Western blot

Western blot (ook immunoblot) is een analytische techniek waarmee specifieke eiwitten worden gedetecteerd in een complex mengsel van eiwitten na scheiding op molecuulmassa via SDS-PAGE. De techniek combineert de scheidingskracht van polyacrylamidegel-elektroforese met de hoge specificiteit van antilichaam-antigen-binding en is de referentiemethode voor de detectie en semi-kwantificering van specifieke eiwitten in celextracten, weefselhomogenaten en biologische vloeistoffen. Western blot wordt breed ingezet in cel- en moleculaire biologie, klinische diagnostiek (HIV-bevestigingstest, BSE-screening), farmaceutisch onderzoek en kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten.

Principe

Western blot verloopt in vijf opeenvolgende stappen: SDS-PAGE-scheiding van eiwitten op grootte, elektroforetische transfer naar een membraan, blokkering van aspecifieke bindingsplaatsen, incubatie met primair antilichaam dat het doeleiwit herkent, en detectie via een enzym-gelabeld secundair antilichaam dat fluorescentie of chemiluminescentie genereert.

Stap voor stap

1. Monstervoorbereiding en SDS-PAGE

Cellen of weefsel worden gelyseerd in lysis-buffer met protease-inhibitoren (PMSF, Complete-tabletten) om eiwit-degradatie te voorkomen. Cellen of weefsel worden gelyseerd in lysis-buffer met protease-inhibitoren (PMSF, Complete-tabletten) om eiwit-degradatie te voorkomen. Voor concentrering van eiwitpreparaten en bufferuitwisseling zijn centrifugaalfiltratie-units (Amicon Ultra, Vivaspin) de standaardmethode; het achterliggend principe en de keuze van MWCO zijn beschreven in het artikel over membraanscheidingstechnieken. De eiwitconcentratie wordt bepaald via BCA- of Bradford-assay. Gelijke hoeveelheden eiwit (typisch 10–50 μg per lane) worden gemengd met Laemmli sample buffer (SDS + β-mercaptoethanol of DTT voor reductie van disulfidebindingen) en verhit (95 °C, 5 min). Na SDS-PAGE-scheiding (zie gelelectroforese) staan de eiwitten gesorteerd op grootte in het gel.

2. Transfer

De eiwitten worden elektroforetisch overgebracht van het gel naar een PVDF- of nitrocellulose-membraan. Bij natte transfer (tank blot) wordt het gel-membraan sandwich in een cassette ondergedompeld in transferbuffer (Towbin-buffer: Tris/glycine/methanol); optimaal voor grote eiwitten (> 100 kDa) maar tijdrovend (1–16 uur). Bij semi-droge transfer (semi-dry) worden gel en membraan horizontaal gestapeld tussen met buffer gedrenkte filtreerpapieren; sneller (30–60 min) maar minder geschikt voor grote eiwitten. Turbotransfer-systemen (bijv. Bio-Rad Trans-Blot Turbo) voeren transfer uit in 3–10 minuten bij hoge stroom via geoptimaliseerde bufferformulering.

3. Blokkering

Het membraan wordt geblokkeerd met 5 % magere melk of 5 % BSA in TBST of PBST (1 uur, kamertemperatuur) om aspecifieke antilichaambinding aan het membraan te voorkomen. Gebruik BSA voor eiwitten die worden gedetecteerd via fosforyleringsspecifieke antilichamen (melk bevat caseïne dat ook door fosforyleringsantilichamen kan worden herkend).

4. Primair antilichaam

Het primaire antilichaam — monoklonaal of polyklonaal, gericht tegen het doeleiwit — wordt geïncubeerd in verdunde blokkeerbuffer (overnight bij 4 °C of 1–2 uur bij kamertemperatuur). De juiste verdunning wordt bepaald via titratie; te hoge concentraties geven hoge achtergrond. Na incubatie 3× was met TBST.

5. Secundair antilichaam en detectie

Het enzym-geconjugeerde secundaire antilichaam (gericht tegen de Fc-regio van het primaire antilichaam, bijv. anti-rabbit-HRP of anti-mouse-HRP) wordt 1 uur geïncubeerd. Na 3× was volgt detectie:

• ECL (enhanced chemiluminescence) — HRP oxideert luminol in aanwezigheid van H₂O₂; het geëmitteerde licht wordt geregistreerd op film of digitaal (ChemiDoc, LAS-serie). Gevoeligheid tot < 1 pg eiwit per band; dynamisch bereik ca. 2–3 decaden.
• SuperSignal West Femto / Pico — versterkte ECL-formuleringen voor zwak-expresserende eiwitten; hogere gevoeligheid maar ook hogere achtergrondkans.
• Fluorescente detectie (Odyssey, Azure) — IRDye-gelabelde secundaire antilichamen; lineair dynamisch bereik van 4–5 decaden; multiplex detectie van twee eiwitten tegelijk (twee golflengtekanalen); goudstandaard voor kwantitatieve Western blot.
• Kleurdetectie (BCIP/NBT voor AP) — eenvoudig, geen apparatuur nodig voor ontwikkeling; lagere gevoeligheid; geschikt voor onderwijs en snelle controle.

Kwantitatieve Western blot

Klassieke ECL-Western blot is semi-kwantitatief: het dynamische bereik is beperkt en filmontwikkeling is niet lineair. Voor betrouwbare kwantificering zijn de volgende maatregelen nodig: gebruik van fluorescente detectie (lineair bereik), gelijke eiwitbelading per lane (bevestigd via totaleiwit-staining of housekeeping-eiwit zoals β-actine, GAPDH, HSP90), gebruik van een standaard rechte kalibratiecurve, en digitale beeldacquisitie met een CCD-camera of imager. Normalisatie op totaleiwit (Stain-Free technologie, Revert Total Protein Stain) is superieur aan normalisatie op één referentie-eiwit.

Membraantypen

• PVDF (polyvinylideen-difluoride) — standaard voor Western blot; hoge eiwitbindingscapaciteit; vereist activering met methanol vóór gebruik; niet-transparant; geschikt voor sequencing na blot.
• Nitrocellulose — lagere bindingscapaciteit dan PVDF; bros; geen methanol-activering nodig; hogere achtergrond bij sommige antilichamen. Traditioneel gebruikt in ELISA-blot en diagnostische strips.
• Laagfluorescente PVDF — voor fluorescente detectie (Odyssey, iBright); vermindert autofluorescentie voor hogere signaal-ruisverhouding.

Toepassingen

Cel- en moleculaire biologie

Verificatie van eiwit-expressie na transfectie of CRISPR-knockout, analyse van signaaltransductie (fosforylering, ubiquitinering), eiwitinteractiestudies via co-immunoprecipitatie (co-IP) gevolgd door Western blot, en verificatie van antilichaamspecificiteit voor ELISA of flowcytometrie. Voor de analyse van eiwit-DNA-interacties in de context van chromatine is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende methode.

Klinische diagnostiek

HIV-bevestigingstest (Western blot als confirmatory assay na positieve ELISA), BSE-screening in hersenweefsel, Lyme-ziekte serologiebevestiging (IgG/IgM Western blot), en Borrelia-confirmatie conform EUCALB-criteria.

Farmaceutisch onderzoek

Verificatie van targetbinding bij geneesmiddelontwikkeling, biomarkeranalyse in klinisch materiaal, kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten en analyse van post-translationele modificaties als farmacodynamische eindpunten.

Immunoprecipitatie (IP) en co-immunoprecipitatie (co-IP) gecombineerd met western blot

Wat is immunoprecipitatie (IP)?

Immunoprecipitatie (IP) is een techniek waarbij een specifiek eiwit wordt geïsoleerd uit een complex celextract via binding aan een antilichaam dat gekoppeld is aan magnetische of agarose-beads. Het geïsoleerde eiwit wordt vervolgens geanalyseerd via western blot (IP-Western blot). IP-Western blot combineert zo de specificiteit van antilichaam-antigen-binding (IP) met de molecuulmassa-bevestiging van western blot.

Wat is het verschil tussen IP en co-IP?

Input, bound en flow-through in een IP-western blot experiment

Bij een IP-western blot worden standaard drie fracties op de western blot geladen:

• Input — een kleine hoeveelheid (1–5 %) van het totale celextract vóór de immunoprecipitatie. Dient als referentie: bewijst dat het doeleiwit aanwezig is in het extract en geeft de verwachte bandgrootte.
• Bound (elutie/precipitaat) — de fractie die is mee­geprecipiteerd door het antilichaam. Dit is het eigenlijke IP-resultaat: de band toont aan dat het eiwit specifiek is geïsoleerd.
• Flow-through (supernatant) — de fractie die niet gebonden is aan het antilichaam. Als het doeleiwit hier nog sterk aanwezig is, was de precipitatie inefficiënt (onvoldoende antilichaam of verkeerde condities).

Praktische tips voor IP-western blot

• Gebruik een niet-denaturerende lyseerbuffer (RIPA is te stringent voor de meeste interacties; kies NP-40 of CHAPS-buffer voor co-IP)
• Voeg altijd een isotype-controle toe (IgG van hetzelfde dier als het primaire antilichaam) om aspecifieke precipitatie aan te tonen
• Gebruik anti-IgG light chain-specifieke secundaire antilichamen voor detectie om overstemming van de band door de zware keten van het neergeslagen antilichaam (55 kDa) te voorkomen

Bait en prey: terminologie van co-IP

In een co-IP-experiment wordt het eiwit waartegen het antilichaam is gericht het bait (lokaas) genoemd. Het eiwit dat samen met het bait wordt meegeprecipiteerd — omdat het in een complex zit met het bait — heet de prey (prooi). De western blot na co-IP wordt typisch geïmmunodetecteerd op de prey, omdat de aanwezigheid van de prey-band in het IP-precipitaat het bewijs is dat bait en prey ook in vivo in een complex aanwezig zijn. Voor een sluitend bewijs van interactie wordt vaak ook een reverse co-IP uitgevoerd: het experiment wordt herhaald met een antilichaam tegen de prey als bait, waarbij dan het oorspronkelijke bait als prey moet meekomen. Onafhankelijke bevestiging in beide richtingen sluit artefacten uit.

Stap-voor-stap co-IP protocol

Een typisch co-IP-experiment verloopt in zes stappen, uit te voeren op één werkdag met voorbereide cellysaten:

1. Cellysis — lyseer cellen in een niet-denaturerende buffer (NP-40 0,5 %, CHAPS 1 % of digitonin 1 %) met protease- en fosfatase-inhibitoren op ijs (20–30 min). RIPA-buffer is voor de meeste interacties te stringent en breekt zwakkere complexen af.
2. Pre-clearing — incubeer het lysaat 30–60 min met "lege" Protein A/G-beads (zonder antilichaam) om aspecifiek bindende eiwitten weg te vangen. Verwijder de beads via centrifugatie of magnetische separatie en gebruik het pre-gecleared lysaat voor de eigenlijke IP.
3. Antilichaambinding — voeg 1–5 µg primair antilichaam (gericht tegen het bait) toe aan 500–1000 µg totaaleiwit. Incubeer 1–4 uur (of overnight bij 4 °C) onder zachte rotatie.
4. Precipitatie — voeg Protein A- of Protein G-beads (magnetisch of agarose) toe en incubeer 1 uur bij 4 °C onder zachte rotatie. De keuze tussen Protein A en Protein G hangt af van de antilichaamsubklasse en het dier van herkomst (Protein G bindt breder bij muis IgG1; Protein A bindt sterker bij konijn IgG).
5. Wassen — was de beads 3–5× met wasbuffer (dezelfde buffer als de lysisbuffer, eventueel met iets hogere zoutconcentratie). Elke wasstap verwijdert aspecifiek gebonden eiwit; te stringent wassen verbreekt echter ook de bait-prey-interactie.
6. Elutie en western blot — elueer het gebonden complex via koken in 1× Laemmli sample buffer (95 °C, 5 min) of via competitief elueren met excess peptide (voor milde condities). Laad input, bound en flow-through fracties op SDS-PAGE en immunodetecteer met een antilichaam tegen de prey.

Voor kwantitatieve interactiestudies wordt de bound-fractie genormaliseerd op de hoeveelheid bait in het precipitaat (geladen op een tweede blot) om verschillen in precipitatie-efficiëntie tussen condities te compenseren.

Cross-linking voor zwakke of transiënte interacties

Voor eiwitcomplexen met lage affiniteit (K_D > 1 µmol/L) of kort levende interacties (kinase-substraat, GTPase-effector, transcriptiefactor-co-activator) wordt de complexe vorm vaak verbroken tijdens lysis en wassen. Chemische cross-linking vóór lysis stabiliseert de interactie door covalente bindingen te leggen tussen bait en prey. Veelgebruikte reagentia zijn formaldehyde (1 % in PBS, 10 min op intacte cellen; daarna afblussen met glycine), DSP (dithiobis-succinimidylpropionaat; reversibel via reductie met DTT) en BS3 (bis-sulfosuccinimidylsuberaat; niet-reversibel maar membraan-impermeabel voor selectieve oppervlakte-cross-linking).

Na cross-linking, lysis en immunoprecipitatie wordt het complex tijdens elutie weer ontkoppeld (formaldehyde door koken; DSP door DTT-reductie in sample buffer). Voor de identificatie van onbekende interactoren wordt cross-linking IP doorgaans gecombineerd met massaspectrometrie (IP-MS of XL-MS) in plaats van western blot, omdat MS alle co-gepurificeerde eiwitten ongericht identificeert.

Wanneer co-IP faalt: alternatieven

Als co-IP geen reproduceerbaar signaal oplevert ondanks zorgvuldige optimalisatie, kunnen de volgende alternatieven worden overwogen: GST- of His-tag pull-down met recombinant gezuiverd bait-eiwit (sluit endogene factoren uit en geeft een controleerbare bait-concentratie); BioID of TurboID waarbij een biotine-ligase aan het bait wordt gefuseerd en nabije eiwitten in vivo worden gebiotinyleerd voor latere streptavidine-pulldown (vangt ook transiënte interacties); yeast two-hybrid (Y2H) voor systematisch screenen van mogelijke binders in een gistsysteem; en proximity ligation assay (PLA) voor de detectie van eiwit-eiwit-interacties in situ in gefixeerde cellen of weefsel met fluorescentiemicroscopie.

Voordelen en beperkingen

Western blot versus ELISA: wanneer kiest u welke techniek?

Wordt western blot nog steeds gebruikt?

Western blot is niet obsoleet maar wordt voor bepaalde toepassingen vervangen door modernere technieken met hogere doorvoer of betere kwantificering:

Western blot blijft de goudstandaard voor bevestiging van eiwit-molecuulmassa, verificatie van knockout-modellen, analyse van post-translationele modificaties en klinische confirmatory assays (HIV, Lyme). Voor hoogdoorvoer­kwantificering is ELISA of multiplex immunoassay de betere keuze.

Gerelateerde technieken

SDS-PAGE als eerste stap van Western blot is uitgebreid beschreven onder gelelectroforese. Voor directe kwantificering van eiwitten in oplossing zonder elektroforese is ELISA sneller en geschikter voor grote series. Celoppervlakte-expressie van eiwitten wordt gemeten via flowcytometrie; voor de isolatie van de te analyseren celpopulatie voorafgaand aan Western blot-analyse is celsortering via FACS de aanvullende stap. Genetische expressie-analyse op mRNA-niveau gaat via RT-PCR en qPCR. Voor detectie van DNA-sequenties (Southern blot) en RNA-expressie (Northern blot) via hybridisatie met een gelabelde probe, zie Southern blot en Northern blot. Voor de thermodynamische karakterisering van eiwit-bindingsinteracties in oplossing is isothermische titratiecalorimetrie (ITC) een aanvullende methode. Voor isolatie van nucleïnezuren als uitgangsmateriaal voor moleculaire analyse is DNA-isolatie de voorbereidende stap. Voor eiwitdetectie met ruimtelijke lokalisatie in weefselcontext is immunohistochemie (IHC) de aangewezen techniek. Voor de analyse van eiwit-DNA-interacties en histonmodificaties in het celgenoom is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende epigenomische methode.

Veelgestelde vragen

Waarom zie ik geen band op mijn Western blot?

Controleer achtereenvolgens: eiwitconcentratie per lane (te laag → meer eiwit laden of concentreren), transferefficiëntie (reversibel Ponceau S of totaaleiwit-stain op membraan na transfer), antilichaamverdunning (te hoog verdund → titreer), antilichaamspecificiteit (verkeerd secundair antilichaam → controleer species-match), en gel-percentage (eiwit loopt door het gel bij te laag percentage).

Wat is het verschil tussen monoklonale en polyklonale antilichamen voor Western blot?

Monoklonale antilichamen herkennen één specifiek epitoop; ze geven een scherpe, reproduceerbare band maar kunnen falen als het epitoop wordt gedenatureerd tijdens SDS-PAGE. Polyklonale antilichamen herkennen meerdere epitopen van hetzelfde eiwit; ze zijn robuuster bij gedenatureerde eiwitten maar kunnen meer achtergrond geven door kruisreactiviteit. Voor kwantitatieve Western blot op gedenatureerd eiwit wordt doorgaans een polyklonaal of een voor denaturatie gevalideerd monoklonaal antilichaam aanbevolen.

Waar komt de naam "western blot" vandaan?

De naam "blot" verwijst naar het overbrengen (blotten) van moleculen van een gel naar een membraan of filter. De naamgeving van de drie klassieke blot-technieken volgt een geografisch woordspel:

Er bestaat ook een Eastern blot (voor lipiden en post-translationele modificaties) en een Southwestern blot (voor DNA-bindende eiwitten), maar deze zijn veel minder gangbaar dan de drie klassieke varianten.

Kan een western blot in één dag worden uitgevoerd?

Ja, met een geoptimaliseerd protocol is een volledige western blot in één dag haalbaar. Een realistische tijdsplanning:

De kritieke tijdsbesparing zit in de transfer (Turbo-systemen) en het primaire antilichaam (kamer­temperatuur incubatie bij goed getitreerde antilichamen). Voor routine­toepassingen met gevalideerde antilichamen is een dagprotocol volledig haalbaar.

Voor de thermische stabiliteitsbepaling van eiwitten die via western blot worden gekarakteriseerd — met name bij kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten en biologica — is DSC voor biomoleculen: eiwitontvouwing en Tm-bepaling de aanvullende calorimetrische methode.

Wanneer naast de immunologische detectie van het eiwit ook de natieve conformatie in oplossing moet worden beoordeeld, biedt circulair dichroïsme (CD)-spectroscopie inzicht in de secundaire structuurintegriteit van het gezuiverde preparaat.

Voor Western blot en moleculaire biologie vindt u bij Labvakhandel centrifugebuizen en reactievaatjes voor monstervoorbereiding, biotechnologie- en moleculaire biologieapparatuur, pipetten en pipetpunten.

Disclaimer: Deze pagina is onderdeel van de Labvakhandel kennisbank. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties.