanging van gevaarstoffen

Klassiek wordt DNA op een gel zichtbaar gemaakt met ethidiumbromide (Muta. 2, H341), in combinatie met een UV-lamp, en loopt de gel in TBE-buffer met boorzuur (Repr. 1B, H360FD). Deze stoffen horen bij de CMR-stoffen en zijn in het voortgezet onderwijs niet toegestaan zonder uitgebreide risicoanalyse.

• Kleuring (i.p.v. ethidiumbromide): methyleenblauw, 0,02 %. De banden zijn zichtbaar zonder UV-licht, dus u heeft ook geen UV-kast nodig. Controleer het actuele veiligheidsinformatieblad van uw leverancier.
• Loopbuffer (i.p.v. TBE): TAE-buffer, zonder boorzuur.

Praktische noot: methyleenblauw is aanzienlijk minder gevoelig dan ethidiumbromide. Kleine fragmenten (onder ca. 1000 bp) zijn daardoor vaak niet te zien. Voor de lengtebepaling in dit practicum is dat geen probleem, omdat de grotere fragmenten voldoende zijn. Heeft de school een blauwlichtkast en een niet-mutagene fluorescente DNA-kleuring, dan kan die als alternatief worden gebruikt; controleer dan eerst de classificatie in het veiligheidsinformatieblad.

Achtergrondinformatie

1. Lading: DNA heeft een ruggengraat van suiker- en fosfaatgroepen. De fosfaatgroepen zijn bij pH 8 negatief geladen. In een elektrisch veld beweegt DNA daarom naar de positieve pool (anode, rood). Plaats de wells dus aan de kant van de negatieve pool (kathode, zwart).
2. Zeef: Agarose vormt een netwerk met kleine poriën. Kleine DNA-fragmenten kunnen daar gemakkelijk doorheen en leggen een grotere afstand af dan grote fragmenten, die door het netwerk worden afgeremd. De lading per basenpaar is vrijwel gelijk, dus de snelheid hangt vooral van de lengte af.
3. Lengte en afstand: Binnen een bepaald bereik is de afgelegde afstand ongeveer lineair met de logaritme van het aantal basenparen. Daarom werk je met een semilogaritmische grafiek.
4. TAE-buffer: De buffer houdt de pH constant en maakt de gel geleidend (de ionen voeren de stroom).
5. Laadbuffer: Het glycerol maakt het monster zwaarder, zodat het in de well zakt. Het bromofenolblauw maakt de voortgang van de run zichtbaar (het loopt veel sneller dan de grote DNA-fragmenten, ruwweg zoals een fragment van enkele honderden bp).
6. Methyleenblauw: Deze kationische kleurstof bindt aan de negatief geladen fosfaatgroepen van het DNA. Daarom kleur je na de run (in de gel meegeven zou de kleurstof de andere kant op laten lopen). Na kleuren verdwijnt de achtergrondkleur in water, waardoor de banden zichtbaar blijven.

Benodigdheden – per gel (twee groepen delen één gel van 8 wells)

Algemene regels – werkt met elke leverancier

• Kamer en gelbakje: elke horizontale mini-gelkamer is geschikt. Vul met 1× TAE tot de gel 2–3 mm onder buffer staat.
• Spanning: constante spanning, ca. 5–8 V per cm afstand tussen de elektroden. De genoemde 100–120 V geldt voor een kamer met een elektrodeafstand van ca. 15–20 cm; bij een kortere afstand zet u de spanning lager. Houd de looptijd aan tot de blauwe voorfront bijna aan het einde is, niet aan de klok alleen.
• Laadvolume: laad niet meer dan de well aankan (bij mini-gels meestal 15–25 µL). Hier wordt 20 µL van 24 µL geladen (ca. 0,8 µg DNA per baan).
• Pipetteren: één micropipet voor 2–20 µL per groep volstaat.

Veiligheid

• Draag gedurende het gehele practicum een veiligheidsbril, handschoenen en een labjas.
• Elektrische veiligheid: de voeding levert een spanning van 100–120 V. Zet de voeding uit en haal de kabels los voordat je het deksel opent of iets in de kamer aanraakt. Houd de omgeving droog; morst je buffer, dan eerst de spanning uitschakelen en opruimen. Gebruik alleen kamers en kabels met afgeschermde stekkers en een goed sluitend deksel.
• Laat de kamer tijdens de run niet onbeheerd en verplaats hem niet.
• Methyleenblauw kleurt blijvend en is schadelijk bij inslikken. Draag handschoenen, was de handen en raak het gezicht niet aan.
• Afvalverwerking: kleurbad, ontkleurwater en gebruikte gels opvangen en als chemisch afval aanbieden volgens het schoolreglement. Niet door de gootsteen spoelen.

Werkwijze

Tijdsplanning (45 minuten): 0–5 min: instructie en veiligheid • 5–12 min: gel in de kamer, buffer erbij • 12–22 min: monsters laden • 22–42 min: run (en theorievragen) • 42–45 min: spanning uit, gel overbrengen naar het kleurbad en opruimen.

Deel A – Gel in de kamer en laden

1. Kam verwijderen: Trek de kam voorzichtig recht omhoog uit de gel (de wells moeten heel blijven). Dit doet de docent of TOA eventueel voor.
2. Gel plaatsen: Leg het gelbakje met de gel in de kamer, met de wells aan de negatieve pool (zwart). Giet TAE in de kamer tot de gel ca. 2–3 mm onder buffer staat. Zorg dat de wells vol buffer staan.
3. Laadschema: Elke groep gebruikt 4 wells (A: 1–4, B: 5–8). Schrijf op welk monster in welke well komt.

   Well (groep A)	Well (groep B)	Monster	Volume
   1	5	Vaatje 1: λ-DNA, geen enzym	20 µL
   2	6	Vaatje 2: λ-DNA + HindIII (ijking: bekende fragmenten)	20 µL
   3	7	Vaatje 3: tweede enzym (bijvoorbeeld EcoRI) of docentmonster (onbekend)	20 µL
   4	8	Leeg	–

   Noot: is in deel 1 (DNA knippen) alleen met HindIII gewerkt, geef dan in well 3/7 een onbekend docentmonster (bijvoorbeeld λ-DNA geknipt met een ander enzym waarvan u de fragmentlengtes kent). De leerlingen bepalen de lengtes met de ijking van baan 2.

   Groep B leest well 5, 6 en 7 als baan 1, 2 en 3. De verwerkingsvragen en de ijking verwijzen naar de baannummers van groep A.

4. Laden: Pipetteer 20 µL monster langzaam in de juiste well. Houd de tip net boven de bodem van de well, door het buffer heen, zonder de gel te doorboren. Druk het monster rustig uit; het zakt dankzij het glycerol naar de bodem. Gebruik een nieuwe tip voor elk monster. Noteer de volgorde.

Deel B – Run

5. Deksel en kabels: Plaats het deksel zo dat rode kabel op rode pool en zwarte op zwarte pool zit. Laat de docent controleren voordat de voeding wordt aangezet.
6. Starten: Zet de voeding aan op 100–120 V. Controleer na een minuut of er kleine belletjes aan de elektroden ontstaan en of het blauwe bromofenolblauw naar de rode pool loopt.
7. Lopen: Laat de gel ca. 20 minuten lopen (bij 100–120 V op een kamer met 15–20 cm elektrodeafstand). Stop zodra de blauwe voorfront ca. 1–1,5 cm voor het einde van de gel is. Noteer de spanning en de looptijd. Maak intussen de verwerkingsvragen 1 t/m 3.
8. Stoppen: Zet de voeding uit, haal de kabels los en pas dan het deksel eraf. Schuif de gel voorzichtig van het bakje naar het kleurbad.

Deel C – Kleuren en ontkleuren (buiten de les of met de TOA)

9. Kleuren: Leg de gel 30 minuten (of tot de volgende dag) in het methyleenblauwbad op een schudplateau of in een bakje dat af en toe wordt bewogen. Giet de kleurstof terug in de fles (hergebruik).
10. Ontkleuren: Spoel de gel kort met demiwater en leg hem in vers demiwater. Ververs het water 3 keer in 30–60 minuten (of laat de gel overnacht in water liggen) tot de achtergrond bijna kleurloos is en de banden blauw blijven.
11. Vastleggen: Leg de gel op een witte achtergrond met een liniaal ernaast en maak een foto recht van boven. Je gebruikt deze foto voor de verwerking.

Deel D – Verwerking (tweede lesdeel of huiswerk)

12. Afstanden meten: Meet voor elke band in baan 2 (HindIII) en baan 3 (tweede enzym of docentmonster) de afstand van de onderrand van de well tot het midden van de band, in mm.
13. IJkgrafiek: Zet voor de HindIII-banden de afstand (mm, x-as) tegen log₁₀(lengte in bp) (y-as), of gebruik semilogaritmisch papier. Gebruik de lengtes uit de tabel in de uitwerking. Laat het grootste fragment (23130 bp) weg als het van de lijn afwijkt, want dat zit buiten het lineaire bereik.
14. Lengtebepaling: Lees voor elke band in baan 3 de lengte af uit de grafiek (of bereken die met de formule van de trendlijn). Vergelijk met de theoretische waarden.

Verwerkingsvragen

1. (HAVO 5 / VWO) Waarom beweegt DNA naar de positieve pool?
2. (HAVO 5 / VWO) Waarom leggen kleine fragmenten een grotere afstand af dan grote fragmenten?
3. (HAVO 5 / VWO) Welke baan is de negatieve controle? Wat zie je daar, en wat zegt dat over de andere banen?
4. (HAVO 5 / VWO) Vergelijk baan 2 en baan 3. Hoeveel banden tel je? Hoe verhoudt dat tot het aantal fragmenten uit de tabel?
5. (VWO) Maak de ijkgrafiek (zie werkwijze) en bepaal de lengtes van de banden in baan 3. Bereken per band de relatieve afwijking ten opzichte van de theoretische waarde.
6. (VWO) Voor een enzym met 6 fragmenten (zoals EcoRI) zie je minder banden. Geef twee mogelijke verklaringen.
7. (VWO 6) Foutenanalyse: de afstand kun je op 1 mm nauwkeurig aflezen. Wat betekent dat voor de bepaalde lengte van een fragment van ca. 4000 bp? Noem twee andere oorzaken van afwijkingen.
8. (VWO 6) Welke twee stappen horen er in de praktijk bij een DNA-profiel vóór de gelelektroforese, en wat maakt het verschil tussen twee personen zichtbaar op de gel?
9. (VWO 6, verdieping) Waarom is het niet handig om methyleenblauw in de gel zelf te mengen?

Uitwerking

Theoretische fragmentlengtes van λ-DNA (in bp), voor de ijking en de vergelijking:

V1: De fosfaatgroepen in de DNA-ruggengraat zijn bij de pH van de buffer negatief geladen. In het elektrische veld wordt een negatief geladen deeltje aangetrokken door de positieve pool.

V2: De lading per basenpaar is vrijwel gelijk, dus langere fragmenten hebben evenredig meer lading en worden niet sneller aangetrokken. Wel moeten ze door de poriën van het agarosenetwerk. Grote fragmenten komen daar moeilijk doorheen en blijven achter; kleine glijden er gemakkelijk door. Dus: hoe kleiner het fragment, hoe groter de afgelegde afstand.

V3: Baan 1 (en baan 5) is de negatieve controle zonder enzym. Hier zie je bovenaan, dicht bij de well, een enkele band (het lange, ongeknipte λ-DNA van ca. 48.500 bp). Dat toont aan dat de banden in de banen 2 en 3 het gevolg zijn van het enzym, en niet van de buffer, temperatuur of de behandeling.

V4: Je telt bij HindIII ca. 4–5 banden en bij EcoRI ca. 5. Theoretisch zijn dat er 8 en 6. Het verschil komt doordat (a) fragmenten van bijna dezelfde lengte (2322 en 2027 bp bij HindIII; 5804 en 5643 bp bij EcoRI) niet apart zichtbaar zijn en (b) kleine fragmenten (564 en 125 bp) te weinig DNA bevatten voor methyleenblauw of de gel uitlopen.

V5: Voorbeeld van de methode: meet de afstanden voor de HindIII-banden en zet afstand (mm) tegen log₁₀(bp). Door de punten ontstaat een (vrijwel) rechte lijn. Voorbeeld: 6557 bp → log = 3,82; 4361 bp → 3,64; 2322 bp → 3,37. Met de trendlijn (y = a·x + b) vind je de lengte van een onbekende band met log₁₀(bp) = a·afstand + b, dus bp = 10^{(a·afstand + b)}. De relatieve afwijking is |bp_gemeten − bp_theorie|/bp_theorie × 100 %. Op een korte schoolgel is een afwijking van 5–15 % gebruikelijk. Gebruik het grootste fragment (23130 bp) niet voor de ijking als het niet op de lijn ligt.

V6: (1) Bij EcoRI zijn de fragmenten 5804 bp en 5643 bp bijna even lang en lopen in één band. (2) Ook 4878 bp ligt daar dicht bij; op een korte gel kan die band (gedeeltelijk) meevallen. Andere mogelijke oorzaken: onvolledige digestie of te weinig DNA in de baan. (De kleinste EcoRI-fragmenten zijn 3530 bp; dat ze te klein zijn voor methyleenblauw speelt hier dus niet.)

V7: Als je de afstand op ±1 mm afleest, geeft dat een afwijking in log₁₀(bp) van helling × Δafstand, en de relatieve onzekerheid in de lengte is ongeveer 2,3 × die waarde. Voorbeeld: bij een helling van 0,04 log-eenheden per mm geeft 1 mm een onzekerheid van ca. 2,3 × 0,04 ≈ 0,09, dus ca. 9 % (ca. 360 bp bij 4000 bp). De helling lees je af uit je eigen ijkgrafiek. Andere oorzaken: dikte en breedte van de band (bandverbreding), een scheve of niet goed gestolde gel, een ongelijke elektrische veldsterkte, het meten aan de verkeerde plek van de band, en afwijkingen bij grote fragmenten (niet-lineair bereik).

V8: Eerst het DNA isoleren uit een monster (bijvoorbeeld bloed, haar of wangslijmvlies) en vervolgens specifieke loci met repeats vermeerderen met PCR (daarna eventueel knippen met restrictie-enzymen). Mensen verschillen in het aantal repeats van de korte herhalingen (STR-loci). Verschillende aantallen repeats geven DNA-fragmenten van verschillende lengte, die op de gel op een andere plaats terechtkomen. Het bandenpatroon per persoon is de DNA-fingerprint.

V9: Methyleenblauw is positief geladen (kationisch) en bindt daardoor aan de negatief geladen fosfaatgroepen van het DNA. Daarom werkt de kleuring. Zit de kleurstof al in de gel of de buffer, dan beweegt hij in het elektrische veld naar de negatieve pool, dus de andere kant op dan het DNA. Kleurstof en DNA raken van elkaar gescheiden: de banden worden zwak en de hele gel kleurt blauw. Kleuren na de run voorkomt dat.

Niveauverdieping

• HAVO 5: beperk de opdracht tot de kwalitatieve vragen 1 t/m 4 en vergelijk de bandenpatronen van de drie banen met de tabel.
• VWO 5: doe de ijkgrafiek en bepaal de lengtes in baan 3; foutenanalyse mag beperkt blijven tot twee oorzaken.
• VWO 6: werk met het onbekende docentmonster, voeg de foutenanalyse (V7) toe en koppel aan DNA-profielen (V8). Vergelijk de gel met een sequentiegel (sequencen: PCR + gelelektroforese).
• Variatie: varieer de agaroseconcentratie (bijvoorbeeld 0,8 % en 1,5 %) en vergelijk de scheiding van grote en kleine fragmenten.

Benodigde laboratoriumartikelen

Voor dit practicum heeft u onder meer een gelelektroforesekamer, een voeding, micropipetten en pipetpunten, TAE-buffer en methyleenblauw nodig. Bekijk het assortiment voor biotechnologie & moleculaire biologie, elektriciteit & voedingen en moleculaire biologie kits en reagentia, of neem contact op voor advies.

Gerelateerde practica

• Practicum: DNA knippen met restrictie-enzymen – deel 1 van 2
• DNA-extractie uit ui – genomisch DNA isoleren (VWO 5)
• Gel-elektroforese – DNA-vingerafdruk (VWO 5)
• PCR en genotypering (VWO 6)
• Gel-elektroforese – DNA-analyse (HAVO 5)

Meer practicumopdrachten

Ontdek alle practica in de Labvakhandel kennisbank — voor biologie, scheikunde en natuurkunde.