HPLC (High Performance Liquid Chromatography) is een van de meest toegepaste analytische technieken in het laboratorium. De methode scheidt, identificeert en kwantificeert verbindingen in een vloeibaar monster op basis van hun verdeling tussen een mobiele fase (vloeistof) en een stationaire fase (verpakt in een kolom). Doordat HPLC geschikt is voor niet-vluchtige, thermisch labiele en polaire verbindingen — stoffen die zich niet lenen voor gaschromatografie — is de techniek onmisbaar in de farmaceutische industrie, voedingsmiddelenanalyse, milieulaboratoria en biochemisch onderzoek.
Een vloeistofpomp perst de mobiele fase met hoge druk (doorgaans 200–600 bar, bij UHPLC tot 1200 bar) door een kolom gevuld met fijn verpakt stationair-fasemateriaal. Het monster wordt via een injector in de vloeistofstroom gebracht. In de kolom verdelen de afzonderlijke componenten zich voortdurend tussen de mobiele fase en de stationaire fase: stoffen met een hoge affiniteit voor de stationaire fase bewegen langzamer dan stoffen die liever in de mobiele fase blijven. Elk component verlaat de kolom op een karakteristieke retentietijd. Een detector registreert de doorstroming en software verwerkt het signaal tot een chromatogram.
Het chromatogram is de grafische uitvoer van een HPLC-analyse: de x-as toont de tijd (minuten), de y-as toont het detectorsignaal (mAU voor UV, of een ander eenheid afhankelijk van de detector). Elke piek vertegenwoordigt een component in het monster. De belangrijkste parameters zijn:
Stapsgewijze interpretatie van een onbekend chromatogram:
De mobiele fase is een mengsel van oplosmiddelen dat op hoge druk door de kolom wordt gepompt. De oplosmiddelen worden bewaard in HPLC-flessen. Bij omgekeerd-fase HPLC (RP-HPLC) worden ultrapuur water en waterige buffers gecombineerd met organische oplosmiddelen zoals acetonitril of methanol. Bij normaal-fase HPLC worden apolaire oplosmiddelen (hexaan, heptaan) gebruikt in combinatie met een polaire stationaire fase. De samenstelling van de mobiele fase is een primaire sturingsvariabele voor selectiviteit en retentietijd.
Water is in RP-HPLC de primaire component van de mobiele fase en de meest kritische variabele voor reproduceerbaarheid. HPLC-kwaliteitswater is ultrapuur water dat voldoet aan de eisen van de relevante farmacopee of norm:
HPLC-water wordt geproduceerd via een combinatie van omgekeerde osmose (RO), elektro-deionisatie (EDI) en UV-oxidatie. Systemen als de LaboStar of OmniaPure leveren type 1-water conform ISO 3696 direct aan het instrument. Gebruik altijd vers bereid water — langer dan 24 uur opgeslagen ultrapuur water absorbeert CO₂ en organische verontreinigingen uit de lucht, wat de basislijn bij UV-detectie onder 220 nm verstoort. Filtreer mobiele fase altijd door een membraanfilter van 0,2 of 0,45 μm voordat het in het HPLC-reservoir wordt gevuld.
Vacuümdegassering van de mobiele fase — het verwijderen van opgeloste gassen via een membraanmodule onder vacuüm — voorkomt basislijnruis en luchtbellen in de pomp. Zie ons kennisbankartikel vacuüm in het laboratorium voor meer achtergrond over pompkeuze en vacuümopbouw.
Bij isocratische elutie blijft de samenstelling van de mobiele fase gedurende de analyse constant. Bij gradiëntelutie wordt de verhouding organisch/water geleidelijk verhoogd, waardoor verbindingen met uiteenlopende polariteit binnen één run gescheiden kunnen worden. Gradiëntelutie vereist een solventenwisselsysteem (quaternaire of binäre pomp) en een re-equilibratiestap tussen injecties.
De HPLC-pomp levert een constante, pulsvrije vloeistofstroom bij hoge druk. Moderne reciprocerende zuigerpomp-systemen met twee of meer zuigers in fase-verschuiving geven een vrijwel pulsvrije stroom. De stroomsnelheid ligt typisch tussen 0,1 en 2,0 ml/min, afhankelijk van de kolomdiameter. Een drukregelaar bewaakt de systeemdruk; bij verstopping of te hoge viscositeit schakelt het systeem automatisch af ter bescherming van de kolom.
Het monster wordt via een injectielus in de vloeistofstroom gebracht. Handmatige injectoren (Rheodyne-type) zijn geschikt voor sporadisch gebruik; autosamplers plaatsen monsters automatisch en bieden hoge reproduceerbaarheid (RSD < 0,5 % op injectievolume). Het injectievolume varieert van 1 tot 100 µl, waarbij kleinere volumes scherpere pieken geven maar lagere gevoeligheid.
De scheidingskolom bepaalt in grote mate de selectiviteit van de analyse. Standaard analytische kolommen hebben een inwendige diameter van 4,6 mm en een lengte van 50–250 mm. UHPLC-kolommen (Ultra-High Performance LC) gebruiken deeltjes van 1,7–1,8 µm en bereiken aanzienlijk hogere plategetallen bij kortere analysetijden.
De meest gebruikte kolomtypen zijn:
De keuze van de detector bepaalt de gevoeligheid, selectiviteit en het toepassingsgebied. De meest gangbare detectoren zijn:
Ultra-High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) maakt gebruik van kolommen met sub-2-µm deeltjes (1,7–1,8 µm) bij drukken tot 1200 bar. De Van Deemter-vergelijking beschrijft het verband tussen stroomsnelheid en kolomefficiëntie: kleinere deeltjes verschuiven het optimum naar hogere stroomsnelheden, waardoor analyses vijf tot tienmaal sneller kunnen worden uitgevoerd bij gelijkblijvende of betere resolutie. UHPLC-systemen vereisen een speciaal ontworpen pomp, injector en verbindingskapillaren met minimaal dood volume.
HPLC is de dominante techniek voor kwaliteitscontrole van geneesmiddelen. Toepassingen omvatten assay (gehalte werkzame stof), onzuiverheidsprofilering (gerelateerde stoffen conform ICH Q3A/Q3B), oplossingssnelheidsbepalingen, chirale zuiverheid en residuële oplosmiddelen (ICH Q3C, doorgaans via GC maar soms via HPLC). Farmaceutische methoden worden gevalideerd conform ICH Q2(R1) op specificiteit, lineariteit, nauwkeurigheid, precisie, detectielimiet en bepalingslimiet.
HPLC wordt gebruikt voor de bepaling van vitamines (A, B-complex, C, D, E, K), conserveermiddelen, zoetstoffen, kleurstoffen, mycotoxinen, pesticidenresiduen, vetzuurprofielen (na derivatisering) en aminozuren. LC-MS/MS is de standaard geworden voor multi-residu-methoden voor pesticiden in groente en fruit (EN 15662).
Polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK’s), herbiciden, farmaceutische residuen in oppervlaktewater en bisfenol-A worden bepaald via RP-HPLC met fluorescentie- of MS-detectie. Drinking water monitoring conform EU-richtlijn 2020/2184 vereist gevalideerde HPLC-methoden voor een reeks microverontreinigingen.
Eiwitanalyse via SEC (molecuulgewicht, aggregaatstatus), peptidenmapping na enzymatische digestie, oligonucleotidenanalyse en metabolietenprofilering (metabolomics) zijn typische biochemische toepassingen. Bij biofarmatica (monoklonale antilichamen, ADC’s) is HPLC onmisbaar voor karakterisering van glycovormen, oxidaties en deaminaties.
Een nieuwe HPLC-methode wordt doorgaans als volgt ontwikkeld:
UHPLC (Ultra-High Performance LC) werkt met kolommen gevuld met sub-2-µm deeltjes bij drukken boven 600 bar (tot 1200 bar). Dit levert hogere plategetallen, kortere analysetijden en lager oplosmiddelverbruik ten opzichte van conventionele HPLC. UHPLC-systemen zijn duurder en vereisen een hoger technisch onderhoudsniveau. Niet alle bestaande HPLC-methoden zijn zonder aanpassing over te zetten naar UHPLC.
Piekverbreding heeft meerdere oorzaken: overmatig dood volume in verbindingskapillaren, een beschadigde of verouderde kolom door onvoldoende monsterfiltratie, onjuiste pH van de mobiele fase (voor ioniseerbare verbindingen), te hoog injectievolume of ongeschikte injectie-oplosmiddel. Piekasymmetrie (tailing) wordt vaak veroorzaakt door silanolfuncties op de kolomwand die met basische verbindingen interageren; gebruik een end-capped C18-kolom of voeg een kleine hoeveelheid triëthylamine toe aan de mobiele fase.
De pH heeft grote invloed op de retentie van ioniseerbare verbindingen. Voor zuren (pKa 3–5) werkt een mobiele fase met pH 2,5–3,0 goed: de verbinding is ongeladen en retineert op C18. Voor basische verbindingen (pKa 8–10) vermijdt pH 3 al te brede pieken, maar pH 7–8 met een stabiele hoog-pH-kolom geeft betere selectiviteit. Silicakolommen zijn stabiel tussen pH 2 en pH 8; hybride deeltjes (BEH-technologie) zijn stabiel tot pH 12.
LC-MS is noodzakelijk wanneer verbindingen geen of slechts zwakke UV-absorptie hebben, wanneer identificatie naast kwantificering vereist is, bij spooranalyse in complexe matrices (plasma, urine, plantextracten) of bij de analyse van onbekende metabolieten. HPLC-UV blijft de voorkeur voor routinematige kwaliteitscontrole van bekende verbindingen met een duidelijk chromofoor, vanwege lagere operationele kosten en eenvoudigere methodekwalificatie.
HPLC-systemen variëren sterk in prijs afhankelijk van configuratie, detector en fabrikant:
De vier dominante fabrikanten van HPLC-systemen zijn Waters (Alliance, Arc, Acquity UPLC), Agilent Technologies (1100/1200/1260/1290-serie), Shimadzu (Nexera, Prominence) en Thermo Fisher Scientific (Vanquish, UltiMate). Elk merk heeft zijn eigen kolomformaten, software (Empower, OpenLAB, LabSolutions, Chromeleon) en servicestructuur. Bij aanschaf zijn naast instrumentprijs ook servicecontractkosten (typisch 5–10 % van aanschafwaarde per jaar), kolomverbruik (€ 300–800 per kolom), oplosmiddelkosten en softwarelicenties relevante factoren in de totale eigendomskosten (TCO).
Waarom is HPLC duur? De kosten worden bepaald door de precisie-engineering van de pomp (pulsvrij bij 600+ bar), de nauwkeurigheid van de autosampler (injectieprecisie < 0,5 % RSD), de thermostabiliteit van de kolomoven (± 0,1 °C) en de kwaliteit van de detector (DAD: simultaan full-spectrum bij milliseconde-tijdresolutie). UHPLC verhoogt de materiaaleisen verder door de hogere druk op alle afdichtingen en verbindingen.
Ja. In de klinische hematologie is ion-exchange HPLC (IE-HPLC) de referentiemethode voor de analyse van hemoglobinevarianten. Toepassingen zijn:
Chromatografie wordt ingedeeld op basis van het scheidingsmechanisme. De vier hoofdtypen zijn: adsorptiechromatografie — scheiding op basis van adsorptie aan een vaste stationaire fase (bijv. TLC, normaal-fase HPLC op silica); verdelingschromatografie — scheiding op basis van verdeling tussen twee vloeistoffasen, waarvan omgekeerd-fase HPLC (C18) de meest toegepaste vorm is; ionenuitwisselingschromatografie — scheiding op lading via ionogene groepen op de stationaire fase, toegepast in ionenchromatografie en klinische HPLC (HbA1c); en grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC) — scheiding op molecuulmassa via een poreuze stationaire fase. HPLC kan al deze mechanismen benutten, afhankelijk van de kolomkeuze.
GC en HPLC zijn complementaire technieken die elk hun eigen toepassingsgebied hebben — de vraag welke beter is, hangt volledig af van de stof en de analysedoelstelling. GC (gaschromatografie) is geschikter voor vluchtige, thermisch stabiele verbindingen (oplosmiddelen, residuële oplosmiddelen, vluchtige organische stoffen, aroma's) en biedt doorgaans hogere resolutie en gevoeligheid voor die klasse stoffen. HPLC is onmisbaar voor niet-vluchtige, thermisch labiele, polaire of hoogmoleculaire verbindingen zoals geneesmiddelen, eiwitten, suikers, nucleotiden en kleurstoffen die bij GC-temperaturen ontleden of niet verdampen. In de farmaceutische industrie geldt als vuistregel: als een stof niet via GC kan worden geanalyseerd, is HPLC de standaardkeuze. GC-systemen zijn doorgaans goedkoper in aanschaf en onderhoud; HPLC-systemen zijn veelzijdiger inzetbaar. Voor vluchtige oplosmiddelresiduen (ICH Q3C) wordt GC gebruikt; voor de werkzame stof zelf vrijwel altijd HPLC.
De "regel van 3" is geen officiële norm maar een veelgebruikte vuistregel in de HPLC-praktijk die verwijst naar drie kritische systeemparameters die tegelijkertijd acceptabel moeten zijn voordat een analyse als valide wordt beschouwd: (1) resolutie Rs ≥ 1,5 tussen het kritische paar pieken — bij lagere resolutie is betrouwbare kwantificering van naburige componenten niet mogelijk; (2) symmetriefactor (As) tussen 0,8 en 1,5 — pieken buiten dit bereik wijzen op kolomproblematiek of onjuiste methodeomstandigheden; (3) plaatgetal (N) voldoende hoog voor de gebruikte kolom en analysedoel — typisch N ≥ 2.000 voor eenvoudige scheidingen, N ≥ 10.000 voor complexe matrices. In farmaceutische validatie (ICH Q2(R1)) wordt daarnaast gevraagd om minimaal drie onafhankelijke bepalingen (triplicaat) voor precisie-aantoning, wat soms ook als "de regel van 3" wordt aangeduid. In de praktijk worden alle drie de systeemparameters bij systeemgeschiktheidscontrole (SST) getoetst vóór elke analyseserie.
HPLC is een variant van vloeistofchromatografie (LC) — de overkoepelende techniek waarbij een vloeibare mobiele fase wordt gebruikt voor scheiding.
Voor vluchtige en thermisch stabiele verbindingen is gaschromatografie (GC) de aangewezen methode. Wanneer specifiek ionenanalyse in waterige matrices wordt gevraagd, biedt ionenchromatografie (IC) hogere selectiviteit. Voor snelle kwalitatieve screening in vroeg stadium van methode-ontwikkeling kan dunnelaagchromatografie (TLC) als goedkope oriëntatie dienen. Voor molecuulgewichtskarakterisering van polymeren en biofarmaceutica is grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC) de aangewezen methode.
Voor HPLC-verbruiksmaterialen vindt u bij Labvakhandel cuvetten, membraanfilters (0,2 en 0,45 µm) voor monstervoorbereiding, spuitfilters en vials en flacons voor monsterbewaring.
Deze pagina is onderdeel van de Labvakhandel kennisbank. De informatie is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties. Raadpleeg altijd de geldende farmacopee-monografieën, normen en validatievereisten voor uw toepassing.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
