Dunnelaagchromatografie (Thin Layer Chromatography, TLC) is een eenvoudige, snelle en goedkope scheidingstechniek waarmee verbindingen kwalitatief worden geanalyseerd of van elkaar worden onderscheiden. Een monster wordt aangebracht op een vaste stationaire fase — meestal silicagel op een aluminium- of glasplaat — en vervolgens loopt een vloeibare mobiele fase (het eluens) door capillaire werking omhoog langs de plaat. Verbindingen migreren met verschillende snelheden afhankelijk van hun affiniteit voor de stationaire fase versus de mobiele fase. TLC wordt breed ingezet als snelle screeningsmethode, voor reactiebewaking in de synthese en als eerste stap in methode-ontwikkeling voor HPLC.
De mate waarin een verbinding meereist met de mobiele fase wordt uitgedrukt in de retentiefactor Rf:
Rf = afstand afgelegd door de stof (mm) ÷ afstand afgelegd door het loopfront (mm)
De Rf-waarde ligt per definitie tussen 0 en 1. Een Rf van 0,5 betekent dat de stof halverwege de plaat tot stilstand is gekomen terwijl het loopfront de bovenkant bereikte. Polaire verbindingen hebben een lage Rf op silicagel (hoge affiniteit voor de polaire stationaire fase); apolaire verbindingen hebben een hogere Rf. De Rf-waarde is karakteristiek voor een verbinding onder gegeven omstandigheden — plaat, eluens, temperatuur — en kan worden gebruikt voor tentatieve identificatie door vergelijking met referentiestoffen die op dezelfde plaat worden meegelopen.
De meest gebruikte stationaire fase is silicagel 60 (gemiddelde poriëndiameter 60 Å), aangebracht als dunne laag op een aluminium- of glasdrager. Silicagel is polair: verbindingen met hydroxylgroepen, amines of carboxylzuren interageren sterk met de silanol-groepen op het oppervlak en migreren langzaam. Voor omgekeerd-fase TLC (RP-TLC) worden platen met C18-gemodificeerd silicagel gebruikt, waarbij het principe overeenkomt met RP-HPLC.
Andere stationaire fasen zijn aluminiumoxide (aluminiumoxide TLC, geschikt voor basisch- en neutraalgevoelige verbindingen), cellulose (voor hydrofielere verbindingen en aminozuren) en chirale fasen voor enantiomeerscreening.
Platen zijn verkrijgbaar met en zonder UV-indicator (F254 of F366). Een F254-plaat bevat een fluorescerende indicator die geel-groen oplicht onder UV-licht bij 254 nm; verbindingen die UV-licht absorberen verschijnen als donkere vlekken op de fluorescerende achtergrond. Dit is de snelste en meest gebruikte detectiemethode.
TLC bestaat in twee principieel verschillende varianten, gebaseerd op de polariteitsverhouding tussen stationaire en mobiele fase:
De keuze tussen NP-TLC en RP-TLC volgt dezelfde logica als bij HPLC: is de verbinding apolair en goed oplosbaar in organische oplosmiddelen, dan is NP-TLC de eerste keuze. Is de verbinding sterk polair, hydrofiel of ionisch, dan biedt RP-TLC betere scheiding.
De keuze van het eluens bepaalt de selectiviteit. Een polairder eluens verhoogt de Rf-waarden van alle verbindingen (stoffen lopen sneller mee); een apolairder eluens verlaagt ze. Een goed gekozen systeem geeft Rf-waarden tussen 0,2 en 0,8 voor de te scheiden verbindingen, met voldoende onderlinge afstand.
Gangbare eluenssystemen voor silicagel TLC zijn:
Het eluens wordt in de loopkamer gebracht tot een laag van ongeveer 5 mm; de kamer wordt verzadigd met dampen (soms met behulp van filtreerpapier langs de wand) voordat de plaat wordt geplaatst, om reproduceerbare resultaten te krijgen.
Het monster wordt aangebracht als kleine, scherpe spot of streep op de startlijn, op circa 1 cm van de onderkant van de plaat. Een te grote spot geeft brede, diffuse vlekken en slechte scheiding. Aanbrenging gebeurt met:
De monsterconcentratie ligt typisch tussen 1 en 10 mg/ml in een vluchtig oplosmiddel (dichloormethaan, aceton, methanol). Na aanbrenging wordt het oplosmiddel volledig verdampt voordat de plaat in de loopkamer wordt geplaatst.
Een TLC-analyse verloopt altijd in drie opeenvolgende stappen:
Niet alle verbindingen zijn zichtbaar met het blote oog of onder UV-licht. De volgende detectiemethoden worden routinematig ingezet:
High Performance TLC (HPTLC) is een geautomatiseerde, gekwantificeerde variant van klassieke TLC. HPTLC gebruikt platen met fijner silicagel (gemiddelde deeltjesgrootte 5 µm versus 10–12 µm bij standaard TLC), waardoor scherpere banden en hogere plategetallen worden bereikt. Monsteraanbrenging en documentatie zijn volledig geautomatiseerd. HPTLC wordt toegepast in farmaceutische kwaliteitscontrole (identificatietest van werkzame stoffen conform Ph.Eur.), voedingsmiddelenanalyse (kleurstoffen, mycotoxinen) en fytochemisch onderzoek.
TLC is in het syntheselaboratorium onmisbaar voor reactiebewaking: door op regelmatige tijdstippen een spot van het reactiemengsel naast de uitgangsverbinding en het gewenste product te lopen, is de voortgang van de reactie direct zichtbaar. Ook de zuiverheid van fracties na kolomchromatografie wordt routinematig met TLC gecontroleerd.
Door een onbekend monster op dezelfde plaat te lopen als een referentiestandaard (co-spotting), kan een verbinding tentatief worden geïdentificeerd. Gelijke Rf-waarde én gelijke kleur bij visualisatie zijn een sterke aanwijzing voor identiteit, maar geen bewijs — daarvoor is bevestiging via HPLC, GC of spectroscopie noodzakelijk.
TLC wordt standaard gebruikt om het juiste eluenssysteem voor preparatieve kolomchromatografie te bepalen. Als vuistregel: het eluens waarbij de gewenste verbinding op TLC een Rf van 0,2–0,3 heeft, is een goed startpunt voor de kolomchromatografie.
Diverse monografieën in de Europese Farmacopee (Ph.Eur.) schrijven TLC voor als identiteitstest of onzuiverheidsgrens. In de levensmiddelenanalyse wordt TLC ingezet voor snelle screening op voedselkleurstoffen, lipiden en mycotoxinen.
Voor hogere resolutie, kwantificering en betere reproduceerbaarheid is HPLC de aangewezen vervolgstap. Voor vluchtige verbindingen biedt gaschromatografie (GC) hogere scheidingsefficiëntie. Preparatieve scheiding van grotere hoeveelheden verbindingen wordt uitgevoerd via kolomchromatografie op silicagel of via preparatieve HPLC. Voor de analyse van ionen in waterige oplossingen is ionenchromatografie (IC) de aangewezen methode. Voor molecuulgewichtskarakterisering van macromoleculen wordt grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC) ingezet.
Tailing (sleepvorming) bij basische verbindingen op silicagel wordt veroorzaakt door interactie met zure silanolgroepen op het silicaoppervlak. Oplossingen zijn: een kleine hoeveelheid triëthylamine (1–5 %) toevoegen aan het eluens, gebruik van gedesactiveerd of gemodificeerd silicagel, of overstappen op aluminiumoxide als stationaire fase. Bij zure verbindingen kan toevoeging van azijnzuur (1 %) vergelijkbare sleepvorming onderdrukken.
Niet noodzakelijk. Twee verschillende verbindingen kunnen dezelfde Rf hebben in één bepaald eluenssysteem. Herhaal de analyse in een tweede, anders samengesteld eluenssysteem met andere polariteit. Als de Rf-waarden ook dan overeenkomen, en de kleur bij visualisatie gelijk is, is de kans op identiteit groot, maar definitieve bevestiging vereist spectroscopisch of chromatografisch onderzoek (LC-MS, NMR).
Bij papierchromatografie is cellulose de stationaire fase en water (gebonden in de cellulosevezels) de eigenlijke scheidingsfase. TLC op silicagel biedt hogere resolutie, snellere looptijden en een breder scala aan eluenssystemen. Papierchromatografie wordt nog gebruikt voor suikers en aminozuren in onderwijssettings, maar is in analytische laboratoria grotendeels vervangen door TLC en HPLC.
Standaard TLC op silicagel werkt via adsorptie: verbindingen worden tijdelijk gebonden aan het oppervlak van de stationaire fase via waterstofbruggen, dipool-dipool interacties en van der Waals-krachten. De scheiding berust op verschillen in adsorptiesterkte aan het silicaoppervlak. Hoe sterker een verbinding adsorbeert, hoe langzamer ze migreert.
Bij partitiechromatografie is het scheidingsmechanisme anders: verbindingen verdelen zich over twee niet-mengbare fasen op basis van hun verdelingscoëfficiënt, vergelijkbaar met een schudtrechterextractie die continu wordt herhaald. Klassieke papierchromatografie werkt via partitie (water gebonden in de cellulosevezels als stationaire vloeistoffase, organisch oplosmiddel als mobiele fase). Omgekeerde fase TLC op C18-silicagel bevat elementen van beide mechanismen: adsorptie aan de gemodificeerde oppervlakken én partitie tussen de gebonden C18-fase en de waterige mobiele fase.
In de praktijk is het onderscheid voor routinematig TLC-gebruik minder relevant dan de keuze van stationaire fase en eluens. Voor methode-ontwikkeling en het verklaren van onverwacht gedrag van verbindingen (tailing, co-elueren) is begrip van het scheidingsmechanisme wel essentieel.
Deze pagina is onderdeel van de Labvakhandel kennisbank. De informatie is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
