Western blot (ook immunoblot) is een analytische techniek waarmee specifieke eiwitten worden gedetecteerd in een complex mengsel van eiwitten na scheiding op molecuulmassa via SDS-PAGE. De techniek combineert de scheidingskracht van polyacrylamidegel-elektroforese met de hoge specificiteit van antilichaam-antigen-binding en is de referentiemethode voor de detectie en semi-kwantificering van specifieke eiwitten in celextracten, weefselhomogenaten en biologische vloeistoffen. Western blot wordt breed ingezet in cel- en moleculaire biologie, klinische diagnostiek (HIV-bevestigingstest, BSE-screening), farmaceutisch onderzoek en kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten.
Western blot verloopt in vijf opeenvolgende stappen: SDS-PAGE-scheiding van eiwitten op grootte, elektroforetische transfer naar een membraan, blokkering van aspecifieke bindingsplaatsen, incubatie met primair antilichaam dat het doeleiwit herkent, en detectie via een enzym-gelabeld secundair antilichaam dat fluorescentie of chemiluminescentie genereert.
Cellen of weefsel worden gelyseerd in lysis-buffer met protease-inhibitoren (PMSF, Complete-tabletten) om eiwit-degradatie te voorkomen. De eiwitconcentratie wordt bepaald via BCA- of Bradford-assay. Gelijke hoeveelheden eiwit (typisch 10–50 μg per lane) worden gemengd met Laemmli sample buffer (SDS + β-mercaptoethanol of DTT voor reductie van disulfidebindingen) en verhit (95 °C, 5 min). Na SDS-PAGE-scheiding (zie gelelectroforese) staan de eiwitten gesorteerd op grootte in het gel.
De eiwitten worden elektroforetisch overgebracht van het gel naar een PVDF- of nitrocellulose-membraan. Bij natte transfer (tank blot) wordt het gel-membraan sandwich in een cassette ondergedompeld in transferbuffer (Towbin-buffer: Tris/glycine/methanol); optimaal voor grote eiwitten (> 100 kDa) maar tijdrovend (1–16 uur). Bij semi-droge transfer (semi-dry) worden gel en membraan horizontaal gestapeld tussen met buffer gedrenkte filtreerpapieren; sneller (30–60 min) maar minder geschikt voor grote eiwitten. Turbotransfer-systemen (bijv. Bio-Rad Trans-Blot Turbo) voeren transfer uit in 3–10 minuten bij hoge stroom via geoptimaliseerde bufferformulering.
Het membraan wordt geblokkeerd met 5 % magere melk of 5 % BSA in TBST of PBST (1 uur, kamertemperatuur) om aspecifieke antilichaambinding aan het membraan te voorkomen. Gebruik BSA voor eiwitten die worden gedetecteerd via fosforyleringsspecifieke antilichamen (melk bevat ca-seïne dat ook door fosforyleringsantilichamen kan worden herkend).
Het primaire antilichaam — monoklonaal of polyklonaal, gericht tegen het doeleiwit — wordt geïncubeerd in verdunde blokkeerbuffer (overnight bij 4 °C of 1–2 uur bij kamertemperatuur). De juiste verdunning wordt bepaald via titratie; te hoge concentraties geven hoge achtergrond. Na incubatie 3× was met TBST.
Het enzym-geconjugeerde secundaire antilichaam (gericht tegen de Fc-regio van het primaire antilichaam, bijv. anti-rabbit-HRP of anti-mouse-HRP) wordt 1 uur geïncubeerd. Na 3× was volgt detectie:
Klassieke ECL-Western blot is semi-kwantitatief: het dynamische bereik is beperkt en filmontwikkeling is niet lineair. Voor betrouwbare kwantificering zijn de volgende maatregelen nodig: gebruik van fluorescente detectie (lineair bereik), gelijke eiwitbelading per lane (bevestigd via totaleiwit-staining of housekeeping-eiwit zoals β-actine, GAPDH, HSP90), gebruik van een standaard rechte kalibratiecurve, en digitale beeldacquisitie met een CCD-camera of imager. Normalisatie op totaleiwit (Stain-Free technologie, Revert Total Protein Stain) is superieur aan normalisatie op één referentie-eiwit.
Verificatie van eiwit-expressie na transfectie of CRISPR-knockout, analyse van signaaltransductie (fosforylering, ubiquitinering), eiwitinteractiestudies via co-immunoprecipitatie (co-IP) gevolgd door Western blot, en verificatie van antilichaamspecificiteit voor ELISA of flowcytometrie.
HIV-bevestigingstest (Western blot als confirmatory assay na positieve ELISA), BSE-screening in hersenweefsel, Lyme-ziekte serologiebevestiging (IgG/IgM Western blot), en Borelia-confirmatie conform EUCALB-criteria.
Verificatie van targetbinding bij geneesmiddelontwikkeling, biomarkeranalyse in klinisch materiaal, kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten en analyse van post-translationele modificaties als farmacodynamische eindpunten.
Immunoprecipitatie (IP) is een techniek waarbij een specifiek eiwit wordt geïsoleerd uit een complex celextract via binding aan een antilichaam dat gekoppeld is aan magnetische of agarose-beads. Het geïsoleerde eiwit wordt vervolgens geanalyseerd via western blot (IP-Western blot). IP-Western blot combineert zo de specificiteit van antilichaam-antigen-binding (IP) met de molecuulmassa-bevestiging van western blot.
Bij een IP-western blot worden standaard drie fracties op de western blot geladen:
Western blot is niet obsoleet maar wordt voor bepaalde toepassingen vervangen door modernere technieken met hogere doorvoer of betere kwantificering:
Western blot blijft de goudstandaard voor bevestiging van eiwit-molecuulmassa, verificatie van knockout-modellen, analyse van post-translationele modificaties en klinische confirmatory assays (HIV, Lyme). Voor hoogdoorvoer kwantificering is ELISA of multiplex immunoassay de betere keuze.
SDS-PAGE als eerste stap van Western blot is uitgebreid beschreven onder gelelectroforese. Voor directe kwantificering van eiwitten in oplossing zonder elektroforese is ELISA sneller en geschikter voor grote series. Celoppervlakte-expressie van eiwitten wordt gemeten via flowcytometrie. Genetische expressie-analyse op mRNA-niveau gaat via RT-PCR en qPCR. Voor isolatie van nucleïnezuren als uitgangsmateriaal voor moleculaire analyse is DNA-isolatie de voorbereidende stap.
Controleer achtereenvolgens: eiwitconcentratie per lane (te laag → meer eiwit laden of concentreren), transferefficiëntie (reversibel Ponceau S of totaaleiwit-stain op membraan na transfer), antilichaamverdunning (te hoog verdund → titreer), antilichaamspecificiteit (wrong secondary → controleer species-match), en gel-percentage (eiwit loopt door het gel bij te laag percentage).
Monoklonale antilichamen herkennen één specifiek epitoop; ze geven een scherpe, reproduceerbare band maar kunnen falen als het epitoop wordt gedenatureerd tijdens SDS-PAGE. Polyklonale antilichamen herkennen meerdere epitopen van hetzelfde eiwit; ze zijn robuuster bij gedenatureerde eiwitten maar kunnen meer achtergrond geven door kruisreactiviteit. Voor kwantitatieve Western blot op gedenatureerd eiwit wordt doorgaans een polyklonaal of een voor denaturatie gevalideerd monoklonaal antilichaam aanbevolen.
De naam "blot" verwijst naar het overbrengen (blotten) van moleculen van een gel naar een membraan of filter. De naamgeving van de drie klassieke blot-technieken volgt een geografisch woordspel:
Er bestaat ook een Eastern blot (voor lipiden en post-translationele modificaties) en een Southwestern blot (voor DNA-bindende eiwitten), maar deze zijn veel minder gangbaar dan de drie klassieke varianten.
Ja, met een geoptimaliseerd protocol is een volledige western blot in één dag haalbaar. Een realistische tijdsplanning:
De kritieke tijdsbesparing zit in de transfer (Turbo-systemen) en het primaire antilichaam (kamertemperatuur incubatie bij goed getitreerde antilichamen). Voor routinetoepassingen met gevalideerde antilichamen is een dagprotocol volledig haalbaar.
Voor Western blot en moleculaire biologie vindt u bij Labvakhandel centrifugebuizen en reactievaatjes voor monstervoorbereiding, biotechnologie- en moleculaire biologieapparatuur, pipetten en pipetpunten.
Deze pagina is onderdeel van de Labvakhandel kennisbank. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
