ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is een immunologische analysetechniek waarmee eiwitten, antilichamen, hormonen, cytokinen en andere biomoleculen worden gedetecteerd en gekwantificeerd in biologische monsters. De methode berust op de hoge specificiteit van antilichaam-antigeen-binding en koppelt deze aan een enzymatische kleurreactie voor signaalversterking. ELISA is een van de meest gebruikte technieken in de klinische diagnostiek, farmaceutisch onderzoek, voedselveiligheidscontrole en levenswetenschappelijk onderzoek, en vormt de basis voor talloze commerciële testplatformen waaronder COVID-19 serologietests en zwangerschapstests.
Het doel van een ELISA-test is het aantonen en kwantificeren van een specifiek antigeen of antilichaam in een monster, met als resultaat een concrete concentratiewaarde in plaats van alleen een ja/nee-uitslag. Dit onderscheidt ELISA van kwalitatieve sneltests: waar een lateral-flow-sneltest enkel aan- of afwezigheid aangeeft, levert ELISA via een standaardcurve een nauwkeurig kwantitatief resultaat, wat de techniek geschikt maakt voor zowel diagnostische screening als onderzoeksmatige titerbepaling.
ELISA maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan het te meten molecuul (het antigeen). Een enzym — doorgaans mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP) — is gekoppeld aan een van de antilichamen. Na toevoeging van een kleursubstraat (bijv. TMB voor HRP) katalyseert het enzym een kleurreactie waarvan de intensiteit evenredig is met de hoeveelheid gebonden antigeen. De absorptie wordt gemeten met een plate reader bij 450 nm (TMB) of 405 nm (pNPP voor AP).
De naam ELISA is opgebouwd uit drie onderdelen die elk een stap in het principe beschrijven. "Enzyme-linked" verwijst naar het enzym dat aan een van de antilichamen is gekoppeld en de meetbare kleurreactie genereert. "Immunosorbent" verwijst naar de immunologische adsorptie: het antilichaam of antigeen wordt geadsorbeerd (vastgehecht) aan het vaste oppervlak van de microtiterplaat, waardoor ongebonden materiaal eenvoudig kan worden weggewassen. "Assay" duidt simpelweg op de meting of test zelf. Samen beschrijft de naam dus de kern van de techniek: een immunologische binding aan een vaste drager, uitgelezen via een enzymatisch signaal.
EIA (Enzyme Immunoassay) is de overkoepelende term voor alle immunoassays waarbij een enzym als label wordt gebruikt voor signaaldetectie. ELISA is een subtype van EIA waarbij het antilichaam of antigeen is geadsorbeerd aan een vaste drager (de well-bodem van een microtiterplaat). Alle ELISA's zijn EIA's, maar niet alle EIA's zijn ELISA's: een EIA die in oplossing wordt uitgevoerd zonder vaste fase heet een homogene EIA. In de praktijk worden EIA en ELISA vaak door elkaar gebruikt, maar in strikte zin is EIA de bredere categorie.
Binnen de immunoassay-familie worden vijf hoofdtypen onderscheiden:
Er worden vijf hoofdtypen ELISA onderscheiden, elk met een eigen opbouw en toepassingsgebied: direct, indirect, sandwich, competitief en multiplex. De keuze tussen deze vijf formaten hangt af van de grootte van het doelmolecuul, het aantal beschikbare epitopen en de vereiste gevoeligheid.
Het antigeen wordt direct aan de well-bodem geadsorbeerd. Een enzym-gelabeld antilichaam bindt direct aan het antigeen en geeft na substraattoevoeging een kleurstof. Eenvoudig en snel, maar weinig signaalversterking en minder gevoelig dan sandwich-ELISA. Geschikt voor screeningen waarbij hoge gevoeligheid niet vereist is.
Het antigeen wordt gecoat op de well; een primair antilichaam bindt het antigeen; een enzym-gelabeld secundair antilichaam (gericht tegen het primaire) geeft signaalversterking. Breed toegepast voor antilichaamdetectie in serum (bijv. serologische diagnostiek van infectieziekten). Het secundaire antilichaam kan universeel worden ingezet voor meerdere primaire antilichamen.
Het meest gebruikte ELISA-formaat voor eiwitkwantificering. Een capture-antilichaam is gecoat op de well en vangt het antigeen uit het monster. Een tweede, enzym-gelabeld detectie-antilichaam bindt aan een ander epitoop van hetzelfde antigeen. De sandwich-configuratie geeft hoge specificiteit en gevoeligheid. Vereist twee antilichamen die op verschillende epitopen binden; niet geschikt voor kleine moleculen met slechts één epitoop.
Tegenover de hoge gevoeligheid en specificiteit staan ook praktische nadelen. De ontwikkeling van een sandwich-ELISA vereist twee zorgvuldig op elkaar afgestemde antilichamen die niet-overlappende epitopen herkennen, wat de ontwikkelingskosten en -tijd verhoogt ten opzichte van direct of indirect ELISA. Niet voor elk antigeen zijn geschikte matched-antibody-paren commercieel verkrijgbaar. Daarnaast kan een zeer hoge antigeenconcentratie leiden tot het zogenoemde hook-effect (high-dose hook effect), waarbij capture- en detectie-antilichaam door overmaat antigeen los van elkaar verzadigd raken, wat een vals-lage uitslag geeft bij zeer geconcentreerde monsters. Verdunningsreeksen van het monster zijn daarom raadzaam bij twijfel over de verwachte concentratie.
Het monster-antigeen en een enzym-gelabeld antigeen concurreren om binding aan een gelimiteerde hoeveelheid antilichaam. Hoge concentratie antigeen in het monster geeft minder binding van het gelabelde antigeen — dus minder signaal. Geschikt voor kleine moleculen (haptenen, steroïden, mycotoxinen, pesticidenresiduen) die slechts één epitoop bezitten en niet geschikt zijn voor sandwich-ELISA.
Multiplex ELISA is het vijfde ELISA-formaat, waarbij meerdere analytes gelijktijdig worden gemeten in één monster. In plaats van een standaard 96-wells plaat worden microsferenplatforms (bijv. Luminex xMAP) of gearray-de microtiterplaten gebruikt waarbij elke positie of microsfeer is gecoat met een ander capture-antilichaam. Na incubatie met monster en fluorescent- of enzym-gelabelde detectie-antilichamen worden de signalen per analyte onderscheiden op basis van kleurcode (microsferen) of positie (array).
Multiplex ELISA is geschikt voor cytokineprofilering (gelijktijdige meting van IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ in één monster), biomarkerpanelen in klinische trials en screeningsstudies waarbij monstervolume beperkt is. De gevoeligheid per analyte is doorgaans iets lager dan bij een geoptimaliseerde enkelvoudige sandwich ELISA, maar de informatie-opbrengst per monster is aanzienlijk hoger. ELISA is een van de standaard detectiemethoden voor cytokinen en biomarkers in effluenten van organ-on-chip-systemen.
Van de vier basisformaten heeft sandwich-ELISA de hoogste gevoeligheid: doordat twee antilichamen op verschillende epitopen van hetzelfde antigeen binden, treedt signaalamplificatie op die de detectiegrens doorgaans twee tot vijf keer verlaagt ten opzichte van een direct of indirect formaat. Indirect ELISA is op zijn beurt gevoeliger dan direct ELISA, omdat het secundaire antilichaam op meerdere plaatsen aan het primaire antilichaam kan binden en zo eveneens een amplificerend effect geeft — dit gaat wel ten koste van de specificiteit, omdat kruisreactiviteit van het secundaire antilichaam de achtergrond kan verhogen. Direct ELISA, met één enzym-gelabeld antilichaam zonder amplificatiestap, heeft van de vier basisformaten doorgaans de laagste gevoeligheid maar wel de kortste doorlooptijd. Voor detectiegrenzen onder het pg/ml-bereik is doorgaans een ander detectieprincipe nodig, zoals chemiluminescentie (zie de vergelijking met CLIA verderop in dit artikel).
De plate reader is het meetinstrument dat de gele kleurreactie aan het einde van de assay omzet in een afleesbare getalswaarde. Het apparaat stuurt licht van een specifieke golflengte (450 nm voor TMB) door elke well van de microtiterplaat en meet hoeveel van dat licht wordt geabsorbeerd door de gevormde kleurstof. Hoe meer antigeen er in een monster aanwezig was, hoe intenser de kleur en hoe hoger de gemeten optische dichtheid (OD). De plate reader registreert deze OD-waarden voor alle wells tegelijk, waarna de software de standaardcurve fit en de concentraties van de onbekende monsters berekent.
Serologische detectie van antilichamen bij infectieziekten (HIV, hepatitis B/C, SARS-CoV-2, Lyme, syfilis), hormoonbepaling (TSH, LH, FSH, hCG, insuline, cortisol), cardiac markers (troponine, CK-MB, BNP) en tumormarkers (PSA, CA125, CEA). ELISA-gebaseerde kits zijn CE-gemarkeerd en worden ingezet in klinisch-chemische laboratoria wereldwijd.
Kwantificering van biologica (monoklonale antilichamen, fusie-eiwitten, cytokinen) in biologische matrices (serum, plasma, weefselhomogenaat) voor farmacokinetische studies. Immunogeniciteitstudies via anti-drug antibody (ADA) ELISA. Cytokineprofilering (IL-6, TNF-α, IFN-γ) bij ontstekingsonderzoek en klinische trials.
Detectie van allergenen (pinda, gluten, melk, ei, noten) in levensmiddelen conform EU-verordening 1169/2011. Mycotoxinescreening (aflatoxinen, ochratoxine, deoxynivalenol) in graan en diervoeders. Antibiotica- en hormoonresiduen (β-lactam, tetracycline, oestrogenen) in vlees en melk. ELISA-kits zijn breed geharmoniseerd en beschikbaar als AOAC-gecertificeerde methoden.
Voor eiwitdetectie na scheiding op grootte is Western blot de aanvullende methode die naast kwantificering ook het molecuulgewicht van het doeleiwit bevestigt. Voor celanalyse op basis van oppervlakte-eiwitten biedt flowcytometrie de mogelijkheid om meerdere markers gelijktijdig per individuele cel te meten. DNA-detectie en genexpressieanalyse worden uitgevoerd via PCR en SNP-genotypering. Scheiding en kwantificering van eiwitten op molecuulmassa gaat via gelelectroforese. Voor eiwitdetectie met ruimtelijke lokalisatie in weefselcontext is immunohistochemie (IHC) de aangewezen techniek. Voor de absolute thermodynamische karakterisering van antilichaam-antigeenbinding — bindingsenthalpie, affiniteit en stoïchiometrie in één meting — is isothermische titratiecalorimetrie (ITC) de complementaire methode. Voor de analyse van DNA-eiwitinteracties in de celkern — zoals histonmodificaties op genpromotors en transcriptiefactorbinding — is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende moleculaire techniek.
ELISA en Western blot detecteren beide eiwitten via antilichaambinding, maar verschillen fundamenteel in opzet en informatie-opbrengst. Bij ELISA wordt het monster in oplossing in een microtiterplaat geïncubeerd zonder voorafgaande scheiding op grootte; het resultaat is een volledig kwantitatieve concentratiewaarde op basis van een standaardcurve, maar er is geen informatie over het molecuulgewicht of de zuiverheid van het gedetecteerde eiwit. Bij Western blot worden eiwitten eerst gescheiden via gelelectroforese en overgebracht (geblot) naar een membraan, waarna detectie met antilichamen plaatsvindt; dit levert naast aan- of afwezigheid ook het molecuulgewicht en eventuele afbraakproducten of isovormen op, maar het resultaat is doorgaans semikwantitatief in plaats van absoluut kwantitatief. In de praktijk wordt ELISA verkozen wanneer nauwkeurige concentratiebepaling in veel monsters tegelijk vereist is, terwijl Western blot de voorkeur heeft wanneer bevestiging van eiwitidentiteit en -grootte naast de aan- of afwezigheid van belang is. De technieken worden in de praktijk vaak complementair ingezet: een positieve ELISA-uitslag wordt bij specifieke toepassingen (zoals HIV-serologie, zie verderop) bevestigd met Western blot.
ELISA en PCR beantwoorden fundamenteel verschillende vragen, ook al worden ze vaak voor dezelfde infectieziekte ingezet. ELISA detecteert eiwitten: antilichamen die het lichaam heeft aangemaakt als reactie op een pathogeen, of antigenen van het pathogeen zelf. PCR detecteert en vermenigvuldigt daarentegen het genetisch materiaal (DNA of RNA) van het pathogeen zelf, via exponentiële amplificatie. Dit verschil in target heeft directe gevolgen voor de toepassing: PCR kan een infectie al aantonen voordat het lichaam antilichamen heeft aangemaakt, wat de techniek geschikt maakt voor vroege detectie, terwijl ELISA-gebaseerde antilichaamtests pas later in het infectieverloop positief worden omdat de immuunrespons tijd nodig heeft om op gang te komen. Voor de opsporing van actuele, actieve infecties wordt PCR doorgaans als gevoeliger beschouwd; ELISA blijft de aangewezen methode voor serologisch onderzoek naar doorgemaakte infecties of vaccinatiestatus, en is door de eenvoudigere apparatuur en lagere kosten per test beter geschikt voor grootschalige screening.
Hoge achtergrond heeft doorgaans één van de volgende oorzaken: onvoldoende blokkering (verhoog BSA- of melkconcentratie, verleng blokkeertijd), onvoldoende wassen (voeg wasronden toe, controleer Tween-concentratie), te hoge antilichaamconcentratie (titreer het detectie-antilichaam), aspecifieke binding van het secundaire antilichaam (gebruik een betere blokkeringsoplossing), of contaminatie van het substraat met peroxidase uit het monster.
Plot de absorptiewaarden van de standaardreeks op de y-as en de bekende concentraties op de x-as. Voor ELISA wordt doorgaans een vierparameter logistische curve (4PL) gefit met analyticasoftware (bijv. GraphPad Prism, MyAssays, SoftMax Pro). Lees de concentratie van onbekende monsters af op de gecurve. Controleer altijd of de absorptiewaarden binnen het lineaire deel van de standaardcurve (OD 0,2–2,0) vallen; verdun indien nodig.
Naast de kwantitatieve afgelezen concentratie wordt een ELISA-uitslag in diagnostische toepassingen doorgaans ook kwalitatief beoordeeld aan de hand van een cut-off waarde. Deze cut-off wordt vastgesteld op basis van de gemiddelde OD van negatieve controles plus een vaste marge (bijvoorbeeld gemiddelde plus drie standaarddeviaties), of als ratio ten opzichte van een calibrator. Monsters met een signaal duidelijk boven de cut-off worden als positief beschouwd, monsters duidelijk eronder als negatief. Veel kits hanteren daarnaast een grijs gebied (equivocale zone) net rond de cut-off, waarbij herhaling van de test of een aanvullende bevestigingstest wordt geadviseerd. Bij elke run worden positieve en negatieve controles meegenomen om te bevestigen dat de assay binnen specificatie functioneert voordat monsterresultaten worden geïnterpreteerd.
Een positieve ELISA-uitslag is in de meeste diagnostische contexten een screeningsresultaat en geen definitieve diagnose. Afhankelijk van de toepassing zijn de volgende bevestigingstests gangbaar:
De reden voor bevestigingstesting is tweeledig: ten eerste heeft elke ELISA een bepaalde vals-positiefrate door kruisreactiviteit van antilichamen of matrix-effecten; ten tweede geeft een positieve antilichaam-ELISA alleen aan dat er ooit een immuunrespons is opgetreden, niet noodzakelijk dat er sprake is van een actieve infectie. PCR of kweek is nodig om actieve infectie aan te tonen.
Ja, ELISA wordt naast infectieziektediagnostiek ook breed ingezet voor de detectie van auto-antilichamen bij auto-immuunziekten, waaronder systemische lupus erythematodes (SLE). Specifieke ELISA-panelen detecteren auto-antilichamen tegen nucleaire antigenen zoals dsDNA, SSA/Ro, SSB/La, Sm en Sm/RNP, die karakteristiek zijn voor SLE en verwante reumatische aandoeningen. In de klinische praktijk geldt indirecte immunofluorescentie (IIF) op HEp-2-cellen doorgaans als gouden standaard voor de eerste ANA-screening; ELISA wordt vervolgens ingezet om specifieke auto-antilichaamprofielen te identificeren of als hoog-doorvoer alternatief voor de arbeidsintensievere IIF-methode.
Ja, ELISA is, ondanks de opkomst van gevoeligere technieken zoals CLIA, nog altijd een veelgebruikte standaardtechniek in laboratoria wereldwijd. De combinatie van betrouwbare kwantificering, relatief lage apparatuurkosten en brede beschikbaarheid van commerciële kits houdt ELISA relevant voor onderzoekslaboratoria, voedselveiligheidstests en diagnostische toepassingen waarbij de extreme gevoeligheid van CLIA niet noodzakelijk is. In hoog-doorvoer klinische routinediagnostiek heeft CLIA op gesloten analyzers in veel laboratoria de overhand gekregen, maar ELISA blijft het meest toegankelijke en flexibele immunoassay-platform voor open onderzoeksomgevingen.
CLIA (chemiluminescent immunoassay) en ELISA meten beide antilichaam-antigeen-binding maar gebruiken een ander detectieprincipe. CLIA gebruikt een chemiluminescent label (bijv. acridinium-ester, isoluminol of AMPPD voor alkalische fosfatase) dat licht uitzendt bij een chemische reactie in plaats van een kleurreactie. De voordelen van CLIA ten opzichte van ELISA zijn:
ELISA heeft op zijn beurt als voordelen dat de benodigde apparatuur (plate reader, washer) aanzienlijk goedkoper is, dat het formaat open en aanpasbaar is voor onderzoeksdoeleinden, en dat er een veel breder aanbod van commerciële kits beschikbaar is. Voor klinische routine-diagnostiek heeft CLIA grotendeels ELISA vervangen; voor onderzoekslaboratoria blijft ELISA het meest flexibele en toegankelijke immunoassay-platform.
Voor de thermische stabiliteitsbepaling van de antilichamen en eiwitten die in ELISA-assays worden ingezet — bepaling van smelttemperatuur Tm en ontvouwingsenthalpie — is DSC voor biomoleculen: eiwitontvouwing en Tm-bepaling de aanvullende calorimetrische methode.
Waar ELISA secretede eiwitten in oplossing kwantificeert, biedt celsortering via FACS de mogelijkheid om op basis van oppervlaktemarkers en intracellulaire eiwitten per individuele cel een scheidingsstap uit te voeren — essentieel wanneer zuivere celpopulaties als uitgangsmateriaal voor ELISA-analyse worden gewenst.
Voor ELISA-uitvoering levert Labvakhandel microtiterplaten, pipetten en pipetpunten voor nauwkeurige monsterverwerking, en schudders en incubatoren voor de incubatiestappen. Neem contact op voor advies.
Miniaturisatie van immunoassays op microfluidische platforms maakt point-of-care detectie bij zeptomolaire concentraties mogelijk. Lees meer over de technologische basis in ons artikel over microfluidics en lab-on-a-chip.
Onderdeel van: Voedingslaboratorium · Klinisch laboratorium
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
