Kwantitatieve PCR (qPCR), ook wel real-time PCR genoemd, is een moleculaire techniek waarmee specifieke DNA- of RNA-sequenties in een monster worden aangetoond én gekwantificeerd. Anders dan bij conventionele PCR wordt de amplificatie niet achteraf zichtbaar gemaakt op een gel, maar gevolgd tijdens elke cyclus via een fluorescent signaal. Dit maakt qPCR tot de gouden standaard voor nauwkeurige, reproduceerbare kwantificering van nucleïnezuren in onderzoek, diagnostiek en kwaliteitscontrole.
Conventionele PCR (end-point PCR) vermenigvuldigt een DNA-fragment en toont het resultaat aan het einde van de reactie, doorgaans via gelelectroforese. Het geeft een kwalitatief antwoord: aanwezig of afwezig. qPCR meet het fluorescentiesignaal na iedere cyclus en koppelt de meetwaarde aan de hoeveelheid startmateriaal. Dit maakt kwantificering mogelijk zonder gel, met een lager besmettingsrisico en een grotere dynamische meetrange (doorgaans 6–7 log-eenheden). Lees meer over de gel-stap in ons artikel over gelelectroforese.
Elke qPCR-cyclus bestaat uit drie temperatuurstappen die worden herhaald, typisch 35 tot 45 keer:
Er zijn twee veelgebruikte methoden om het PCR-product te detecteren:
De Ct-waarde (Cycle threshold, ook wel Cq-waarde) is het cyclusnummer waarbij de fluorescentie een vooraf ingestelde drempelwaarde overschrijdt. Hoe lager de Ct, hoe meer startmateriaal er in het monster aanwezig was. Ct-waarden worden gebruikt voor zowel absolute als relatieve kwantificering:
Ct-waarden tussen 20 en 30 worden doorgaans beschouwd als betrouwbaar en kwantificeerbaar. Waarden boven 35 liggen dicht bij de detectiegrens en vereisen voorzichtige interpretatie. Ct-waarden onder 15 kunnen duiden op contaminatie of een te hoge templateconcentratie. Een PCR-efficiëntie tussen 90% en 110% wordt als acceptabel beschouwd; buiten dit bereik is heroptimalisatie van primers of reactieomstandigheden aangewezen.
Wanneer RNA (bijv. mRNA) de starttemplate is, wordt eerst een reverse-transcriptie (RT) uitgevoerd met het enzym reverse transcriptase. Het RNA wordt omgezet in complementair DNA (cDNA), dat vervolgens dient als template voor de qPCR-reactie. De volledige werkwijze heet RT-qPCR (of RT-PCR in informeel gebruik). Volgens de MIQE-richtlijnen is RT-qPCR de correcte afkorting voor deze gecombineerde methode; RT-PCR verwijst strikt genomen uitsluitend naar de reverse-transcriptiestap.
RT-qPCR is de standaardmethode voor genexpressieanalyse, het aantonen van RNA-virussen (zoals SARS-CoV-2) en transcriptoomonderzoek.
De begrippen qPCR, real-time PCR en RT-PCR worden in de praktijk door elkaar gebruikt. Ter verduidelijking:
Digitale druppel-PCR (ddPCR, digital droplet PCR) verdeelt het monster in tienduizenden nanoliterdruppels, voert de PCR in elke druppel uit en telt het aantal positieve druppels. Dit levert een absolute molecuultelling zonder standaardcurve. ddPCR is gevoeliger en robuuster dan qPCR bij lage template-concentraties en bij inhiberende matrices, maar is ook duurder en bewerkelijker. Voor routinematige genexpressie en diagnostische toepassingen blijft qPCR de meest toegepaste methode.
qPCR wordt breed ingezet in laboratoria voor onderzoek en kwaliteitscontrole:
Primers zijn korte, enkelvoudige oligonucleotiden (doorgaans 18–25 basen) die specifiek hybridiseren met de doelsequentie. De keuze van primers is bepalend voor de specificiteit en efficiëntie van de reactie. Aandachtspunten zijn smelttemperatuur (Tm, idealiter 58–62 °C), GC-gehalte (40–60%), afwezigheid van zelfcomplementariteit en amplicon-lengte (100–200 bp voor optimale efficiëntie).
In principe kunnen voor qPCR dezelfde primers worden gebruikt als voor conventionele PCR, mits ze aan bovenstaande criteria voldoen. Voor TaqMan-assays is additioneel een specifieke sonde nodig. Bestaande conventionele PCR-primers hoeven niet per definitie optimaal te zijn voor qPCR: validatie van efficiëntie via een standaardcurve is altijd aan te raden.
qPCR detecteert nucleïnezuren, niet levende cellen. DNA van dode cellen kan na cellyse nog worden geamplificeerd. Voor onderscheid tussen levende en dode cellen wordt propidiummonoazide (PMA) of ethidiummonoazide (EMA) gebruikt: deze reagentia binden covalent aan het DNA van cellen met beschadigde membranen en blokkeren amplificatie, zodat alleen DNA van levende cellen gedetecteerd wordt.
qPCR meet primair DNA. Voor mRNA-kwantificering is een voorafgaande reverse-transcriptiestap nodig (RT-qPCR). Het is ook mogelijk om genomisch DNA en cDNA in dezelfde assay te onderscheiden door primers te ontwerpen die een intron overspannen: het cDNA-amplicon is dan kleiner dan het genomisch DNA-amplicon.
Het amplificatieplot toont per well de fluorescentie (y-as) uitgezet tegen het cyclusnummer (x-as). De curve doorloopt drie fasen: een basislijnfase (ruis), een exponentiële fase (efficiënte vermenigvuldiging) en een plateaufase (verzadiging). De Ct-waarde is het punt waar de curve de drempellijn snijdt. Curves met een gelijke vorm maar een lagere Ct bevatten meer startmateriaal.
Nee. RT-PCR staat voor Reverse Transcription PCR en verwijst naar de omzetting van RNA naar cDNA. qPCR is de kwantitatieve detectiemethode. Beide worden vaak gecombineerd (RT-qPCR) maar zijn afzonderlijke stappen. In alledaags laboratoriumjargon worden de termen echter frequent door elkaar gebruikt, wat tot verwarring kan leiden.
Voor qPCR zijn naast een real-time thermocycler de volgende verbruiksmaterialen nodig: PCR-platen of tubes geschikt voor de gebruikte cycler (wit voor maximale reflectie bij SYBR Green, transparant voor smeltcurveanalyse), optische afdichtfolie, nucleasevrij water, een mastermix (met polymerase, dNTPs en buffer), primers en optioneel sondes. Monstervoorbereiding vereist doorgaans pipetten, pipetpunten, centrifugebuizen en een geschikte nucleïnezuurisolatiekit. Bekijk het assortiment PCR-platen en microtiterplaten of neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw toepassing.
Voor meer achtergrond over moleculaire biologie en de context van qPCR, zie ook ons artikel over moleculaire biologie en biotechnologie.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
