Fotometrie en colorimetrie zijn analytische technieken waarbij de concentratie van een stof wordt bepaald aan de hand van de mate waarin een oplossing licht absorbeert. Ze behoren tot de meest toegepaste methoden in het laboratorium: snel, nauwkeurig en geschikt voor een breed scala aan stoffen — van fosfaat en nitraat in water tot eiwitten in biologische monsters en kleurstoffen in levensmiddelen. De basis van beide technieken is de wet van Lambert-Beer.
Fotometrie is het meten van de intensiteit van licht dat door een oplossing wordt geabsorbeerd of doorgelaten. In de analytische chemie gaat het specifiek om absorptiefotometrie: het bepalen van de concentratie van een stof op basis van de hoeveelheid licht die de oplossing absorbeert bij een specifieke golflengte.
Afhankelijk van het gebruikte golflengtebereik spreekt men van:
Colorimetrie is een specifieke vorm van fotometrie waarbij de meting plaatsvindt in het zichtbare bereik (400–700 nm), op basis van de kleur van een oplossing. De term wordt in twee contexten gebruikt:
In dit artikel gaat het over analytische colorimetrie. Het onderscheid met fotometrie is gradueel: colorimetrie werkt altijd met zichtbaar licht en een gekleurde oplossing; fotometrie is de bredere term die ook UV en IR omvat.
Het theoretische fundament van zowel fotometrie als colorimetrie is de wet van Lambert-Beer (ook: Beer-Lambert wet). Deze wet beschrijft het verband tussen de concentratie van een stof in oplossing en de hoeveelheid licht die wordt geabsorbeerd:
Waarbij:
De absorptie A is gerelateerd aan de transmissie T (het aandeel doorgelaten licht) via: A = −log(T) = −log(I/I₀), waarbij I₀ de instraalintensiteit is en I de doorgaande intensiteit. Bij A = 1 wordt 90% van het licht geabsorbeerd; bij A = 2 is dat 99%.
De wet is alleen geldig binnen bepaalde concentratiegrenzen. Bij te hoge concentraties treden afwijkingen op door moleculaire interacties. Een ijklijn (kalibratiecurve) over het lineaire bereik is daarom altijd noodzakelijk.
Een fotometrische meting verloopt in de volgende stappen:
De keuze van het instrument hangt af van de vereiste nauwkeurigheid, het golflengtebereik en de toepassing:
Een colorimeter is de eenvoudigste uitvoering: een vaste lichtbron, een kleurfilter dat de gewenste golflengte doorlaat, een cuvethouder en een detector. Een spectrofotometer beschikt over een monochromator (prisma of tralie) waarmee elke gewenste golflengte nauwkeurig in te stellen is en een volledig absorptiespectrum opgenomen kan worden.
De cuvet is de houder voor de te meten oplossing. De weglengte is doorgaans 1 cm (standaard), maar ook 0,5 cm, 2 cm en 5 cm cuvetten zijn beschikbaar voor resp. geconcentreerde of verdunde monsters. Het materiaal bepaalt het bruikbare golflengtebereik:
Cuvetten moeten schoon, krasvrij en aan de buitenkant droog zijn. Vingerafdrukken op de optische vlakken verstoren de meting.
Veel stoffen absorberen zelf weinig of geen zichtbaar licht. Om ze toch colorimetrisch te kunnen bepalen, wordt een kleurreactie uitgevoerd: een selectief reagens reageert met de te bepalen stof en vormt een gekleurd product dat wel sterk absorbeert. De golflengte van maximale absorptie (λmax) van dit product is de meetgolflengte.
Voorbeelden van veelgebruikte colorimetrische bepalingen:
Een betrouwbare fotometrische of colorimetrische bepaling vereist een ijklijn (kalibratiecurve): een reeks standaardoplossingen met bekende concentraties wordt onder identieke omstandigheden gemeten. De absorptiewaarden worden uitgezet tegen de concentraties. In het lineaire bereik van de wet van Lambert-Beer levert dit een rechte lijn door de oorsprong. De concentratie van het onbekende monster wordt hieruit afgelezen of berekend via regressie.
Aandachtspunten bij de ijklijn:
Fotometrische en colorimetrische bepalingen zijn de ruggengraat van de wateranalyse. Fosfaat, nitraat, ammonium, COD, chlor, ijzer en mangaan worden routinematig bepaald via kleurreacties en absorptiemeting. Normmethoden (NEN, ISO, APHA Standard Methods) schrijven exact voor welk reagens, welke golflengte en welk concentratiebereik van toepassing zijn. Compacte fotometers met voorgeprogrammeerde methoden zijn hiervoor in gebruik bij drinkwaterbedrijven, gemeentelijke laboratoria en industrie.
Eiwitbepalingen (Bradford, BCA, Lowry), DNA/RNA-kwantificatie bij 260 nm, enzymactiviteitmetingen en ELISA-uitlezing zijn vrijwel allemaal gebaseerd op absorptiemeting. De microplaatlezer (plate reader) maakt het mogelijk tientallen tot honderden monsters tegelijk te meten in 96- of 384-wells platen.
Kleurmeting (colorimetrie in de CIE-zin) voor kleurconsistentie van producten, maar ook analytische colorimetrie voor gehaltebepalingen van suikers, vitamines, conserveermiddelen en kleurstoffen.
UV/VIS-spectrofotometrie is een referentiemethode in de Europese Farmacopee (Ph. Eur.) voor identiteits- en zuiverheidscontrole van werkzame stoffen. De extinctiecoëfficiënt (E¹%₁cm) is voor veel farmaceutische stoffen gestandaardiseerd.
Colorimetrische bepalingen zijn uitstekend geschikt voor het laboratoriumonderwijs: de kleurreactie is visueel waarneembaar, de meetmethode is begrijpelijk en de apparatuur is toegankelijk. Bepalingen van fosfaat in water, glucose of vitamine C zijn gangbare practica op mbo- en hbo-niveau.
Labvakhandel levert UV/VIS-spectrofotometers, colorimeters, cuvetten en kleurreagentia voor fotometrische en colorimetrische bepalingen in professionele laboratoria en het onderwijs. Bekijk het assortiment spectrofotometers of neem contact op voor advies.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
