ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) is een immunologische analysetechniek waarmee eiwitten, antilichamen, hormonen, cytokinen en andere biomoleculen worden gedetecteerd en gekwantificeerd in biologische monsters. De methode berust op de hoge specificiteit van antilichaam-antigeen-binding en koppelt deze aan een enzymatische kleurreactie voor signaalversterking. ELISA is een van de meest gebruikte technieken in de klinische diagnostiek, farmaceutisch onderzoek, voedselveiligheidscontrole en levenswetenschappelijk onderzoek, en vormt de basis voor talloze commerciële testplatformen waaronder COVID-19 serologietests en zwangerschapstests.
ELISA maakt gebruik van antilichamen die specifiek binden aan het te meten molecuul (het antigeen). Een enzym — doorgaans mierikswortelperoxidase (HRP) of alkalische fosfatase (AP) — is gekoppeld aan een van de antilichamen. Na toevoeging van een kleursubstraat (bijv. TMB voor HRP) katalyseert het enzym een kleurreactie waarvan de intensiteit evenredig is met de hoeveelheid gebonden antigeen. De absorptie wordt gemeten met een plate reader bij 450 nm (TMB) of 405 nm (pNPP voor AP).
EIA (Enzyme Immunoassay) is de overkoepelende term voor alle immunoassays waarbij een enzym als label wordt gebruikt voor signaaldetectie. ELISA is een subtype van EIA waarbij het antilichaam of antigeen is geadsorbeerd aan een vaste drager (de well-bodem van een microtiterplaat). Alle ELISA's zijn EIA's, maar niet alle EIA's zijn ELISA's: een EIA die in oplossing wordt uitgevoerd zonder vaste fase heet een homogene EIA. In de praktijk worden EIA en ELISA vaak door elkaar gebruikt, maar in strikte zin is EIA de bredere categorie.
Binnen de immunoassay-familie worden vijf hoofdtypen onderscheiden:
Het antigeen wordt direct aan de well-bodem geadsorbeerd. Een enzym-gelabeld antilichaam bindt direct aan het antigeen en geeft na substraattoevoeging een kleurstof. Eenvoudig en snel, maar weinig signaalversterking en minder gevoelig dan sandwich-ELISA. Geschikt voor screeningen waarbij hoge gevoeligheid niet vereist is.
Het antigeen wordt gecoat op de well; een primair antilichaam bindt het antigeen; een enzym-gelabeld secundair antilichaam (gericht tegen het primaire) geeft signaalversterking. Breed toegepast voor antilichaamdetectie in serum (bijv. serologische diagnostiek van infectieziekten). Het secundaire antilichaam kan universeel worden ingezet voor meerdere primaire antilichamen.
Het meest gebruikte ELISA-formaat voor eiwitkwantificering. Een capture-antilichaam is gecoat op de well en vangt het antigeen uit het monster. Een tweede, enzym-gelabeld detectie-antilichaam bindt aan een ander epitoop van hetzelfde antigeen. De sandwich-configuratie geeft hoge specificiteit en gevoeligheid. Vereist twee antilichamen die op verschillende epitopen binden; niet geschikt voor kleine moleculen met slechts één epitoop.
Het monster-antigeen en een enzym-gelabeld antigeen concurreren om binding aan een gelimiteerde hoeveelheid antilichaam. Hoge concentratie antigeen in het monster geeft minder binding van het gelabelde antigeen — dus minder signaal. Geschikt voor kleine moleculen (haptenen, steroïden, mycotoxinen, pesticidenresiduen) die slechts één epitoop bezitten en niet geschikt zijn voor sandwich-ELISA.
Multiplex ELISA is het vijfde ELISA-formaat, waarbij meerdere analytes gelijktijdig worden gemeten in één monster. In plaats van een standaard 96-wells plaat worden microsferenplatforms (bijv. Luminex xMAP) of gearray-de microtiterplaten gebruikt waarbij elke positie of microsfeer is gecoat met een ander capture-antilichaam. Na incubatie met monster en fluorescent- of enzym-gelabelde detectie-antilichamen worden de signalen per analyte onderscheiden op basis van kleurcode (microsferen) of positie (array).
Multiplex ELISA is geschikt voor cytokineprofilering (gelijktijdige meting van IL-1β, IL-6, IL-8, TNF-α, IFN-γ in één monster), biomarkerpanelen in klinische trials en screeningsstudies waarbij monstervolume beperkt is. De gevoeligheid per analyte is doorgaans iets lager dan bij een geoptimaliseerde enkelvoudige sandwich ELISA, maar de informatie-opbrengst per monster is aanzienlijk hoger.
Serologische detectie van antilichamen bij infectieziekten (HIV, hepatitis B/C, SARS-CoV-2, Lyme, syfilis), hormoonbepaling (TSH, LH, FSH, hCG, insuline, cortisol), cardiac markers (troponine, CK-MB, BNP) en tumormarkers (PSA, CA125, CEA). ELISA-gebaseerde kits zijn CE-gemarkeerd en worden ingezet in klinisch-chemische laboratoria wereldwijd.
Kwantificering van biologica (monoklonale antilichamen, fusie-eiwitten, cytokinen) in biologische matrices (serum, plasma, weefselhomogenaat) voor farmacokinetische studies. Immunogeniciteitstudies via anti-drug antibody (ADA) ELISA. Cytokineprofilering (IL-6, TNF-α, IFN-γ) bij ontstekingsonderzoek en klinische trials.
Detectie van allergenen (pinda, gluten, melk, ei, noten) in levensmiddelen conform EU-verordening 1169/2011. Mycotoxinescreening (aflatoxinen, ochratoxine, deoxynivalenol) in graan en diervoeders. Antibiotica- en hormoonresiduen (β-lactam, tetracycline, oestrogenen) in vlees en melk. ELISA-kits zijn breed geharmoniseerd en beschikbaar als AOAC-gecertificeerde methoden.
Voor eiwitdetectie na scheiding op grootte is Western blot de aanvullende methode die naast kwantificering ook het molecuulgewicht van het doeleiwit bevestigt. Voor celanalyse op basis van oppervlakte-eiwitten biedt flowcytometrie de mogelijkheid om meerdere markers gelijktijdig per individuele cel te meten. DNA-detectie en genexpressieanalyse worden uitgevoerd via PCR en SNP-genotypering. Scheiding en kwantificering van eiwitten op molecuulmassa gaat via gelelectroforese.
Hoge achtergrond heeft doorgaans één van de volgende oorzaken: onvoldoende blokkering (verhoog BSA- of melkconcentratie, verleng blokkeertijd), onvoldoende wassen (voeg wasronden toe, controleer Tween-concentratie), te hoge antilichaamconcentratie (titreer het detectie-antilichaam), aspecifieke binding van het secundaire antilichaam (gebruik een betere blokkeringsoplossing), of contaminatie van het substraat met peroxidase uit het monster.
Plot de absorptiewaarden van de standaardreeks op de y-as en de bekende concentraties op de x-as. Voor ELISA wordt doorgaans een vierparameter logistische curve (4PL) gefitst met analyticasoftware (bijv. GraphPad Prism, MyAssays, SoftMax Pro). Lees de concentratie van onbekende monsters af op de gecurve. Controleer altijd of de absorptiewaarden binnen het lineaire deel van de standaardcurve (OD 0,2–2,0) vallen; verdun indien nodig.
Een positieve ELISA-uitslag is in de meeste diagnostische contexten een screeningsresultaat en geen definitieve diagnose. Afhankelijk van de toepassing zijn de volgende bevestigingstests gangbaar:
De reden voor bevestigingstesting is tweeledig: ten eerste heeft elke ELISA een bepaalde vals-positiefrate door kruisreactiviteit van antilichamen of matrix-effecten; ten tweede geeft een positieve antilichaam-ELISA alleen aan dat er ooit een immuunrespons is opgetreden, niet noodzakelijk dat er sprake is van een actieve infectie. PCR of kweek is nodig om actieve infectie aan te tonen.
CLIA (chemiluminescent immunoassay) en ELISA meten beide antilichaam-antigeen-binding maar gebruiken een ander detectieprincipe. CLIA gebruikt een chemiluminescent label (bijv. acridinium-ester, isoluminol of AMPPD voor alkalische fosfatase) dat licht uitzendt bij een chemische reactie in plaats van een kleurreactie. De voordelen van CLIA ten opzichte van ELISA zijn:
ELISA heeft op zijn beurt als voordelen dat de benodigde apparatuur (plate reader, washer) aanzienlijk goedkoper is, dat het formaat open en aanpasbaar is voor onderzoeksdoeleinden, en dat er een veel breder aanbod van commerciële kits beschikbaar is. Voor klinische routine-diagnostiek heeft CLIA grotendeels ELISA vervangen; voor onderzoekslaboratoria blijft ELISA het meest flexibele en toegankelijke immunoassay-platform.
Deze pagina is onderdeel van de Labvakhandel kennisbank. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische of klinische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
