Western blot (ook immunoblot) is een analytische techniek waarmee specifieke eiwitten worden gedetecteerd in een complex mengsel van eiwitten na scheiding op molecuulmassa via SDS-PAGE. De techniek combineert de scheidingskracht van polyacrylamidegel-elektroforese met de hoge specificiteit van antilichaam-antigen-binding en is de referentiemethode voor de detectie en semi-kwantificering van specifieke eiwitten in celextracten, weefselhomogenaten en biologische vloeistoffen. Western blot wordt breed ingezet in cel- en moleculaire biologie, klinische diagnostiek (HIV-bevestigingstest, BSE-screening), farmaceutisch onderzoek en kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten. Western blot is ook toepasbaar op celextracten uit organ-on-chip-kweken voor de kwantificering van eiwitexpressie onder farmacologische behandeling.
Western blot verloopt in vijf opeenvolgende stappen: SDS-PAGE-scheiding van eiwitten op grootte, elektroforetische transfer naar een membraan, blokkering van aspecifieke bindingsplaatsen, incubatie met primair antilichaam dat het doeleiwit herkent, en detectie via een enzym-gelabeld secundair antilichaam dat fluorescentie of chemiluminescentie genereert.
Een blot test (of blotting-techniek) is een verzamelnaam voor laboratoriummethoden waarbij moleculen — eiwitten, DNA of RNA — eerst worden gescheiden via elektroforese en vervolgens worden overgebracht ("geblot") op een vast membraan, waarna ze specifiek worden gevisualiseerd met een gelabelde probe of antilichaam. Western blot is de blot test voor eiwitten; Southern blot voor DNA; Northern blot voor RNA. Het woord "blot" zelf verwijst naar de overdrachtsstap: het afdrukken van het scheidingspatroon van de gel op een membraan, vergelijkbaar met een inktvlek (blot) die het onderliggende patroon overneemt.
Cellen of weefsel worden gelyseerd in lysis-buffer met protease-inhibitoren (PMSF, Complete-tabletten) om eiwit-degradatie te voorkomen. Voor concentrering van eiwitpreparaten en bufferuitwisseling zijn centrifugaalfiltratie-units (Amicon Ultra, Vivaspin) de standaardmethode; het achterliggend principe en de keuze van MWCO zijn beschreven in het artikel over membraanscheidingstechnieken. De eiwitconcentratie wordt bepaald via BCA- of Bradford-assay. Gelijke hoeveelheden eiwit (typisch 10–50 µg per lane) worden gemengd met Laemmli sample buffer (SDS + β-mercaptoethanol of DTT voor reductie van disulfidebindingen) en verhit (95 °C, 5 min). Na SDS-PAGE-scheiding (zie gelelectroforese) staan de eiwitten gesorteerd op grootte in het gel.
De eiwitten worden elektroforetisch overgebracht van het gel naar een PVDF- of nitrocellulose-membraan. Bij natte transfer (tank blot) wordt het gel-membraan sandwich in een cassette ondergedompeld in transferbuffer (Towbin-buffer: Tris/glycine/methanol); optimaal voor grote eiwitten (> 100 kDa) maar tijdrovend (1–16 uur). Bij semi-droge transfer (semi-dry) worden gel en membraan horizontaal gestapeld tussen met buffer gedrenkte filtreerpapieren; sneller (30–60 min) maar minder geschikt voor grote eiwitten. Turbotransfer-systemen (bijv. Bio-Rad Trans-Blot Turbo) voeren transfer uit in 3–10 minuten bij hoge stroom via geoptimaliseerde bufferformulering.
Welke transfermethode kiest u: nat, semi-droog of turbo? Natte transfer blijft de voorkeursmethode voor grote eiwitten (> 100 kDa) en voor toepassingen waar maximale transferefficiëntie belangrijker is dan snelheid, dankzij de constante koeling en het grotere buffervolume. Semi-droge transfer is een goede middenweg voor routinematige Western blots van eiwitten in het gangbare bereik (20–100 kDa) waar tijdsbesparing telt. Turbotransfer-systemen zijn het meest geschikt voor hoge doorvoer en eiwitten tot circa 150 kDa, maar minder geschikt voor zeer grote eiwitten of multiplex-panels met sterk uiteenlopende molecuulmassa's binnen één gel.
Het membraan wordt geblokkeerd met 5 % magere melk of 5 % BSA in TBST of PBST (1 uur, kamertemperatuur) om aspecifieke antilichaambinding aan het membraan te voorkomen. Gebruik BSA voor eiwitten die worden gedetecteerd via fosforyleringsspecifieke antilichamen (melk bevat caseïne dat ook door fosforyleringsantilichamen kan worden herkend).
Melk of BSA: welke blokkeerbuffer kiest u? Magere melk (5 % in TBST/PBST) is goedkoop en effectief voor de meeste standaardtoepassingen, maar bevat caseïne en andere fosfo-eiwitten die kruisreactiviteit kunnen geven bij fosforyleringsspecifieke antilichamen. BSA (runderserumalbumine) is duurder maar vrij van fosfo-eiwitten en daardoor de standaardkeuze bij detectie van gefosforyleerde doeleiwitten. Voor biotine-gerelateerde detectiesystemen (streptavidine-HRP) is melk eveneens af te raden vanwege endogeen biotine in zuivelproducten; BSA of een commerciële biotine-vrije blokkeerbuffer is dan de betere keuze.
Het primaire antilichaam — monoklonaal of polyklonaal, gericht tegen het doeleiwit — wordt geïncubeerd in verdunde blokkeerbuffer (overnight bij 4 °C of 1–2 uur bij kamertemperatuur). De juiste verdunning wordt bepaald via titratie; te hoge concentraties geven hoge achtergrond. Na incubatie 3× was met TBST.
Het enzym-geconjugeerde secundaire antilichaam (gericht tegen de Fc-regio van het primaire antilichaam, bijv. anti-rabbit-HRP of anti-mouse-HRP) wordt 1 uur geïncubeerd. Na 3× was volgt detectie:
Klassieke ECL-Western blot is semi-kwantitatief: het dynamische bereik is beperkt en filmontwikkeling is niet lineair. Voor betrouwbare kwantificering zijn de volgende maatregelen nodig: gebruik van fluorescente detectie (lineair bereik), gelijke eiwitbelading per lane (bevestigd via totaleiwit-staining of housekeeping-eiwit zoals β-actine, GAPDH, HSP90), gebruik van een standaard rechte kalibratiecurve, en digitale beeldacquisitie met een CCD-camera of imager. Normalisatie op totaleiwit (Stain-Free technologie, Revert Total Protein Stain) is superieur aan normalisatie op één referentie-eiwit.
PVDF heeft een hogere eiwitbindingscapaciteit en mechanische sterkte dan nitrocellulose, waardoor het geschikter is voor herhaald strippen en opnieuw probe-en (re-probing) van hetzelfde membraan. Nitrocellulose vereist geen methanol-activering en is daardoor sneller in gebruik, met doorgaans een lagere achtergrond bij chemiluminescentiedetectie. Voor fluorescente multiplexdetectie is laagfluorescente PVDF de standaardkeuze vanwege de lagere autofluorescentie. Voor eiwitten kleiner dan 30 kDa wordt vaak een PVDF-variant met kleinere poriegrootte (0,2 µm) aanbevolen om doorslag van het eiwit door het membraan te voorkomen.
Verificatie van eiwit-expressie na transfectie of CRISPR-knockout, analyse van signaaltransductie (fosforylering, ubiquitinering), eiwitinteractiestudies via co-immunoprecipitatie (co-IP) gevolgd door Western blot, en verificatie van antilichaamspecificiteit voor ELISA of flowcytometrie. Voor de analyse van eiwit-DNA-interacties in de context van chromatine is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende methode.
HIV-bevestigingstest (Western blot als confirmatory assay na positieve ELISA), BSE-screening in hersenweefsel, Lyme-ziekte serologiebevestiging (IgG/IgM Western blot), en Borrelia-confirmatie conform EUCALB-criteria.
Verificatie van targetbinding bij geneesmiddelontwikkeling, biomarkeranalyse in klinisch materiaal, kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten en analyse van post-translationele modificaties als farmacodynamische eindpunten.
Western blot wordt ingezet wanneer zowel de aanwezigheid als het exacte molecuulgewicht van een specifiek eiwit moeten worden bevestigd — iets wat technieken als ELISA niet bieden. Typische redenen om voor western blot te kiezen: bevestigen dat een gen-knockout of -knockdown daadwerkelijk tot eiwitverlies leidt, aantonen dat een eiwit van de juiste grootte tot expressie komt na transfectie, controleren of een antilichaam specifiek is voordat het wordt ingezet in andere assays (ELISA, immunohistochemie, flowcytometrie), aantonen van post-translationele modificaties via een verschuiving in molecuulgewicht (fosforylering, glycosylering, ubiquitinering), en als wettelijk voorgeschreven confirmatory test in klinische diagnostiek (HIV, Lyme-ziekte).
Ja, de Lyme-immunoblot is een western blot: bij verdenking op Lyme-borreliose (infectie met Borrelia burgdorferi) wordt na een positieve of twijfelachtige ELISA-screening een western blot uitgevoerd als bevestigingstest, waarbij IgM- en IgG-antilichamen tegen specifieke Borrelia-eiwitten (zoals OspC, p39, p41) worden gedetecteerd. De term "immunoblot" wordt in de klinische microbiologie vaker gebruikt dan "western blot", maar de onderliggende techniek — eiwitscheiding, transfer naar membraan, antilichaamdetectie — is identiek. De criteria voor een positieve Lyme-immunoblot (minimaal twee van drie IgM-banden, minimaal vijf van tien IgG-banden) zijn internationaal vastgelegd via de Dearborn-consensus en de MIQ12-richtlijn.
Immunoprecipitatie (IP) is een techniek waarbij een specifiek eiwit wordt geïsoleerd uit een complex celextract via binding aan een antilichaam dat gekoppeld is aan magnetische of agarose-beads. Het geïsoleerde eiwit wordt vervolgens geanalyseerd via western blot (IP-Western blot). IP-Western blot combineert zo de specificiteit van antilichaam-antigen-binding (IP) met de molecuulmassa-bevestiging van western blot.
Bij een IP-western blot worden standaard drie fracties op de western blot geladen:
Voor totaal-eiwitvisualisatie op de gel voordat wordt overgezet naar het membraan, wordt vaak parallel een gel gekleurd met Coomassie of zilverkleuring als loading-control.
In een co-IP-experiment wordt het eiwit waartegen het antilichaam is gericht het bait (lokaas) genoemd. Het eiwit dat samen met het bait wordt meegeprecipiteerd — omdat het in een complex zit met het bait — heet de prey (prooi). De western blot na co-IP wordt typisch geïmmunodetecteerd op de prey, omdat de aanwezigheid van de prey-band in het IP-precipitaat het bewijs is dat bait en prey ook in vivo in een complex aanwezig zijn. Voor een sluitend bewijs van interactie wordt vaak ook een reverse co-IP uitgevoerd: het experiment wordt herhaald met een antilichaam tegen de prey als bait, waarbij dan het oorspronkelijke bait als prey moet meekomen. Onafhankelijke bevestiging in beide richtingen sluit artefacten uit.
Een typisch co-IP-experiment verloopt in zes stappen, uit te voeren op één werkdag met voorbereide cellysaten:
Voor kwantitatieve interactiestudies wordt de bound-fractie genormaliseerd op de hoeveelheid bait in het precipitaat (geladen op een tweede blot) om verschillen in precipitatie-efficiëntie tussen condities te compenseren.
Voor eiwitcomplexen met lage affiniteit (KD > 1 µmol/L) of kort levende interacties (kinase-substraat, GTPase-effector, transcriptiefactor-co-activator) wordt de complexe vorm vaak verbroken tijdens lysis en wassen. Chemische cross-linking vóór lysis stabiliseert de interactie door covalente bindingen te leggen tussen bait en prey. Veelgebruikte reagentia zijn formaldehyde (1 % in PBS, 10 min op intacte cellen; daarna afblussen met glycine), DSP (dithiobis-succinimidylpropionaat; reversibel via reductie met DTT) en BS3 (bis-sulfosuccinimidylsuberaat; niet-reversibel maar membraan-impermeabel voor selectieve oppervlakte-cross-linking).
Na cross-linking, lysis en immunoprecipitatie wordt het complex tijdens elutie weer ontkoppeld (formaldehyde door koken; DSP door DTT-reductie in sample buffer). Voor de identificatie van onbekende interactoren wordt cross-linking IP doorgaans gecombineerd met massaspectrometrie (IP-MS of XL-MS) in plaats van western blot, omdat MS alle co-gepurificeerde eiwitten ongericht identificeert.
Als co-IP geen reproduceerbaar signaal oplevert ondanks zorgvuldige optimalisatie, kunnen de volgende alternatieven worden overwogen: GST- of His-tag pull-down met recombinant gezuiverd bait-eiwit (sluit endogene factoren uit en geeft een controleerbare bait-concentratie); BioID of TurboID waarbij een biotine-ligase aan het bait wordt gefuseerd en nabije eiwitten in vivo worden gebiotinyleerd voor latere streptavidine-pulldown (vangt ook transiënte interacties); yeast two-hybrid (Y2H) voor systematisch screenen van mogelijke binders in een gistsysteem; en proximity ligation assay (PLA) voor de detectie van eiwit-eiwit-interacties in situ in gefixeerde cellen of weefsel met fluorescentiemicroscopie.
Kies voor western blot in plaats van ELISA wanneer het molecuulgewicht van het doeleiwit relevant is voor de vraagstelling: bijvoorbeeld bij verificatie van een knockout (geen band = geen eiwit), bij detectie van een specifieke eiwitisovorm temidden van verwante eiwitten, of bij het aantonen van een molecuulgewichtverschuiving door post-translationele modificatie. ELISA is te verkiezen wanneer hoge doorvoer en absolute kwantificering belangrijker zijn dan moleculaire bevestiging, zoals bij grootschalige serologie of biomarkerscreening. In de praktijk worden beide technieken vaak complementair ingezet: ELISA voor screening van grote series, western blot als bevestigingstest van positieve of grensgevallen.
Western blot is niet obsoleet maar wordt voor bepaalde toepassingen vervangen door modernere technieken met hogere doorvoer of betere kwantificering:
Western blot blijft de goudstandaard voor bevestiging van eiwit-molecuulmassa, verificatie van knockout-modellen, analyse van post-translationele modificaties en klinische confirmatory assays (HIV, Lyme). Voor hoogdoorvoer-kwantificering is ELISA of multiplex immunoassay de betere keuze.
De kosten van een western blot zijn sterk afhankelijk van schaal en uitvoering. Voor een eenmalige bepaling met reeds aanwezige apparatuur bestaan de directe kosten voornamelijk uit het primaire antilichaam (vaak de grootste kostenpost, oplopend van enkele tientallen tot honderden euro's per flacon), het secundaire antilichaam, gel- en transferverbruiksmaterialen en het detectiesubstraat (ECL-reagentia). Bij uitbesteding aan een contractlaboratorium of bij gebruik van geautomatiseerde systemen zoals Simple Western liggen de kosten per monster hoger, maar dat wordt deels gecompenseerd door tijdsbesparing en lagere arbeidskosten per run. Voor laboratoria die regelmatig western blots uitvoeren, wegen de initiële investeringen in apparatuur (elektroforese- en transfersysteem, imager) op tegen de lagere kosten per analyse op de lange termijn.
SDS-PAGE als eerste stap van Western blot is uitgebreid beschreven onder gelelectroforese. Voor directe kwantificering van eiwitten in oplossing zonder elektroforese is ELISA sneller en geschikter voor grote series. Celoppervlakte-expressie van eiwitten wordt gemeten via flowcytometrie; voor de isolatie van de te analyseren celpopulatie voorafgaand aan Western blot-analyse is celsortering via FACS de aanvullende stap. Genetische expressie-analyse op mRNA-niveau gaat via RT-PCR en qPCR. Voor detectie van DNA-sequenties (Southern blot) en RNA-expressie (Northern blot) via hybridisatie met een gelabelde probe, zie Southern blot en Northern blot. Voor de thermodynamische karakterisering van eiwit-bindingsinteracties in oplossing is isothermische titratiecalorimetrie (ITC) een aanvullende methode. Voor isolatie van nucleïnezuren als uitgangsmateriaal voor moleculaire analyse is DNA-isolatie de voorbereidende stap. Voor eiwitdetectie met ruimtelijke lokalisatie in weefselcontext is immunohistochemie (IHC) de aangewezen techniek. Voor de analyse van eiwit-DNA-interacties en histonmodificaties in het celgenoom is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende epigenomische methode.
Controleer achtereenvolgens: eiwitconcentratie per lane (te laag → meer eiwit laden of concentreren), transferefficiëntie (reversibel Ponceau S of totaaleiwit-stain op membraan na transfer), antilichaamverdunning (te hoog verdund → titreer), antilichaamspecificiteit (verkeerd secundair antilichaam → controleer species-match), en gel-percentage (eiwit loopt door het gel bij te laag percentage).
De verticale positie van een band op de blot komt overeen met het molecuulgewicht van het eiwit, afgelezen ten opzichte van de meegelopen eiwitmarker (ladder); een band die niet overeenkomt met het verwachte molecuulgewicht kan wijzen op proteolytische afbraak, alternatieve splicing, post-translationele modificatie (zoals fosforylering of glycosylering, die het looppatroon vertragen) of aspecifieke antilichaambinding. De dikte en intensiteit van een band is een maat voor de hoeveelheid aanwezig eiwit in dat monster: bij gelijke beladingscontrole (housekeeping-eiwit of totaaleiwit-staining) geeft een dikkere of intensere band een hogere relatieve expressie aan. Meerdere banden bij verschillende moleculaire gewichten kunnen wijzen op eiwitisovormen, multimeervorming (dimeren, trimeren) of kruisreactiviteit van het antilichaam met een verwant eiwit.
Monoklonale antilichamen herkennen één specifiek epitoop; ze geven een scherpe, reproduceerbare band maar kunnen falen als het epitoop wordt gedenatureerd tijdens SDS-PAGE. Polyklonale antilichamen herkennen meerdere epitopen van hetzelfde eiwit; ze zijn robuuster bij gedenatureerde eiwitten maar kunnen meer achtergrond geven door kruisreactiviteit. Voor kwantitatieve Western blot op gedenatureerd eiwit wordt doorgaans een polyklonaal of een voor denaturatie gevalideerd monoklonaal antilichaam aanbevolen.
De naam "blot" verwijst naar het overbrengen (blotten) van moleculen van een gel naar een membraan of filter. De naamgeving van de drie klassieke blot-technieken volgt een geografisch woordspel:
Er bestaat ook een Eastern blot (voor lipiden en post-translationele modificaties) en een Southwestern blot (voor DNA-bindende eiwitten), maar deze zijn veel minder gangbaar dan de drie klassieke varianten.
Ja, met een geoptimaliseerd protocol is een volledige western blot in één dag haalbaar. Een realistische tijdsplanning:
De kritieke tijdsbesparing zit in de transfer (Turbo-systemen) en het primaire antilichaam (kamertemperatuur incubatie bij goed getitreerde antilichamen). Voor routinetoepassingen met gevalideerde antilichamen is een dagprotocol volledig haalbaar.
Voor de thermische stabiliteitsbepaling van eiwitten die via western blot worden gekarakteriseerd — met name bij kwaliteitscontrole van recombinante eiwitten en biologica — is DSC voor biomoleculen: eiwitontvouwing en Tm-bepaling de aanvullende calorimetrische methode.
Wanneer naast de immunologische detectie van het eiwit ook de natieve conformatie in oplossing moet worden beoordeeld, biedt circulair dichroïsme (CD)-spectroscopie inzicht in de secundaire structuurintegriteit van het gezuiverde preparaat.
Voor Western blot en moleculaire biologie vindt u bij Labvakhandel centrifugebuizen en reactievaatjes voor monstervoorbereiding, biotechnologie- en moleculaire biologieapparatuur, pipetten en pipetpunten.
Onderdeel van: Klinisch laboratorium
Disclaimer: Deze pagina is onderdeel van de Labvakhandel kennisbank. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
