Digitale PCR (dPCR) is een variant op de klassieke polymerasekettingreactie waarmee het exacte aantal doelmoleculen in een monster wordt bepaald zonder dat een externe standaardcurve nodig is. De techniek verdeelt het monster in tienduizenden tot miljoenen individuele reactiecompartimenten, voert in elk compartiment een afzonderlijke PCR uit en telt vervolgens het aantal positieve compartimenten. Via de statistiek van Poisson volgt hieruit een absolute molecuultelling. De meest verspreide uitvoering is Droplet Digital PCR (ddPCR), waarbij nanoliterdruppels als reactiecompartiment dienen. ddPCR is genormeerd via ISO 20395:2019.
Digitale PCR is een directe aanvulling op qPCR / real-time PCR: waar qPCR een relatieve meting met standaardcurve vereist, levert dPCR absolute aantallen per volume-eenheid. Dit artikel beschrijft het werkingsprincipe, de platformvarianten, de normering, de toepassingen en de vergelijking met qPCR.
Bij conventionele PCR en bij qPCR vindt de amplificatie plaats in één reactievat met alle templatekopieën tegelijk. De hoeveelheid startmateriaal wordt afgeleid uit de snelheid waarmee het signaal stijgt (Ct-waarde). Die aanpak vereist een externe standaardcurve en is gevoelig voor variaties in amplificatie-efficiëntie en voor inhiberende matrixcomponenten.
Digitale PCR lost dit op door het monster voorafgaand aan de amplificatie te verdelen in een zeer groot aantal miniaturele compartimenten — druppels, putjes of microfluïdische kanalen — zodat elk compartiment gemiddeld nul of één templatekopie bevat. Na de PCR-amplificatie geeft elk compartiment een binair signaal: positief (amplificatie heeft plaatsgevonden) of negatief (geen template aanwezig). Het quotiënt van positieve compartimenten ten opzichte van het totale aantal compartimenten volgt een Poisson-verdeling. Uit die verdeling wordt de gemiddelde bezetting per compartiment berekend, en daarmee het absolute molecuulaantal in het uitgangsmonster — zonder referentiestandaard, zonder Ct-waarde en zonder assumpties over amplificatie-efficiëntie.
De term "digitaal" verwijst niet naar de detectieapparatuur, maar naar het principe: elk reactiecompartiment levert een digitaal signaal (0 of 1). De uiteindelijke kwantificering is een telling.
Droplet Digital PCR, afgekort ddPCR, is de platformvariant waarbij het monster wordt verdeeld in nanoliterdruppels in een water-in-olie-emulsie. Commerciële systemen (Bio-Rad QX200/QX600, RainDrop van RainDance) genereren typisch 10 000–20 000 druppels van elk circa 0,85–2 nl per putje. De werkwijze verloopt in vier stappen:
Naast ddPCR bestaan chip-gebaseerde dPCR-systemen waarbij het monster niet in druppels maar in vaste microfluïdische kamers op een chip wordt verdeeld. Voorbeelden zijn de Fluidigm Digital Array (Quantstudio 3D Digital PCR, Thermo Fisher Scientific) en de QuantStudio Absolute Q. Chip-systemen bieden een hogere geometrische uniformiteit van de compartimenten, waardoor de Poisson-berekening preciezer is bij extreem lage concentraties. Nadelen zijn de hogere kostprijs per run en een lager aantal compartimenten (doorgaans 765–20 000) vergeleken met ddPCR.
De keuze tussen ddPCR en chip-dPCR hangt af van het beoogde aantal compartimenten (en daarmee de dynamische meetrange), de gewenste doorvoer en de beschikbare infrastructuur. Voor de meeste routinetoepassingen biedt ddPCR een optimale balans tussen kostprijs en prestatie.
De kwantificering in dPCR rust op de aanname dat templatekopieën willekeurig over de compartimenten worden verdeeld conform de Poisson-verdeling. Als λ de gemiddelde bezetting per compartiment is en p de fractie positieve compartimenten, dan geldt:
λ = −ln(1 − p)
De absolute concentratie c in het originele monster is vervolgens λ / V, waarbij V het druppelvolume is. Deze berekening is geldig zolang het aandeel positieve druppels niet te hoog is (boven 70–80% begint de nauwkeurigheid te dalen doordat de schatting van dubbele bezetting onbetrouwbaarder wordt). Bij hoge templateconcentraties is een verdunning van het monster noodzakelijk. De precisie van dPCR wordt uitgedrukt als de vertrouwensinterval rondom de puntschatting, afgeleid uit de Poisson-statistiek, en is afhankelijk van het totale aantal geanalyseerde compartimenten.
Droplet Digital PCR is genormeerd in ISO 20395:2019 (Biotechnology — Requirements for evaluating the performance of quantification methods for nucleic acids — dPCR and qPCR). De norm beschrijft prestatiecriteria voor precisie, lineariteit, nauwkeurigheid, specificiteit en robuustheid van dPCR-methoden, met bijzondere aandacht voor de validatie van het partitioneringssysteem en de drempelinstelling voor positief/negatief.
Voor rapportage van dPCR-experimenten in de wetenschappelijke literatuur gelden de dMIQE-richtlijnen (Minimum Information for Publication of Digital PCR Experiments, Huggett et al. 2013, bijgewerkt 2020). De dMIQE-richtlijnen zijn opgesteld als aanvulling op de bekende MIQE-richtlijnen voor qPCR en specificeren onder meer:
Naleving van ISO 20395 en de dMIQE-richtlijnen is voor diagnostische en regulatoire toepassingen van toenemend belang, met name in de klinische moleculaire diagnostiek en bij de kwaliteitscontrole van NGS-bibliotheken.
Net als bij qPCR worden bij dPCR twee hoofdtypen detectiemethoden gebruikt:
Voor diagnostische en regulatoire toepassingen gaat de voorkeur vrijwel altijd uit naar TaqMan-probes vanwege de hogere specificiteit en de reproduceerbarere drempelinstelling.
Digitale PCR en qPCR zijn complementaire technieken. De keuze hangt af van de analytische vraagstelling, de verwachte templateconcentratie en de beschikbare infrastructuur.
Voor routinematige genexpressieanalyse, pathogenendetectie bij middelmatige concentraties en hoge-doorvoertoepassingen blijft qPCR de meest praktische keuze. dPCR is de voorkeursmethode wanneer een standaardcurve ontbreekt, wanneer zeldzame varianten worden gezocht in een groot overschot aan wild-type DNA, of wanneer de matrix sterk inhiberend is.
Een van de meest prominente toepassingen van ddPCR is de detectie van circulerend tumor-DNA (ctDNA) en celvrij DNA (cfDNA) in bloed of plasma. Tumorspecifieke mutaties zijn aanwezig in een zeer lage fractie van het totale cfDNA — soms minder dan 0,1% — wat de detectiegrens van qPCR overschrijdt. ddPCR detecteert betrouwbaar varianten met een allelfractie van 0,01% of lager. Toepassingen zijn vroege tumordetectie, minimale restziekte (MRD)-monitoring, het opsporen van resistentiemutaties en de therapiemonitoring bij oncologische behandeling — alles via niet-invasieve bloedafname, ook wel liquid biopsy genoemd.
Kopieaantalvariaties zijn genomische deleties of duplicaties waarbij het normale diploïde kopieaantal van een gen afwijkt. Nauwkeurige CNV-bepaling vereist absolute kwantificering van zowel het doelgen als een referentiegen. dPCR levert de benodigde precisie zonder dat een CNV-standaardreeks nodig is, wat de methode bij uitstek maakt voor cellijnontwikkeling, prenatale diagnostiek (NIPT) en genetische karakterisering van celkweekcellen. In het kader van CRISPR-Cas9-genoombewerking wordt dPCR ingezet om de kopieaantalintegratie van transgenen te bepalen wanneer qPCR onvoldoende nauwkeurig is.
De Europese regelgeving vereist etikettering van levensmiddelen die meer dan 0,9% genetisch gemodificeerde organismen (GMO's) bevatten. dPCR maakt het mogelijk het exacte aandeel GMO-kopieën in verhouding tot het totale genomische DNA te bepalen zonder afhankelijkheid van gecertificeerde referentiematerialen. De techniek wordt erkend als referentiemethode door het EU-referentielaboratorium voor GMO’s (EURL-GMFF) voor specifieke toepassingen.
Bij next-generation sequencing is de concentratiebepaling van de sequencingbibliotheek een kritische stap: te weinig bibliotheek leidt tot onvoldoende cluster-densiteit; te veel leidt tot overclustering en kwaliteitsverlies. ddPCR meet de molaire concentratie van de bibliotheek direct en absoluut, zonder afhankelijkheid van een standaardcurve. De methode geeft bovendien uitsluitend het adaptergeligeerde, amplificeerbaar DNA als signaal, terwijl de concurrerende spectrofotometrische methode (NanoDrop, Qubit) ook vrij-zwevende adaptermoleculen meebepaalt.
Bij lage virusladingen — relevant bij de behandeling van HIV, hepatitis B en C, en bij SARS-CoV-2-diagnostiek — biedt dPCR een hogere nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid dan qPCR, juist omdat absolute kwantificering niet afhankelijk is van een standaard. De methode is in toenemende mate opgenomen in klinische laboratoriumprotocollen, met name voor therapiemonitoring bij antivirale behandeling.
dPCR wordt ingezet voor de kwantificering van pathogenen en indicatororganismen in drinkwater, oppervlaktewater en voedsel — toepassingen waarbij de matrixcomplexiteit (humuszuren, eiwitten, polysacchariden) sterk inhiberend kan werken voor conventionele qPCR. De partitionering verdunt de inhibitoren over de compartimenten, waardoor het effect per druppel beperkt is en de telling betrouwbaar blijft.
Bij de kwaliteitscontrole van mRNA-vaccins en mRNA-therapeutica wordt dPCR ingezet voor de absolute kwantificering van de RNA-titer na omzetting naar cDNA via reverse transcriptie (RT-dPCR). In combinatie met de RNA-kwaliteitscontrole-methoden beschreven in het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse biedt RT-dPCR een volledig kwantitatief kwaliteitsprofiel zonder standaard.
Wanneer RNA de doelmolecule is, wordt net als bij RT-qPCR een reverse-transcriptiestap voorafgaand aan de digitale PCR uitgevoerd. Het verkregen cDNA wordt vervolgens als template voor de ddPCR gebruikt. RT-dPCR is de methode voor genexpressieanalyse waarbij de absolute expressieniveaus tussen experimenten of laboratoria direct vergelijkbaar moeten zijn, zonder normalisatie via referentiegenen. De nauwkeurigheid van RT-dPCR is sterk afhankelijk van de RNA-integriteit (RIN-score) en de keuze van reverse transcriptase; voor hoge nauwkeurigheid worden thermostabiele, hoge-processiviteits-enzymen aanbevolen. Zie het artikel over RNA-isolatie voor de isolatiemethoden, kwaliteitscontrole (A260/A280, RIN) en RNase-preventie.
Moderne ddPCR-systemen ondersteunen multiplex-detectie via meerdere fluorescentiekleurkanalen (doorgaans twee tot vijf kanalen). Door TaqMan-probes met verschillende fluoroforen te combineren, worden meerdere doelsequenties simultaan gekwantificeerd. Bidimensionele amplitude-analyse — het uitzetten van de FAM-intensiteit versus de HEX-intensiteit per druppel — maakt het mogelijk zelfs overlappende amplitudes te scheiden en vier targets in twee kanalen te onderscheiden (duplexing met amplitudeverschil). Multiplex dPCR wordt toegepast bij CNV-analyses waarbij het doelgen en het referentiegen gelijktijdig worden gemeten, bij zeldzame-variantendetectie naast wild-type achtergrond en bij pathogeenpanelen.
De kwaliteit en zuiverheid van het invoer-DNA zijn bepalend voor de nauwkeurigheid van dPCR. De voornaamste aandachtspunten zijn:
De normering rond digitale PCR ontwikkelt zich snel. De relevante documenten voor laboratoria die dPCR in een gereguleerde omgeving toepassen:
Voor laboratoria die werken onder ISO 17025 of GLP, vormt ISO 20395 het kader voor de methodische validatie van dPCR-assays.
dPCR is de overkoepelende term voor alle vormen van digitale PCR. ddPCR (Droplet Digital PCR) is de specifieke platformvariant waarbij het monster wordt verdeeld in nanoliterdruppels in een water-in-olie-emulsie. Chip-gebaseerde dPCR-systemen zijn een alternatieve uitvoering. In de praktijk worden dPCR en ddPCR regelmatig als synoniemen gebruikt, maar technisch gezien is ddPCR een subtype van dPCR.
Niet per definitie. De detectiegevoeligheid van dPCR is bij hoge templateconcentraties vergelijkbaar met qPCR. Het onderscheidende voordeel van dPCR zit in de detectie van zeldzame varianten bij lage allelfrequenties (onder 1%) en in situaties waar geen betrouwbare standaardcurve beschikbaar is. Bij hoge concentraties en brede dynamische range is qPCR praktischer.
Ja. Via een voorafgaande reverse-transcriptiestap (RT-dPCR) wordt RNA omgezet naar cDNA, waarna de ddPCR-analyse plaatsvindt. RT-dPCR wordt onder meer toegepast voor genexpressieanalyse zonder referentiegennormalisatie, mRNA-kwantificering in therapeutische producten en de detectie van RNA-virussen. De RNA-kwaliteitsborging (RIN-score, A260/A280) beschreven in het artikel over RNA-isolatie is ook voor RT-dPCR onverminderd van toepassing.
Naast het ddPCR-instrument en de bijbehorende druppelgenerator zijn nodig: speciale ddPCR-mastermix (geoptimaliseerd voor emulsie-stabiliteit en druppelgeneratie), TaqMan-probes of EvaGreen-kleurstof, primers, ddPCR-cartridges en bijbehorende dichtingsfolie, PCR-afdichtfolies en standaard laboratoriumverbruiksmaterialen (pipetpunten, microcentrifugebuizen, nucleasevrij water). Voor RT-dPCR is aanvullend een reverse-transcriptasemix nodig.
Ja, mits de methode is gevalideerd conform de geldende normen. ISO 20395 biedt het raamwerk voor methodontwikkeling en validatie. Voor klinisch-diagnostisch gebruik gelden aanvullend de eisen van ISO 15189 (medische laboratoria) en de CLSI-richtlijnen. Een toenemend aantal klinische laboratoria heeft ddPCR-methoden geïmplementeerd voor viruslading, ctDNA en MRD-monitoring.
Voor ddPCR is specifieke apparatuur nodig die afwijkt van de standaard qPCR-opstelling:
Voor chip-gebaseerde dPCR-systemen zijn de druppelgenerator en thermocycler geïntegreerd in één instrument. Bekijk het assortiment PCR-apparatuur en biotechnologie-apparatuur of neem contact op voor advies over de juiste dPCR-oplossing voor uw toepassing.
Digitale PCR sluit inhoudelijk aan bij de artikelen over qPCR / real-time PCR, next-generation sequencing (NGS), DNA-isolatie en SNP-genotypering en PCR-technieken. Voor de validatie van dPCR-methoden in een gereguleerde omgeving verwijzen wij naar de artikelen over validatie van analytische methoden en ISO 17025-accreditatie.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
