UV/Vis-spectrofotometrie is een van de meest gebruikte analysemethoden in het laboratorium. De techniek meet de hoeveelheid licht die een oplossing absorbeert bij een bepaalde golflengte in het ultraviolette (200–400 nm) of zichtbare (400–800 nm) spectrum. Op basis van de Beer-Lambert wet is de absorptie direct evenredig met de concentratie van de lichtabsorberende stof, waardoor nauwkeurige kwantificering mogelijk is. UV/Vis wordt ingezet voor eiwitbepaling, DNA/RNA-kwantificering, enzymkinetiek, kleurstofanalyse, kwaliteitscontrole van farmaceutica en milieumonitoring.
Wanneer licht door een oplossing gaat, wordt een deel geabsorbeerd door de opgeloste stof. De hoeveelheid geabsorbeerd licht wordt uitgedrukt als absorptie (A, ook absorbantie of extinctie):
A = log(I₀ / I) = ε · c · l
Hierin is I₀ de intensiteit van het invallende licht, I de intensiteit na doorgang, ε de molaire extinctiecoëfficiënt (l·mol⁻¹·cm⁻¹), c de concentratie (mol/l) en l de lichtpadlengte (cm). De wet is geldig bij lage concentraties (lineair bereik, typisch A = 0,1–1,5) en bij gebruik van monochromatisch licht.
De logaritmische propagatieregel die beschrijft hoe een absorbantie-onzekerheid ΔA via A = ε · c · l doorwerkt in een concentratie-onzekerheid Δc, is uitgelegd in het artikel over foutenpropagatie in het laboratorium.
Absorptie (A) en transmissie (T) beschrijven dezelfde meting vanuit twee verschillende invalshoeken. Transmissie is het percentage licht dat door het monster heen komt: T = I/I₀, vaak uitgedrukt als %T. Absorptie is de logaritmische tegenhanger: A = −log(T). Bij 100 %T wordt geen licht geabsorbeerd (A = 0); bij 10 %T wordt 90 % van het licht geabsorbeerd, wat overeenkomt met A = 1. Het belangrijkste praktische verschil is dat absorptie, in tegenstelling tot transmissie, lineair evenredig is met de concentratie volgens de Beer-Lambert wet. Daarom wordt voor kwantificering altijd met absorptiewaarden gerekend, terwijl transmissie vaker wordt gebruikt voor visuele beoordeling van de lichtdoorlaatbaarheid van een monster of materiaal.
Een absorptiespectrum is een grafiek waarbij de absorptie (A) wordt uitgezet als functie van de golflengte (λ in nm). Het spectrum toont bij welke golflengten een stof licht absorbeert en hoe sterk. Drie kenmerken zijn analytisch het meest relevant:
UV (ultraviolet, 200–400 nm) en Vis (zichtbaar licht, 400–800 nm) zijn twee aangrenzende delen van het elektromagnetisch spectrum die in één instrument worden gecombineerd. Het onderscheid is relevant voor zowel de chemie als de instrumentatie. Chemisch gezien absorberen verbindingen zonder uitgebreide conjugatie of zonder kleur — zoals de meeste eiwitten, nucleïnezuren en aromatische verbindingen — vrijwel uitsluitend in het UV-gebied en zijn ze met het blote oog kleurloos. Gekleurde oplossingen, zoals metaalcomplexen of kleurstoffen, absorberen in het zichtbare gebied en zijn daardoor wél met het oog waarneembaar. Instrumenteel vereist het UV-gebied een aparte lichtbron (deuteriumlamp) en kwartsoptiek, omdat gewoon glas en kunststof onder ongeveer 320 nm niet transparant zijn; het Vis-gebied kan met een eenvoudigere wolframlamp en goedkopere optiek worden gemeten. Zie de paragraaf over de lichtbron hieronder voor de technische achtergrond.
Veranderingen in moleculaire structuur, oplosmiddel of pH kunnen het absorptiespectrum verschuiven. Vier typen worden onderscheiden:
Voor het UV-gebied (200–400 nm) wordt een deuteriumlamp (D₂) gebruikt. Voor een uitgebreid overzicht van de instrumentopbouw, lichtbronnen, detectortypen en kalibratie zie het kennisbankartikel de spectrofotometer als apparaat. Voor het zichtbare gebied (400–800 nm) dient een wolframhalogeen- of wolframlamp. Moderne full-spectrum instrumenten combineren beide lampen met een automatische omschakeling rond 350 nm.
De deuteriumlamp in een spectrofotometer zendt UV-straling uit die bij directe, onbeschermde blootstelling schadelijk is voor ogen en huid: kortdurende blootstelling kan fotokeratitis (een pijnlijke, tijdelijke beschadiging van het hoornvlies, vergelijkbaar met "lasogen") veroorzaken, en herhaalde blootstelling verhoogt op termijn het risico op cataract. In de normale, gesloten meetcompartimenten van een spectrofotometer is dit risico minimaal, omdat de lichtbron tijdens de meting volledig is afgeschermd van de gebruiker. Het risico ontstaat wanneer tijdens onderhoud, lampvervanging of justering de behuizing wordt geopend terwijl de lamp brandt. Schakel de lamp altijd uit voordat de lampbehuizing wordt geopend, en draag een UV-bril met voldoende afscherming wanneer dit om technische redenen niet mogelijk is.
Een tralie (diffractierooster) of prisma splitst het polychromatische licht in zijn golflengtecomponenten. Een spleet selecteert de gewenste golflengte met een bandbreedte van typisch 1–5 nm. Diode-array-detectoren (DAD) meten het volledige spectrum simultaan zonder bewegende delen.
De cuvet bevat het monster en definieert de lichtpadlengte. Standaard wordt een padlengte van 1 cm gebruikt. Cuvetten zijn verkrijgbaar in kwartsglas (transparant tot 190 nm, geschikt voor UV en Vis), optisch glas (enkel Vis, goedkoper), en kunststof (PMMA of PS, enkel Vis, disposable). Bij microvolumebepaling (DNA, eiwitten) worden nano-drop-systemen gebruikt die slechts 1–2 µl monster vereisen.
Een fotodiode of fotonvermenigvuldiger (PMT) zet het doorgelaten licht om in een elektrisch signaal. Het signaal wordt vergeleken met een referentiestraal (bij dubbelstraalspectrofotometers) om driftcorrectie toe te passen.
De detectielimiet van UV/Vis hangt sterk af van de molaire extinctiecoëfficiënt van de gemeten stof bij λmax. Voor verbindingen met een sterke chromofoor (ε in de orde van 10.000–100.000 l·mol⁻¹·cm⁻¹), zoals veel kleurstoffen en metaalcomplexen, liggen praktische detectielimieten in de orde van 0,01–0,1 µmol/l. Voor eiwitten gemeten bij 280 nm (ε doorgaans enkele duizenden tot enkele tienduizenden) ligt de detectiegrens typisch rond enkele µg/ml. Verbindingen met een zwakke of afwezige chromofoor zijn met directe UV/Vis-meting nauwelijks detecteerbaar; in die gevallen biedt derivatisering tot een sterker absorberend product, of koppeling met een gevoeligere techniek zoals fluorescentiespectroscopie of massaspectrometrie, een lagere detectielimiet.
De drie termen worden door elkaar gebruikt maar hebben een subtiel verschil:
In de praktijk worden "UV/Vis-spectroscopie" en "UV/Vis-spectrofotometrie" door elkaar gebruikt voor dezelfde techniek. In analytisch-chemische context is "spectrofotometrie" de meest precieze term.
Dit zijn de twee hoofdtypen UV/Vis- spectrofotometers:
Eiwitten absorberen bij 280 nm dankzij de aromatische aminozuren tryptofaan en tyrosine. De extinctiecoëfficiënt bij 280 nm is eiwitspecifiek en kan worden berekend uit de aminozuursamenstelling (Pace-methode). Alternatieve methoden zijn de Bradford-test (Coomassie blauw, 595 nm), de BCA-test (bicinchoninezuur, 562 nm) en de Lowry-methode (750 nm) — een volledige vergelijking van deze methoden staat in eiwitkwantificering: Bradford, BCA en A280 vergeleken. Voor specifieke eiwitten in complexe matrices wordt vaak een ELISA gebruikt, waarbij een UV/Vis-microplaatlezer de enzymatische kleurreactie kwantificeert.
Nucleïnezuren absorberen sterk bij 260 nm door de aromatische bases. De verhouding A260/A280 geeft een indicatie van de zuiverheid: een waarde van 1,8–2,0 duidt op zuiver DNA of RNA respectievelijk. Een verhouding A260/A230 > 2,0 wijst op afwezigheid van organische verontreinigingen (fenol, EDTA).
Voor een uitgebreide toelichting op de A260/A280- en A260/A230-ratio in het kader van RNA-zuiverheidsbeoordeling en de combinatie met RIN-bepaling, zie het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse.
Enzymatische reacties worden gevolgd via de tijdsafhankelijke verandering van absorptie. Een klassiek voorbeeld is de NADH/NAD⁺-koppeling bij 340 nm (ε = 6220 l·mol⁻¹·cm⁻¹). Kinetische parameters (Km, Vmax) worden bepaald door absorptieverandering per tijdseenheid te meten bij variabele substraatconcentraties.
UV/Vis is de meest gebruikte detectiemethode voor gehaltebepalingen van geneesmiddelen conform farmacopee (Ph.Eur., USP). Diverse monografieën schrijven UV-absorptie voor als identiteitstest en gehaltemeting. Bij afwezigheid van een geschikt chromofoor wordt derivatisering of koppeling met HPLC toegepast.
Bij toepassing in titraties spreekt men van spectrofotometrische titratie, waarbij het verloop van absorptie versus toegevoegd titrantvolume het eindpunt aangeeft.
Nitraat absorbeert bij 220 nm en wordt bepaald via directe UV-meting in watermonsters (ISO 7890). De kwaliteit van het gebruikte water is daarbij relevant: calcium- en magnesiumionen kunnen bij bepaalde fotometrische methoden storen. Lees meer over waterhardheid bepalen voor de achtergrond. Voor de volledige natchemische aanpak — inclusief Griess-diazotering en de molybdeenblauw-methode voor fosfaat — zie nitraat- en fosfaatbepaling in water (klassiek).
Chemisch zuurstofverbruik (CZV), fosfaat en ammonium worden bepaald via gekleurde reactieproducten in gestandaardiseerde fotometrische methoden (cuvettentesten). Voor de kwantitatieve bepaling van totaal stikstof (TKN) in watermonsters wordt daarnaast de Kjeldahl-methode ingezet — zie ons artikel over stikstofbepaling in het laboratorium.
Voor structuuridentificatie van organische verbindingen biedt FTIR-spectroscopie complementaire informatie over functionele groepen. Wanneer elementspecifieke analyse noodzakelijk is, zijn atoomabsorptiespectroscopie (AAS) en ICP-MS/ICP-OES de aangewezen methoden; voor de routinebepaling van natrium en kalium via vlam-emissie is vlamfotometrie een eenvoudigere variant. Voor structuuropheldering van complexe organische moleculen is NMR-spectroscopie onmisbaar.
Voor de analyse van de elementsamenstelling van vaste monsters zonder oplossen of destructie is XRF (röntgenfluorescentiespectrometrie) de aangewezen methode. Waar UV/Vis moleculen in oplossing meet via absorptie van licht door chemische bindingen, meet XRF de karakteristieke fluorescentiestraling van atomen in vaste matrices — twee complementaire benaderingen van hetzelfde analytische doel.
Voor de toepassing van UV/Vis in analytische bepalingen via kleurreacties en ijklijnen, zie ons artikel over fotometrische en colorimetrische bepalingen. Voor niet-destructieve moleculaire identificatie via lichtverstrooiing is Raman-spectroscopie een complementaire techniek die ook in waterige omgevingen goed toepasbaar is.
Gebruik een kwartscuvet wanneer metingen onder 320 nm vereist zijn (UV-gebied) of wanneer het monster organische oplosmiddelen bevat die kunststof aantasten. Kunststof disposable cuvetten zijn geschikt voor routinemetingen in het zichtbare gebied (320–900 nm) en zijn kostenefficiënt bij grote series. Bewaar kwartscuvetten altijd gevuld met demiwater of leeg na reiniging om beschadiging van de optische vlakken te voorkomen.
FTIR en UV/Vis meten beide absorptie van licht, maar in een ander deel van het spectrum en op basis van een ander fysisch principe. UV/Vis meet absorptie in het ultraviolette en zichtbare gebied (200–800 nm), veroorzaakt door elektronische overgangen in chromoforen zoals aromatische ringen of geconjugeerde systemen; de techniek is daardoor vooral geschikt voor kwantificering van bekende verbindingen met een chromofoor. FTIR meet absorptie in het infrarode gebied, veroorzaakt door moleculaire trillingen van chemische bindingen, en geeft daarmee een vingerafdruk van functionele groepen die geschikt is voor structuuridentificatie, ook van verbindingen zonder chromofoor. In de praktijk zijn de technieken complementair: UV/Vis voor snelle, gevoelige kwantificering in oplossing; FTIR voor kwalitatieve identificatie en structuurbevestiging van vaste stoffen, vloeistoffen en oplossingen.
Afwijking van Beer-Lambert treedt op bij A > 1,5 (te hoge concentratie), bij gebruik van polychromatisch licht (te brede spleetbreedte), bij troebelheid of lichtverstrooiing in het monster, bij associatie of dissociatie van de stof als functie van concentratie, of bij verontreiniging van de cuvet. Verdun het monster tot A = 0,1–0,8 voor optimale lineariteit. Voor de kwantitatieve meting van troebelheid als eigenschap — in plaats van als storingseffect — zie het kennisbankartikel over turbidimetrie en nephelometrie.
De aanbevolen kalibratiefrequentie hangt af van het gebruiksregime en de toepassing, maar als algemene richtlijn geldt een volledige kalibratie en performancekwalificatie minimaal eenmaal per jaar, aangevuld met dagelijkse of wekelijkse verificatie bij intensief gebruik. Een volledige kalibratie omvat doorgaans de controle van de golflengtenauwkeurigheid (met een holmiumoxide- of didymiumfilter), de fotometrische nauwkeurigheid (met gecertificeerde neutrale-dichtheidsfilters), het strooilicht en de basislijnruis. In gereguleerde omgevingen (farmacopee, ISO 17025) ligt de frequentie en de te volgen procedure vast in het kwaliteitssysteem en wordt elke kalibratie gedocumenteerd. Tussen de formele kalibraties door is een eenvoudige dagelijkse controle met een bekende standaard of referentiemateriaal een aan te raden praktijk om een verschuivende lamp of vervuilde optiek tijdig te signaleren.
Een blanco (ook: nulmonster of referentiemonster) is een oplossing die alle componenten bevat behalve de te meten stof. De blanco corrigeert voor:
Praktische regel: gebruik altijd dezelfde cuvet voor blanco en monster, of gebruik een matched cuvetset. Bij cuvettentests (disposable cuvetten) hoort de blanco in een cuvet van dezelfde productiebatch.
Bekijk het assortiment laboratoriumapparatuur en verbruiksmaterialen van Labvakhandel, of neem contact op voor advies bij de keuze van de juiste materialen voor uw toepassing.
Onderdeel van: Voedingslaboratorium · Milieulab · Farmaceutisch lab
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
