Next-generation sequencing (NGS) — ook wel massively parallel sequencing of hoogdoorvoer-sequencing genoemd — is een verzameling sequencingtechnologieën waarmee miljoenen tot miljarden DNA- of RNA-fragmenten tegelijkertijd worden gelezen. Waar klassieke Sanger-sequencing één fragment per reactie verwerkt, paralleliseert NGS het proces op massale schaal. Dit maakt het mogelijk om in één analyse een volledig genoom, transcriptoom of metagenoom in kaart te brengen tegen een fractie van de tijd en kosten van vroegere methoden.
NGS is de verzamelnaam voor alle sequencingtechnologieën die na de klassieke Sanger-methode zijn ontwikkeld en die massale parallelisering mogelijk maken. In plaats van één DNA-fragment per reactie worden bij NGS miljoenen fragmenten tegelijkertijd gelezen, waardoor een volledig menselijk genoom in één à twee dagen volledig in kaart kan worden gebracht. De drie generaties van DNA-sequencing lopen als volgt:
Ongeacht het platform verloopt een NGS-workflow in vier opeenvolgende fasen:
NGS is geen enkelvoudige technologie maar een breed spectrum van platforms, elk met eigen voor- en nadelen op het gebied van leeslengte, nauwkeurigheid, doorvoer en kosten.
Illumina is het meest gebruikte NGS-platform wereldwijd, maar NGS en Illumina zijn niet synoniem: NGS is de overkoepelende technologiecategorie, Illumina is één specifieke fabrikant en platformfamilie binnen die categorie. Illumina gebruikt sequencing-by-synthesis (SBS): fluorescent gelabelde nucleotiden worden één voor één ingebouwd, en na elke inbouwstap wordt de fluorescentiekleur gefotografeerd. Leeslengtes zijn 75–300 basenparen (bp) per read. Voordelen: zeer hoge nauwkeurigheid (>99,9% per base), hoge doorvoer (tot 6 Tbp per run op een NovaSeq), lage kostprijs per base. Nadelen: korte reads bemoeilijken de assemblage van repetitieve genomische regio's en structurele varianten. Alternatieve NGS-platforms zijn onder meer Ion Torrent (Thermo Fisher), BGI/MGI en Complete Genomics.
Twee platforms domineren het long-read segment:
De betrouwbaarheid van NGS-data wordt uitgedrukt in twee maten: kwaliteit per base en sequencingdiepte (coverage).
Elke base in een NGS-read krijgt een Phred-kwaliteitsscore (Q-score), gedefinieerd als Q = −10 · log₁₀(P), waarbij P de geschatte foutkans is. Een Q20 komt overeen met een foutkans van 1 op 100 (99% nauwkeurigheid), Q30 met 1 op 1.000 (99,9%) en Q40 met 1 op 10.000 (99,99%). Bij Illumina-data wordt typisch geëist dat >80% van de basen een Q30 of hoger haalt. Voor klinische toepassingen liggen de drempels nog hoger en wordt per locus gerapporteerd.
De betrouwbaarheid van NGS-resultaten is sterk afhankelijk van de sequencingdiepte: het gemiddeld aantal reads dat elke positie in het genoom afdekt. Vuistregels per toepassing:
Sanger-sequencing — ontwikkeld in 1977 door Frederick Sanger — is nog steeds de goudstandaard voor de verificatie van korte, bekende sequenties. Het principe berust op ketenterminatie met dideoxynucleotiden en capillaire elektroforese. NGS vervangt Sanger niet volledig; de twee methoden vullen elkaar aan:
In de praktijk wordt NGS gebruikt voor brede screening en ontdekking; Sanger wordt ingezet voor gerichte bevestiging van specifieke varianten en als kwaliteitscontrole op klonering of mutagenese.
De voornaamste voordelen van NGS zijn de massale parallelisering (miljoenen reads in één run), de sterk verlaagde kostprijs per gelezen nucleotide en de mogelijkheid om het volledige genoom, transcriptoom of metagenoom in één analyse te bestrijken. Sanger is beperkt tot één fragment per capillair per run. NGS detecteert daarnaast varianten met lage allelfrequenties (<1% bij hoge coverage), wat bij Sanger praktisch onmogelijk is. Sanger behoudt zijn voordeel bij de validatie van individuele, vooraf bekende varianten, waarvoor de hoge nauwkeurigheid en eenvoudige interpretatie de voorkeur geven.
PCR en NGS zijn complementaire technieken met een fundamenteel verschillend doel. PCR ampliceert een specifiek, vooraf bekend doelsequentie en geeft aan of dat doelsequentie aanwezig is. NGS leest de basenvolgorde van miljoenen fragmenten tegelijk en brengt daarmee zowel bekende als onbekende varianten, fusiegenen, expressieniveaus en microbiële diversiteit in kaart zonder voorafgaande kennis van het doelsequentie. NGS vervangt PCR dan ook niet: in de NGS-workflow wordt PCR juist gebruikt als amplificatiestap (library preparation, amplicon panels). Voor eenvoudige gerichte detectie van bekende targets — zoals pathogenen of specifieke mutaties — blijft PCR sneller, goedkoper en laagdrempeliger.
De keuze van de NGS-methode hangt af van de biologische vraagstelling:
NGS heeft de klinische genetica en moleculaire diagnostiek ingrijpend veranderd:
Voor klinisch gebruik in Europa moeten NGS-assays voldoen aan de In Vitro Diagnostic Regulation (IVDR, EU 2017/746), die strenge eisen stelt aan analytische en klinische validatie. Analytische validatie omvat bepaling van nauwkeurigheid, precisie, gevoeligheid, specificiteit, lineariteit en detectielimiet (LoD). Naast IVDR sluiten ISO 15189 (medische laboratoria) en CLSI-richtlijnen aan op klinische NGS-praktijk. Voor publicatie van NGS-onderzoek hanteren veel tijdschriften de MINSEQE-richtlijnen (Minimum Information about a high-throughput SEQuencing Experiment), die rapporteerbare elementen zoals platform, leeslengte, coverage, alignment-strategie en variant-calling-parameters voorschrijven.
De data-analyse van NGS volgt een gestandaardiseerde pijplijn met vaste bestandsformaten:
Vanwege de omvang van NGS-datasets (typisch 50–500 GB per genoom) wordt de analyse uitgevoerd op high-performance computing clusters of in cloud-omgevingen (AWS, Google Cloud, Azure) met platformspecifieke services zoals Illumina BaseSpace, DNAnexus of Terra.
Een volledig NGS-laboratorium vereist apparatuur en verbruiksartikelen voor elk van de vier werkstroomfasen:
Voor single-cell RNA-sequencing (scRNA-seq) worden cellen voorafgaand aan de bibliotheekpreparatie fenotypisch geselecteerd via celsortering via FACS; index-sortering koppelt het doorstroomfenotype direct aan de positie in de microplaat voor downstream transcriptoomanalyse.
Platforms zoals 10x Genomics Chromium maken gebruik van microfluidische druppeltechnologie om individuele cellen in gel bead-in-emulsion (GEM)-druppels in te sluiten voor single-cell bibliotheekpreparatie.
Bekijk het volledige assortiment in de categorieën biotechnologie & moleculaire biologie en centrifugebuizen & reactievaatjes, of neem contact op voor advies over de juiste verbruiksartikelen voor uw NGS-workflow.
Voor de epigenomische toepassing van NGS waarbij geïmmunoprecipiteerd chromatine-DNA als invoer dient, zie het artikel over chromatine-immunoprecipitatie (ChIP).
Voor het gebruik van NGS als detectiemethode bij proximity ligation assays voor 3D-genoomstructuuranalyse (Hi-C, ChIA-PET, HiChIP), zie het artikel over proximity ligation assays (Hi-C, 3C).
De voornaamste nadelen van NGS zijn de complexe bio-informaticaworkflow (alignment, variantcalling, annotatie), de vereiste computercapaciteit voor dataopslag en -analyse, en de interpretatie-uitdaging bij varianten van onbekende klinische betekenis (VUS). Short-read NGS heeft daarnaast moeite met repetitieve genomische regio's, structurele varianten en lange homopolymere sequenties. De initiële apparatuurkosten voor een NGS-platform zijn hoog, hoewel de kostprijs per gelezen base sterk is gedaald. Voor kleine aantallen monsters of de validatie van enkele varianten blijft Sanger-sequencing eenvoudiger en goedkoper.
De doorlooptijd van een NGS-analyse hangt sterk af van het platform en de toepassing. De sequencingrun zelf duurt op een Illumina NovaSeq voor whole genome sequencing doorgaans 24–48 uur; op een Oxford Nanopore MinION kan real-time sequencing al na enkele uren bruikbare data opleveren. De totale doorlooptijd inclusief library preparation (4–8 uur), sequencing en bio-informaticaanalyse loopt in de praktijk op tot 2–7 werkdagen voor een klinisch WGS-rapport. Gerichte amplicon panels kunnen in 1–2 werkdagen worden afgerond.
De kostenvergelijking tussen Illumina en Oxford Nanopore (ONT) hangt sterk af van de schaal en het toepassingstype. Bij hoge doorvoer — grote aantallen genomen per run — is Illumina per gelezen gigabasepaar aanzienlijk goedkoper: de reagentkosten voor een NovaSeq-run zijn laag per sample als de flowcel volledig wordt benut. ONT-flowcellen hebben een hogere kostprijs per run maar bieden een lager instapdrempel: de MinION is een compact, betaalbaar apparaat dat geen grote infrastructuur vereist. Voor toepassingen waarbij snel resultaat nodig is bij een klein aantal samples — uitbraakonderzoek, point-of-care diagnostiek — is ONT kostenefficiënter. Voor grootschalige populatiegenomics of klinische WGS in een gecentraliseerd laboratorium is Illumina goedkoper per sample. De aanschafkosten van de apparatuur zijn bij ONT (MinION: enkele duizenden euro’s) veel lager dan bij Illumina (NovaSeq: meerdere honderdduizenden euro’s), wat het voor kleinere laboratoria aantrekkelijk maakt om met nanopore-sequencing te starten.
Ondanks de komst van NGS heeft Sanger-sequencing zijn positie als goudstandaard voor de bevestiging van individuele, vooraf bekende varianten behouden. De redenen zijn praktisch. Sanger heeft geen bibliotheekvoorbereiding nodig: één PCR-reactie en één sequencingreactie volstaan om een specifiek fragment van 600–1000 bp te lezen — een doorlooptijd van enkele uren. De ruwe data — een elektroferogram — is direct visueel interpreteerbaar zonder complexe bio-informaticaworkflow. De nauwkeurigheid per base is bij Sanger inherent hoog en de foutenaard (ruis in het elektroferogram) is goed begrepen en eenvoudig te herkennen. Bij NGS vereist de interpretatie van een variant altijd een kwaliteitsdrempel op coverage en Phred-score, en moet de variant worden beoordeeld in het kader van de volledige bio-informaticapijplijn. Voor de validatie van een specifieke puntmutatie die in een NGS-panel als positief is gerapporteerd — met klinische consequenties voor de patiënt — biedt Sanger een snelle, goedkope en transparante bevestiging. NGS vervangt Sanger dan ook niet, maar verschuift het gebruik naar validatie en specifieke gerichte diagnostiek.
NGS-analyses kunnen vier fundamentele typen genetische variatie in kaart brengen, die elk een eigen detectiestrategie en minimale sequencingdiepte vereisen. Enkelvoudige nucleotidevarianten (SNV) zijn puntmutaties waarbij één base is vervangen; ze worden betrouwbaar gedetecteerd bij een coverage van 30× of hoger voor kiembaanvarianten en 200× of hoger voor somatische varianten met lage allelfrequentie. Inserties en deleties (indels) zijn toevoegingen of verwijderingen van één tot enkele tientallen basenparen; kleine indels worden goed gedetecteerd door short-read NGS, maar grotere indels in repetitieve regio's vereisen long-read sequencing. Kopieaantalvariaties (CNV) zijn vermeerderingen of verminderingen van grotere genomische segmenten (kilobases tot megabases); ze worden afgeleid uit de verhouding van readdiepte over chromosomale regio’s, waarvoor WGS of dedicate CNV-panels worden ingezet. Structurele varianten (SV) zijn grootschalige herschikkingen zoals translocaties, inversies en grote inserties of deleties; short-read NGS detecteert deze met beperkte gevoeligheid via discordante readparen, terwijl long-read platforms (PacBio, ONT) SVs direct en met hogere resolutie kunnen aantonen. De keuze van sequencingstrategie en coverage is daarmee direct afhankelijk van het type variatie dat klinisch of wetenschappelijk relevant is.
De kosten per sequencing-experiment variëren sterk per toepassing, platform en laboratoriumopzet. Whole genome sequencing (30× coverage) kost in 2024 op grote platforms minder dan 200 dollar per sample aan reagentkosten, maar de totale prijs per klinisch rapport — inclusief library preparation, apparatuurafschrijving, data-opslag en bio-informatica — ligt aanzienlijk hoger. Gerichte panels voor oncologie of erfelijke aandoeningen zijn per sample goedkoper. De kostprijs per gelezen megabasepaar is met NGS meerdere orden van grootte lager dan met Sanger-sequencing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
