Fotometrie en colorimetrie zijn analytische technieken waarbij de concentratie van een stof wordt bepaald aan de hand van de mate waarin een oplossing licht absorbeert. Ze behoren tot de meest toegepaste methoden in het laboratorium: snel, nauwkeurig en geschikt voor een breed scala aan stoffen — van fosfaat en nitraat in water tot eiwitten in biologische monsters en kleurstoffen in levensmiddelen. De basis van beide technieken is de wet van Lambert-Beer.
Fotometrie is het meten van de intensiteit van licht dat door een oplossing wordt geabsorbeerd of doorgelaten. In de analytische chemie gaat het specifiek om absorptiefotometrie: het bepalen van de concentratie van een stof op basis van de hoeveelheid licht die de oplossing absorbeert bij een specifieke golflengte.
Afhankelijk van het gebruikte golflengtebereik spreekt men van:
Colorimetrie is een specifieke vorm van fotometrie waarbij de meting plaatsvindt in het zichtbare bereik (400–700 nm), op basis van de kleur van een oplossing. De term wordt in twee contexten gebruikt:
In dit artikel gaat het over analytische colorimetrie. Het onderscheid met fotometrie is gradueel: colorimetrie werkt altijd met zichtbaar licht en een gekleurde oplossing; fotometrie is de bredere term die ook UV en IR omvat.
Fotometrie is de overkoepelende term voor alle absorptiemetingen op basis van licht, inclusief UV en infrarood. Colorimetrie is een deelverzameling: zij werkt uitsluitend met zichtbaar licht (400–700 nm) en vereist altijd een gekleurde oplossing — hetzij van nature, hetzij na een kleurreactie met een reagens. In de praktijk worden de termen door elkaar gebruikt wanneer het gaat om metingen in het zichtbare bereik, maar formeel is elke colorimetrie fotometrie, terwijl niet elke fotometrie colorimetrie is. Een spectrofotometer kan beide; een eenvoudige colorimeter met vaste kleurfilters is beperkt tot het zichtbare bereik.
Colorimetrisch is het bijvoeglijk naamwoord dat aangeeft dat iets betrekking heeft op of gemeten wordt via colorimetrie. Een colorimetrische bepaling is een kwantitatieve analysemethode waarbij de concentratie van een stof wordt afgeleid uit de kleurintensiteit van een oplossing, gemeten met een colorimeter of spectrofotometer in het zichtbare bereik. Een colorimetrische test of colorimetrische analyse zijn synoniemen voor dezelfde werkwijze. In een bredere betekenis — buiten de analytische chemie — verwijst colorimetrisch naar alles wat met kleurmeting te maken heeft, zoals colorimetrische kleurcontrole in de industrie via CIE-kleurruimtes. In laboratoriumcontext heeft de term vrijwel altijd de analytische betekenis: concentratiebepaling via absorptie van zichtbaar licht.
Het theoretische fundament van zowel fotometrie als colorimetrie is de wet van Lambert-Beer (ook: Beer-Lambert wet). Deze wet beschrijft het verband tussen de concentratie van een stof in oplossing en de hoeveelheid licht die wordt geabsorbeerd:
Waarbij:
De absorptie A is gerelateerd aan de transmissie T (het aandeel doorgelaten licht) via: A = −log(T) = −log(I/I₀), waarbij I₀ de instraalintensiteit is en I de doorgaande intensiteit. Bij A = 1 wordt 90% van het licht geabsorbeerd; bij A = 2 is dat 99%.
De wet is alleen geldig binnen bepaalde concentratiegrenzen. Bij te hoge concentraties treden afwijkingen op door moleculaire interacties. Een ijklijn (kalibratiecurve) over het lineaire bereik is daarom altijd noodzakelijk.
De wet van Lambert-Beer is historisch de samenvoeging van twee afzonderlijk geformuleerde wetten:
Samen geformuleerd geven zij de bekende wet van Lambert-Beer: A = ε × c × l. In de praktijk spreekt men in het laboratorium van "de wet van Lambert-Beer" of kortweg "Beer's law"; de term "twee wetten van de colorimeter" verwijst naar precies deze twee afzonderlijke verbanden. Beide wetten gelden alleen wanneer het licht monochromatisch is, de oplossing optisch helder is en de concentratie niet te hoog (geen moleculaire interacties).
Transmissie (T) is het aandeel licht dat een oplossing ongehinderd passeert, uitgedrukt als breuk (0–1) of percentage (0–100 %). Een transmissie van 100 % betekent dat er geen licht wordt geabsorbeerd; bij 10 % komt slechts een tiende van het invallende licht door. Absorptie (A), ook wel extinctie of optische dichtheid genoemd, is de negatieve logaritme van de transmissie: A = −log(T). Dit maakt absorptie lineair met de concentratie (wet van Lambert-Beer), terwijl transmissie dat niet is. In de praktijk werkt men daarom altijd met absorptiewaarden voor kwantificatie. De omrekening is eenvoudig: T = 10−A, dus A = 0,3 correspondeert met T ≈ 50 % en A = 1,0 met T = 10 %.
De extinctiecoëfficiënt (symbool: ε, uitgesproken als epsilon) is een stofspecifieke constante die aangeeft hoe sterk een stof licht absorbeert bij een bepaalde golflengte. De eenheid is L·mol⁻¹·cm⁻¹. Een hoge extinctiecoëfficiënt betekent dat al een kleine hoeveelheid stof veel licht absorbeert — de methode is dan zeer gevoelig. Zo heeft NADH bij 340 nm een ε van ca. 6220 L·mol⁻¹·cm⁻¹, en hemoglobine bij 415 nm (de Soret-band) een ε van ruim 120 000 L·mol⁻¹·cm⁻¹. In de farmacopee wordt ook de specifieke extinctiecoëfficiënt E¹%₁cm gebruikt: de absorptie van een 1 %-oplossing in een 1 cm cuvet. Kennis van de extinctiecoëfficiënt maakt het mogelijk concentraties direct uit een absorptiemeting te berekenen, zonder ijklijn — mits de stof zuiver is en de extinctiecoëfficiënt betrouwbaar bekend is.
Optische dichtheid (OD) is een synoniem voor absorptie of extinctie en wordt met name in de microbiologie en biochemie gebruikt. De waarde is identiek aan de absorptiewaarde A uit de Lambert-Beer vergelijking. OD600 is de optische dichtheid gemeten bij 600 nm en is de standaardparameter voor het volgen van bacteriële groei in vloeistofcultuur: bij deze golflengte absorberen bacteriën zelf nauwelijks, maar verstrooien zij licht, waardoor de OD toeneemt naarmate er meer cellen aanwezig zijn. Een OD600 van 0,1–0,2 correspondeert doorgaans met de vroege exponentiële groeifase; een waarde boven 0,8–1,0 kan buiten het lineaire bereik vallen en vereist verdunning voor nauwkeurige kwantificatie. OD600-metingen zijn niet absoluut: de relatie tussen OD600 en celconcentratie (cellen/mL) verschilt per bacteriesoort, groeicondities en fotometer.
In principe meet je altijd bij of nabij de λmax: de golflengte van maximale absorptie van het te bepalen systeem. Op λmax is de gevoeligheid het grootst (steilste ijklijn) en zijn kleine afwijkingen in de ingestelde golflengte het minst storend (de absorptiecurve is er relatief vlak). De λmax van een kleurreactieproduct staat vermeld in de methodespecificatie of is te bepalen door een absorptiespectrum op te nemen. Als vuistregel geldt: de meetgolflengte is de complementaire kleur van de oplossingskleur — een blauwe oplossing absorbeert het sterkst in het rood (ca. 600–700 nm), een gele oplossing in het violet/blauw (ca. 400–450 nm).
Een fotometrische meting verloopt in de volgende stappen:
Een blanco (ook: referentie of reagens-blanco) is een oplossing die identiek is bereid als het monster — inclusief alle toegevoegde reagentia, oplosmiddelen en buffers — maar zonder de te bepalen stof. Door de blanco als referentie in te stellen (absorptie = 0, transmissie = 100 %) wordt de achtergrondabsorptie van het reagens zelf, het oplosmiddel en de cuvet volledig gecorrigeerd. Zonder blanco meet u de absorptie van alles in de cuvet — niet alleen de analyt. Bij kleurreacties is de blanco onmisbaar: veel reagentia zijn zelf niet kleurloos en geven anders een systematische overschatting van de concentratie. De blanco wordt bij elke meetreeks opnieuw ingesteld, ook als hetzelfde reagens wordt gebruikt, omdat lichtbronintensiteit en reagenskleur kunnen variëren.
De keuze van het instrument hangt af van de vereiste nauwkeurigheid, het golflengtebereik en de toepassing:
Een colorimeter werkt met vaste kleurfilters: een set van vier tot acht filters laat elk een smalle golflengtebrug door, afgestemd op de meest gangbare kleurreacties. Dit maakt colorimeters goedkoop, robuust en geschikt voor routinematige bepalingen in het veld of op school, maar beperkt ze tot de beschikbare filters. Een spectrofotometer beschikt over een monochromator — een prisma of optisch tralie — waarmee élke golflengte tussen doorgaans 190 en 900 nm continu en nauwkeurig in te stellen is. Zie ook het kennisbankartikel de spectrofotometer als apparaat voor een uitgebreide toelichting op instrumenttypen, monochromator, cuvetten en kalibratie. Hierdoor kan een spectrofotometer ook een volledig absorptiespectrum opnemen, de λmax van een onbekend systeem bepalen en UV-metingen uitvoeren, wat met een colorimeter onmogelijk is. Voor veeleisend onderzoek, validatie van methoden of UV-toepassingen (DNA, eiwit bij 280 nm) is een spectrofotometer onmisbaar; voor vaste routinebepalingen in wateranalyse of onderwijs volstaat een colorimeter.
De cuvet is de houder voor de te meten oplossing. De weglengte is doorgaans 1 cm (standaard), maar ook 0,5 cm, 2 cm en 5 cm cuvetten zijn beschikbaar voor resp. geconcentreerde of verdunde monsters. Het materiaal bepaalt het bruikbare golflengtebereik:
Cuvetten moeten schoon, krasvrij en aan de buitenkant droog zijn. Vingerafdrukken op de optische vlakken verstoren de meting.
Veel stoffen absorberen zelf weinig of geen zichtbaar licht. Om ze toch colorimetrisch te kunnen bepalen, wordt een kleurreactie uitgevoerd: een selectief reagens reageert met de te bepalen stof en vormt een gekleurd product dat wel sterk absorbeert. De golflengte van maximale absorptie (λmax) van dit product is de meetgolflengte.
Voorbeelden van veelgebruikte colorimetrische bepalingen:
De Bradford-assay is een veelgebruikte colorimetrische methode om de totale eiwitconcentratie in een oplossing te bepalen. Het principe berust op de binding van de kleurstof Coomassie Brilliant Blue G-250 aan basische en hydrofobe aminozuurresiduen in eiwitten. In ongebonden vorm is de kleurstof roodbruin (absorptie bij ca. 470 nm); na binding aan eiwit verschuift de absorptie naar 595 nm (blauw). De toename in absorptie bij 595 nm is evenredig met de eiwitconcentratie. De methode is snel (incubatie 5–10 min), gevoelig (werkbereik ca. 1–1500 μg/mL afhankelijk van de uitvoering) en breed inzetbaar. Nadeel: de respons is eiwitafhankelijk — verschillende eiwitten geven bij dezelfde concentratie een verschillende absorptie, afhankelijk van hun aminozuursamenstelling. Als standaard wordt doorgaans BSA (runderserumalbumine) gebruikt. Voor eiwitten met een afwijkende aminozuursamenstelling kan de BCA-assay een betere keuze zijn. Voor een uitgebreide vergelijking van Bradford, BCA en directe UV-absorptie zie het artikel eiwitkwantificering: Bradford, BCA en A280 vergeleken.
De BCA-assay (bicinchoninic acid assay) is een alternatieve colorimetrische methode voor eiwitbepaling. In twee stappen: eerst reduceren eiwitten Cu²⁺-ionen tot Cu⁺ (Biuret-reactie); vervolgens reageren twee BCA-moleculen met één Cu⁺-ion tot een intens paars-rood complex met absorptiemax bij 562 nm. De kleurintensiteit is evenredig met de hoeveelheid gereduceerd koper en daarmee met de eiwitconcentratie. Voordelen ten opzichte van Bradford: minder gevoelig voor detergentia (SDS-compatibel) en een consistentere respons tussen verschillende eiwitten. Nadelen: de reactie is temperatuurafhankelijk (55 °C incubatie voor standaard BCA) en gevoelig voor reducerende stoffen zoals DTT en β-mercaptoethanol. Het werkbereik bedraagt ca. 20–2000 μg/mL (standaard) of 0,5–10 μg/mL (micro-BCA).
Een betrouwbare fotometrische of colorimetrische bepaling vereist een ijklijn (kalibratiecurve): een reeks standaardoplossingen met bekende concentraties wordt onder identieke omstandigheden gemeten. De absorptiewaarden worden uitgezet tegen de concentraties. In het lineaire bereik van de wet van Lambert-Beer levert dit een rechte lijn door de oorsprong. De concentratie van het onbekende monster wordt hieruit afgelezen of berekend via regressie.
Een correcte ijklijn vergt enige voorbereiding:
Aandachtspunten bij de ijklijn:
Fotometrische en colorimetrische bepalingen zijn de ruggengraat van de wateranalyse. Fosfaat, nitraat, ammonium, COD, chlor, ijzer en mangaan worden routinematig bepaald via kleurreacties en absorptiemeting. Normmethoden (NEN, ISO, APHA Standard Methods) schrijven exact voor welk reagens, welke golflengte en welk concentratiebereik van toepassing zijn. Compacte fotometers met voorgeprogrammeerde methoden zijn hiervoor in gebruik bij drinkwaterbedrijven, gemeentelijke laboratoria en industrie. Voor de bepaling van metalen en spoorelementen in watermonsters — waarbij fotometrie onvoldoende gevoelig is — is ICP-OES of ICP-MS de aangewezen techniek.
Eiwitbepalingen (Bradford, BCA, Lowry), DNA/RNA-kwantificatie bij 260 nm, enzymactiviteitmetingen en ELISA-uitlezing zijn vrijwel allemaal gebaseerd op absorptiemeting. De microplaatlezer (plate reader) maakt het mogelijk tientallen tot honderden monsters tegelijk te meten in 96- of 384-wells platen.
Kleurmeting (colorimetrie in de CIE-zin) voor kleurconsistentie van producten, maar ook analytische colorimetrie voor gehaltebepalingen van suikers, vitamines, conserveermiddelen en kleurstoffen.
UV/VIS-spectrofotometrie is een referentiemethode in de Europese Farmacopee (Ph. Eur.) voor identiteits- en zuiverheidscontrole van werkzame stoffen. De extinctiecoëfficiënt (E¹%₁cm) is voor veel farmaceutische stoffen gestandaardiseerd.
Colorimetrische bepalingen zijn uitstekend geschikt voor het laboratoriumonderwijs: de kleurreactie is visueel waarneembaar, de meetmethode is begrijpelijk en de apparatuur is toegankelijk. Bepalingen van fosfaat in water, glucose of vitamine C zijn gangbare practica op mbo- en hbo-niveau. De volledige klassieke uitvoering voor drinkwater- en afvalwatermonsters is uitgewerkt in het artikel nitraat- en fosfaatbepaling in water (klassiek).
Veel kleurreacties in de colorimetrie maken gebruik van stoffen die ook in het dagelijks leven onder een triviale naam bekend zijn. Kopersulfaat (de blauwe Cu²⁺-bron) staat van oudsher bekend als "blauwe vitriool", en ijzersulfaat als "groene vitriool" — beide veelgebruikt als kleurreagens of redoxtitrant in klassieke bepalingen. In ons artikel over bekende chemicaliën, triviale namen en E-nummers vind je een overzicht van deze en andere stoffen met hun systematische namen, formules, E-nummers en alledaagse toepassingen.
Labvakhandel levert UV/VIS-spectrofotometers, colorimeters, cuvetten en kleurreagentia voor fotometrische en colorimetrische bepalingen of neem contact op voor advies.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
