UV/Vis-spectrofotometrie

UV/Vis-spectrofotometrie is een van de meest gebruikte analysemethoden in het laboratorium. De techniek meet de hoeveelheid licht die een oplossing absorbeert bij een bepaalde golflengte in het ultraviolette (200–400 nm) of zichtbare (400–800 nm) spectrum. Op basis van de Beer-Lambert wet is de absorptie direct evenredig met de concentratie van de lichtabsorberende stof, waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is. UV/Vis wordt ingezet voor eiwitbepaling, DNA/RNA-kwantificering, enzymkinetiek, kleurstofanalyse, kwaliteitscontrole van farmaceutica en milieumonitoring.

Principe en de Beer-Lambert wet

Wanneer licht door een oplossing gaat, wordt een deel geabsorbeerd door de opgeloste stof. De hoeveelheid geabsorbeerd licht wordt uitgedrukt als absorptie (A, ook absorbantie of extinctie):

A = log(I₀ / I) = ε · c · l

Hierin is I₀ de intensiteit van het invallende licht, I de intensiteit na doorgang, ε de molaire extinctiecoëfficiënt (l·mol⁻¹·cm⁻¹), c de concentratie (mol/l) en l de lichtpadlengte (cm). De wet is geldig bij lage concentraties (lineair bereik, typisch A = 0,1–1,5) en bij gebruik van monochromatisch licht.

Het UV/Vis-absorptiespectrum uitgelegd

Wat is een absorptiespectrum?

Een absorptiespectrum is een grafiek waarbij de absorptie (A) wordt uitgezet als functie van de golflengte (λ in nm). Het spectrum toont bij welke golflengten een stof licht absorbeert en hoe sterk. Drie kenmerken zijn analytisch het meest relevant:

• λmax (absorptiemaximum) — de golflengte waarop de absorptie het hoogst is. Metingen worden altijd bij λmax uitgevoerd voor maximale gevoeligheid en de beste lineariteit van Beer-Lambert. λmax is karakteristiek voor een verbinding en dient als identificatie­kenmerk.
• Molaire extinctie­coëfficiënt (ε) bij λmax — hoe hoger ε, hoe gevoeliger de methode. Voorbeeld: NADH bij 340 nm heeft ε = 6220 l·mol⁻¹·cm⁻¹; haemoglobine bij 415 nm (Soret-band) heeft ε > 100.000.
• Spectrumvorm — brede, vlakke absorptie­banden zijn typisch voor UV/Vis; smalle, scherpe pieken zijn zeldzaam (gasspectra). Overlappende banden wijzen op meerdere chromoforen of verontreinigingen.

Hoe lees je UV/Vis-resultaten af?

1. Controleer de basislijn (blanco) — de absorptie van de blanco (oplosmiddel zonder analyt) moet bij alle golflengten nul of vlak zijn. Een niet-vlakke basislijn wijst op verontreinigde cuvet, troebelheid of lamp­drift.
2. Identificeer λmax — het absorptie­maximum in het spectrum. Vergelijk met de literatuur­waarde voor uw stof. Afwijking van meer dan 5–10 nm wijst op verontreiniging of pH-effect.
3. Lees A af bij λmax — de absorptie­waarde bij het maximum. Optimaal bereik: A = 0,1–1,0 voor de beste nauwkeurigheid. Boven A = 1,5 verdunnen.
4. Bereken concentratie — via Beer-Lambert: c = A / (ε × l) of via een kalibratie­lijn met bekende standaarden.
5. Controleer A260/A280 bij DNA/RNA — verhouding 1,8–2,0 = zuiver DNA/RNA; lager = eiwit­verontreiniging; controleer ook A260/A230 (> 2,0 = geen organische verontreinigingen).

De vier spectrale verschuivingen in UV-spectroscopie

Veranderingen in moleculaire structuur, oplosmiddel of pH kunnen het absorptie­spectrum verschuiven. Vier typen worden onderscheiden:

Opbouw van een spectrofotometer

Lichtbron

Voor het UV-gebied (200–400 nm) wordt een deuteriumlamp (D₂) gebruikt. Voor het zichtbare gebied (400–800 nm) dient een wolframhalogeen- of wolframlamp. Moderne full-spectrum instrumenten combineren beide lampen met een automatische omschakeling rond 350 nm.

Monochromator

Een tralie (diffractierooster) of prisma splitst het polychromatische licht in zijn golflengtecomponenten. Een spleet selecteert de gewenste golflengte met een bandbreedte van typisch 1–5 nm. Diode-array-detectoren (DAD) meten het volledige spectrum simultaan zonder bewegende delen.

Cuvet

De cuvet bevat het monster en definieert de lichtpadlengte. Standaard wordt een padlengte van 1 cm gebruikt. Cuvetten zijn verkrijgbaar in kwartsglas (transparant tot 190 nm, geschikt voor UV en Vis), optisch glas (enkel Vis, goedkoper), en kunststof (PMMA of PS, enkel Vis, disposable). Bij microvolumebepaling (DNA, eiwitten) worden nano-drop-systemen gebruikt die slechts 1–2 µl monster vereisen.

Detector

Een fotodiode of fotonvermenigvuldiger (PMT) zet het doorgelaten licht om in een elektrisch signaal. Het signaal wordt vergeleken met een referentiestraal (bij dubbelstraalspectrofotometers) om driftcorrectie toe te passen.

Instrumenttypen en terminologie uitgelegd

Spectroscopie, spectrometrie of spectrofotometrie?

De drie termen worden door elkaar gebruikt maar hebben een subtiel verschil:

In de praktijk worden "UV/Vis-spectroscopie" en "UV/Vis-spectrofoto­metrie" door elkaar gebruikt voor dezelfde techniek. In analytisch-chemische context is "spectrofotometrie" de meest precieze term.

Enkelbalk vs. dubbelbalk spectrofotometer

Dit zijn de twee hoofdtypen UV/Vis- spectrofotometers:

Spectrofotometer vs. colorimeter vs. fotometer

Toepassingen

Eiwitbepaling

Eiwitten absorberen bij 280 nm dankzij de aromatische aminozuren tryptofaan en tyrosine. De extinctiecoëfficiënt bij 280 nm is eiwitspecifiek en kan worden berekend uit de aminozuursamenstelling (Pace-methode). Alternatieve methoden zijn de Bradford-test (Coomassie blauw, 595 nm), de BCA-test (bicinchoninezuur, 562 nm) en de Lowry-methode (750 nm).

DNA en RNA kwantificering

Nucleïnezuren absorberen sterk bij 260 nm door de aromatische bases. De verhouding A260/A280 geeft een indicatie van de zuiverheid: een waarde van 1,8–2,0 duidt op zuiver DNA of RNA respectievelijk. Een verhouding A260/A230 > 2,0 wijst op afwezigheid van organische verontreinigingen (fenol, EDTA).

Enzymkinetiek

Enzymatische reacties worden gevolgd via de tijdsafhankelijke verandering van absorptie. Een klassiek voorbeeld is de NADH/NAD⁺-koppeling bij 340 nm (ε = 6220 l·mol⁻¹·cm⁻¹). Kinetische parameters (Km, Vmax) worden bepaald door absorptieverandering per tijdseenheid te meten bij variabele substraatconcentraties.

Farmaceutische kwaliteitscontrole

UV/Vis is de meest gebruikte detectiemethode voor gehaltebepalingen van geneesmiddelen conform farmacopee (Ph.Eur., USP). Diverse monografieën schrijven UV-absorptie voor als identiteitstest en gehaltemeting. Bij afwezigheid van een geschikt chromofoor wordt derivatisering of koppeling met HPLC toegepast.

Milieuanalyse

Nitraat absorbeert bij 220 nm en wordt bepaald via directe UV-meting in watermonsters (ISO 7890). De kwaliteit van het gebruikte water is daarbij relevant: calcium- en magnesiumionen kunnen bij bepaalde fotometrische methoden storen. Lees meer over waterhardheid bepalen voor de achtergrond.

Chemisch zuurstofverbruik (CZV), fosfaat en ammonium worden bepaald via gekleurde reactieproducten in gestandaardiseerde fotometrische methoden (cuvettentesten). Voor de kwantitatieve bepaling van totaal stikstof (TKN) in watermonsters wordt daarnaast de Kjeldahl-methode ingezet — zie ons artikel over stikstofbepaling in het laboratorium.

Cuvetten: typen en keuze

Voordelen en beperkingen

Gerelateerde technieken

Voor structuuridentificatie van organische verbindingen biedt FTIR-spectroscopie complementaire informatie over functionele groepen. Wanneer elementspecifieke analyse noodzakelijk is, zijn atoomabsorptiespectroscopie (AAS) en ICP-MS/ICP-OES de aangewezen methoden. Voor structuuropheldering van complexe organische moleculen is NMR-spectroscopie onmisbaar.

Voor de analyse van de elementsamenstelling van vaste monsters zonder oplossen of destructie is XRF (röntgenfluorescentiespectrometrie) de aangewezen methode. Waar UV/Vis moleculen in oplossing meet via absorptie van licht door chemische bindingen, meet XRF de karakteristieke fluorescentiestraling van atomen in vaste matrices — twee complementaire benaderingen van hetzelfde analytische doel.

Voor de toepassing van UV/Vis in analytische bepalingen via kleurreacties en ijklijnen, zie ons artikel over fotometrische en colorimetrische bepalingen.

Veelgestelde vragen

Wanneer gebruik ik een kwartscuvet versus een kunststof cuvet?

Gebruik een kwartscuvet wanneer metingen onder 320 nm vereist zijn (UV-gebied) of wanneer het monster organische oplosmiddelen bevat die kunststof aantasten. Kunststof disposable cuvetten zijn geschikt voor routinemetingen in het zichtbare gebied (320–900 nm) en zijn kostenefficiënt bij grote series. Bewaar kwartscuvetten altijd gevuld met demiwater of leeg na reiniging om beschadiging van de optische vlakken te voorkomen.

Mijn absorptiewaarden zijn niet lineair met concentratie — wat is de oorzaak?

Afwijking van Beer-Lambert treedt op bij A > 1,5 (te hoge concentratie), bij gebruik van polychromatisch licht (te brede spleetbreedte), bij troebelheid of lichtverstrooiing in het monster, bij associatie of dissociatie van de stof als functie van concentratie, of bij verontreiniging van de cuvet. Verdun het monster tot A = 0,1–0,8 voor optimale lineariteit.

Waarom is een blanco nodig bij spectrofotometrie?

Een blanco (ook: nulmonster of referentie­monster) is een oplossing die alle componenten bevat behalve de te meten stof. De blanco corrigeert voor:

• Absorptie door het oplosmiddel — water, buffers en organische oplosmiddelen absorberen zelf licht, met name in het UV-gebied. Door de blanco als nulpunt in te stellen wordt alleen de absorptie van de analyt gemeten.
• Absorptie door reagentia — bij kleurreacties (Bradford, BCA, Lowry) absorberen de reagentia zelf ook licht. De blanco bevat alle reagentia maar geen eiwit.
• Cuvetvervuiling — vlekken of krassen op de cuvet geven een extra bijdrage aan de absorptie. Door dezelfde cuvet voor blanco en monster te gebruiken wordt dit geëlimineerd.
• Lamp­drift — bij enkelbalk­spectrofotometers kan de lamp­intensiteit variëren. Door vóór elke meting een blanco op te nemen wordt drift gecorrigeerd.

Praktische regel: gebruik altijd dezelfde cuvet voor blanco en monster, of gebruik een matched cuvet­set. Bij cuvetten­tests (disposable cuvetten) hoort de blanco in een cuvet van dezelfde productie­batch.

Hoe gebruik je een UV-spectrofotometer stap voor stap?

1. Opwarmen — schakel het instrument minimaal 15–30 minuten voor de meting in. De deuterium- en wolframlamp moeten stabiel zijn voordat betrouwbare metingen mogelijk zijn.
2. Kies de golflengte — stel λmax in voor uw stof (zie literatuur of bepaal vooraf via spectrum­scan). Meet altijd bij λmax voor optimale gevoeligheid.
3. Cuvet voorbereiden — reinig de cuvet met gedestilleerd water en droog de buitenzijde met lenspapier. Vul met blanco (oplosmiddel of reagens­blanco). Zorg dat er geen luchtbellen zijn.
4. Nul instellen (blank) — plaats de cuvet met blanco in de cuvethouder en druk op "Zero" of "Autonul". De absorptie wordt op 0,000 gezet.
5. Meting monster — verwijder de blanco, vul dezelfde cuvet met het monster (of gebruik een matched cuvet) en lees de absorptie af. Optimale waarde: A = 0,1–1,0.
6. Concentratie berekenen — gebruik Beer-Lambert (c = A / (ε × l)) of lees af van een vooraf opgestelde kalibratie­lijn.

Veelvoorkomende problemen met UV-spectrofotometers en oplossingen

Deze pagina is onderdeel van de Labvakhandel kennisbank. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties.