RNA-isolatie is de techniek waarmee ribonucleïnezuur (RNA) wordt vrijgemaakt uit cellen of weefsel en wordt gezuiverd van eiwitten, lipiden, DNA en andere cellulaire componenten. Het gezuiverde RNA vormt het startmateriaal voor vrijwel alle RNA-gebaseerde analyses: genexpressiemeting via RT-qPCR, transcriptoomonderzoek via RNA-seq, Northern blot en de ontwikkeling en kwaliteitscontrole van mRNA-therapeutica. De techniek stelt hoge eisen aan de werkwijze: RNA is van nature instabiel en gevoelig voor afbraak door alomtegenwoordige ribonucleasen (RNasen), waardoor strikte voorzorgsmaatregelen noodzakelijk zijn. Dit artikel beschrijft de principes, methoden, kwaliteitscontrole en praktische aandachtspunten van RNA-isolatie en de aansluitende RNA-analyse.
Ribonucleïnezuur is een enkelvoudig-strengs polymeer van ribonucleotiden dat een centrale rol speelt in de informatieoverdracht van DNA naar eiwit. In de cel zijn drie hoofdtypen RNA aanwezig:
Daarnaast zijn talrijke regulatoire RNA-soorten aanwezig, waaronder microRNA (miRNA), lange niet-coderende RNA's (lncRNA's), small nuclear RNA (snRNA) en circulaire RNA's (circRNA). Deze moleculen spelen een rol in post-transcriptionele regulatie, splicing en epigenetische processen en vormen het onderwerp van groeiend onderzoek.
De reden om RNA te isoleren is directe toegang tot de functionele toestand van de cel: het transcriptoom weerspiegelt welke genen actief zijn, in welke mate, en hoe de cel reageert op omgevingssignalen, ziekte of behandeling. Anders dan het genoom is het transcriptoom dynamisch en celtype-specifiek. RNA-isolatie is daarmee de eerste stap in genexpressieanalyse, biomarkeronderzoek, transcriptoomsequencing, diagnostiek van RNA-virussen en de kwaliteitscontrole van mRNA-vaccins en -therapeutica.
Een RNA-isolatieprotocol bestaat doorgaans uit drie opeenvolgende stappen: cellyse, zuivering en elutie.
De cel moet worden opengebroken om het RNA vrij te geven. Tegelijk moeten endogene RNasen onmiddellijk worden geïnactiveerd, want deze enzymen zijn uiterst stabiel en actief, en beginnen RNA direct te degraderen zodra de celmembraan wordt verbroken.
Bij de fenol-chloroform-extractiemethode (TRIzol of vergelijkbare reagentia) worden cellen of weefsel gehomogeniseerd in een oplossing van zuur fenol, guanidinium-isothiocyanaat (GITC) en chloroform. GITC denatureert eiwitten en inactiveert RNasen; na centrifugatie wordt de waterfase — die RNA bevat — gescheiden van de organische fase (eiwitten, lipiden) en het interfasevlak (DNA). RNA wordt vervolgens uit de waterfase neergeslagen met isopropanol.
Bij silica-kolommethoden worden cellen gelyseerd in een chaotrope lysisbuffer (GITC of guanidinium-HCl) die RNA bindt aan een silicamembraan. DNA en eiwitten worden weggewassen. Het principe is vergelijkbaar met DNA-isolatie via silicakolom, met dit verschil dat de pH en zoutconcentratie worden afgestemd op RNA-binding en dat een DNase I-behandeling op de kolom gebruikelijk is om genomisch DNA te verwijderen.
Bij mechanische cellyse worden cellen fysiek gefragmenteerd via beadmilling, homogenisatie met rotor-stator of gebruik van vloeibare stikstof (voor weefselmonsters). Mechanische lyse wordt gecombineerd met chaotrope buffers voor onmiddellijke RNase-inactivatie. De keuze van lysemethode is afhankelijk van het monstertype: cultuurcellen laten zich eenvoudig lyseren met lysisbuffer, terwijl vezelrijk weefsel (spier, huid) mechanische verstoring vereist.
Na lyse wordt RNA gezuiverd van eiwitten, lipiden, zout en genomisch DNA. Bij kolommethoden wordt dit bereikt via een wasreeks met ethanolhoudende buffers. Bij de fenol-chloroform-methode vindt zuivering plaats door de scheiding van waterfase en organische fase, gevolgd door isopropanol-precipitatie en een wasstap met 70 % ethanol.
Een DNase I-behandeling is sterk aan te raden bij gebruik van RNA als template voor RT-qPCR: residueel genomisch DNA kan amplificeren en tot valspositieve resultaten leiden. DNase I kan op de silicakolom worden toegepast (on-column digestion) of in oplossing na elutie. EDTA inactiveert DNase I na de behandeling; DNase-vrij water is voor elutie vereist.
Voor de selectieve isolatie van mRNA wordt gebruikgemaakt van oligo-dT-cellulose of magnetische oligo-dT-beads. Deze binden selectief aan de poly-A-staart van mRNA, terwijl rRNA en tRNA doorlopen. Dit is de standaardmethode voor mRNA-zuivering ten behoeve van cDNA-synthese en RNA-seq. Alternatief wordt rRNA actief verwijderd (rRNA-depletie) via hybridisatie met complementaire oligonucleotiden, waarna het rRNA-hybridisatieproduct wordt afgevangen. rRNA-depletie is noodzakelijk bij RNA-isolatie uit bacteriën (die geen poly-A-staarten hebben) en voor de analyse van niet-coderende RNA's.
Het gezuiverde RNA wordt geëlueerd met RNase-vrij water of TE-buffer (10 mmol/l Tris, pH 7,0–8,0 met 0,1 mmol/l EDTA). EDTA chelateert tweewaardige kationen die als cofactor fungeren voor RNasen. RNA-oplossingen worden opgeslagen bij −70 tot −80 °C voor langetermijnbewaring, of bij −20 °C voor gebruik binnen enkele weken. Herhaaldelijk invriezen en ontdooien degradeert RNA; werk bij voorkeur met aliquots.
RNA-isolatie is technisch veeleisender dan DNA-isolatie om vier hoofdredenen:
Strikte RNase-vrije werkomstandigheden zijn de basis van elke succesvolle RNA-isolatie:
Ethanol speelt een centrale rol in zowel de silicakolom- als de precipitatiemethode. In de kolommethode worden wasstappen met 70–75 % ethanol gebruikt om zoutverontreinigingen en losgekoppeld RNA te verwijderen, terwijl het RNA gebonden blijft aan de silicamembraan. Een te lage ethanolconcentratie kan RNA voortijdig van het silicamembraan elueren; een te hoge ethanolconcentratie verwijdert zoutresten onvoldoende. Bij de precipitatiemethode (na fenol-chloroform) wordt RNA neergeslagen met isopropanol en vervolgens gewassen met 70–75 % ethanol om zoutresten te verwijderen vóór indrogen en opname in water. Volledig droog RNA is moeilijker te resuspenderen; een korte droogtijd van 5–10 minuten bij kamertemperatuur is optimaal.
Isopropanol (2-propanol) wordt gebruikt voor de precipitatie van RNA na fenol-chloroform-extractie. Toevoeging van isopropanol (gelijk volume) aan de waterige RNA-fase, gevolgd door incubatie op ijs of bij −20 °C en centrifugatie, resulteert in een RNA-pellet. Isopropanol is effectiever dan ethanol bij kleinere volumes en vermindert het meeslepen van zout. Na precipitatie wordt het pellet gewassen met 70–75 % ethanol (zie boven) en kort gedroogd vóór resuspensie.
De kwaliteit van geïsoleerd RNA bepaalt in hoge mate de betrouwbaarheid van de downstream analyse. Twee parameters zijn cruciaal: zuiverheid en integriteit.
UV-absorptiemeting bij 260 nm (A260) geeft de RNA-concentratie: 1 OD260 = 40 µg/ml voor enkelvoudig-strengs RNA. De A260/A280-ratio is de maat voor eiwitverontreiniging: zuiver RNA heeft een A260/A280-waarde van 1,9–2,1. Een lagere waarde duidt op eiwitcontaminatie of fenolresten. De A260/A230-ratio beoordeelt organische verontreinigingen: zuiver RNA heeft een A260/A230-waarde van 2,0–2,2; lagere waarden wijzen op fenol-, EDTA- of guanidinium-resten. Meer over absorptiemetingen en de Beer-Lambertrelatie staat beschreven in het artikel over UV/Vis-spectrofotometrie.
De RNA-integriteitsscore (RIN, RNA Integrity Number) is een gestandaardiseerde maat voor de kwaliteit van RNA, bepaald op basis van het verhoudingspatroon van ribosomale 28S- en 18S-RNA-banden. Een RIN van 10 duidt op intact RNA; een RIN van 1–2 op volledig gedegradeerd RNA. RIN wordt bepaald met een microfluidics-systeem (zoals het Agilent Bioanalyzer of TapeStation), waarbij een klein volume (1 µl) wordt geanalyseerd op een chip. Conventionele beoordeling op een agarosegel (1 % formaldehyde-agarosegel of denaturerende gel) geeft een visuele indicatie: twee scherpe banden (28S en 18S in verhouding 2:1) duiden op intact totaal-RNA. RNA-integriteitsbeoordeling en RIN-bepaling zijn ook beschreven in het artikel over gelelektroforese.
Fluorimetrie met RNA-selectieve kleurstoffen (bijv. RiboGreen, Qubit RNA HS) is gevoeliger dan spectrofotometrie bij lage RNA-concentraties en is niet gevoelig voor DNA-contaminatie. Qubit-fluorimeters zijn de standaard in NGS-workflows. Lees meer over fluorescente detectiemethoden in het artikel over fluorescentie-spectroscopie.
Na succesvolle isolatie en kwaliteitscontrole kan het RNA voor diverse downstream-analyses worden ingezet:
De meest gebruikte downstream-toepassing van RNA-isolatie. RNA wordt omgezet naar cDNA via reverse transcriptie, waarna specifieke transcripten worden gekwantificeerd met qPCR / real-time PCR. RT-qPCR is de gouden standaard voor het meten van genexpressieniveaus, het aantonen van RNA-virussen (SARS-CoV-2, HIV, influenza) en transcriptoomonderzoek in kleine aantallen doelgenen. Voor betrouwbare resultaten zijn stabiele referentiegenen, meegenomen negatieve controles (NTC, NRT) en gevalideerde efficiëntie per primer-set vereist (MIQE-richtlijnen).
Bij RNA-seq wordt totaal-RNA of poly-A-geselecteerd mRNA omgezet naar een cDNA-bibliotheek en vervolgens gesequenced via next-generation sequencing (NGS). RNA-seq maakt een transcriptoom-brede meting mogelijk van genexpressieniveaus, alternatieve splicing, fusiegenen, allel-specifieke expressie en niet-coderende RNA's. De kwaliteitseis voor RNA-seq is strenger dan voor RT-qPCR: RIN ≥ 8 wordt aanbevolen voor standaard poly-A-RNA-seq; voor gedegradeerde monsters (bijv. FFPE-weefsel) zijn speciale low-input of ribo-depletieprotocollen beschikbaar.
Bij Northern blot wordt geïsoleerd RNA gescheiden op een denaturerende agarosegel, overgebracht naar een membraan en gedetecteerd met een gelabelde probe. Northern blot geeft direct informatie over de grootte van het RNA-transcript en semi-kwantitatieve expressie-informatie. De techniek wordt nog ingezet voor alternatieve splicinganalyse en validatie van RNA-seq-resultaten, maar heeft grotendeels plaatsgemaakt voor RT-qPCR en RNA-seq vanwege de lagere gevoeligheid en grotere hoeveelheid benodigde RNA (1–20 µg per lane).
Voor moleculaire klonering van cDNA-bibliotheken of specifieke transcripten wordt RNA omgezet naar cDNA via reverse transcriptase. Het cDNA kan worden geamplificeerd, gekloneerd in expressievectoren en in gastheercellen tot expressie gebracht. Dit is een fundamentele strategie voor de productie van recombinante eiwitten en voor de studie van genfunctie.
Geïsoleerd of synthetisch geproduceerd RNA dient ook als template of kwaliteitsreferentie bij de productie van mRNA-therapeutica en mRNA-vaccins. Kwaliteitscontrole van mRNA-therapeutica vereist integriteitsbeoordeling, zuiverheidsmeting, bepaling van het percentage product dat is voorzien van een 5'-cap en een poly-A-staart, en kwantificering van eventuele dsRNA-verontreinigingen.
Cultuurcellen zijn het meest toegankelijke monstertype voor RNA-isolatie. Pelleteer de cellen door centrifugatie, verwijder het medium volledig en lyseer direct in lysisbuffer of TRIzol. Direct vriezen in TRIzol of een RNA-stabilisatieoplossing is mogelijk als onmiddellijke isolatie niet uitvoerbaar is. Zie ook het artikel over celkweektechnieken in het laboratorium voor contextinformatie over de teelt van cellijnen.
Weefsel moet onmiddellijk na afname worden ingevroren in vloeibare stikstof of gestabiliseerd in RNA-later. Cryogeen bewaard weefsel wordt gehomogeniseerd in vloeibare stikstof met een vijzel en stamper, of via beadmilling. Vetrijk weefsel (hersenweefsel, vetweefsel) vereist aanvullende stappen voor lipideverwijdering om kolom- of fenolextractie niet te verstoren.
Bloed is een bijzonder monstertype vanwege de hoge hoeveelheid globine-mRNA in erytrocyten (80–90 % van bloed-mRNA). Globine-mRNA-depletie is aanbevolen voor transcriptoomanalyse van bloed. PAXgene of Tempus-bloedbuizen stabiliseren RNA direct in het bloed; na afname kunnen monsters bij kamertemperatuur worden verwerkt of ingevroren voor latere isolatie.
Formaline-gefixeerd, in paraffine ingebed (FFPE) weefsel bevat sterk gefragmenteerd en chemisch gecrosslinkt RNA. Speciale FFPE-RNA-kits (met verlengde deparaffinisatie en hitte-omkering van crosslinks) zijn vereist. Het verkregen RNA is gefragmenteerd (doorgaans < 300 nucleotiden); voor downstream-analyse zijn korte amplicon-RT-qPCR-assays of FFPE-compatibele NGS-libraries noodzakelijk.
Plantencellen bevatten polysachariden, polyfenolen en secundaire metabolieten die de isolatie sterk kunnen remmen. CTAB-methoden of speciale plantaardig-RNA-kits zijn vereist. LiCl-precipitatie wordt gebruikt om hoge-molecuulgewicht RNA te isoleren en polysachariden achter te laten.
Genomisch DNA co-precipiteert met RNA en kan RT-qPCR-resultaten ernstig verstoren: primers die genomisch DNA amplificeren geven valspositieve signalen bij de NRT-controle (No Reverse Transcriptase). Preventieve maatregelen:
Wanneer de RNA-concentratie na isolatie te laag is, zijn de volgende concentratiemethoden beschikbaar:
Een standaard RNA-isolatieworkflow vereist de volgende apparatuur en verbruiksmaterialen:
Voor de opslag van RNA is een vriezer bij −70 tot −80 °C noodzakelijk. Voor weefselmonsters die niet direct worden verwerkt, is een ijsmachine of vloeibare stikstofopslagvat onmisbaar — zie het artikel over koelen en vriezen in het laboratorium.
Fenol-chloroform (TRIzol en vergelijkbare reagentia) zijn CMR-stoffen waarvoor specifieke veiligheidsmaatregelen gelden. Chloroform is carcinogeen categorie 2 en reprotoxisch; fenol is sterk bijtend en wordt door de huid opgenomen. Gebruik altijd in een goed werkende zuurkast, draag handschoenen, veiligheidsbril en laboratoriumjas. Organisch afval (fenol-chloroform-fasen) moet worden afgevoerd als chemisch afval conform de geldende voorschriften. Silicakolommethoden zijn vanuit veiligheidsperspectief eenvoudiger te hanteren en worden in veel laboratoria de voorkeur gegeven boven fenol-chloroform-methoden voor routinewerk.
In de klinische en veterinaire diagnostiek is RNA-isolatie de basis voor de detectie van RNA-virussen: influenza, HIV, SARS-CoV-2, hepatitis C-virus (HCV), rabies, norovirus en vele andere. RT-qPCR op geïsoleerd RNA is de gouden standaard voor directe virale detectie vanwege de hoge gevoeligheid en specificiteit. Klinische RNA-isolatieprotocollen zijn onderhevig aan validatie conform GLP en ISO 15189-eisen; geautomatiseerde platforms (bijv. Roche MagNA Pure, bioMérieux NucliSENS) zijn in gebruik voor hoge-doorvoer klinische diagnostiek.
De duur is sterk afhankelijk van de methode en het aantal monsters. Een standaard silicakolomprotocol voor 1–24 cultuurcelmonsters is uitvoerbaar in 30–60 minuten van lyse tot eindproduct. Een fenol-chloroform-isolatie inclusief precipitatie duurt doorgaans 90–120 minuten. Geautomatiseerde platforms (KingFisher, Hamilton) verwerken 48–96 monsters tegelijkertijd in minder dan 90 minuten. Kwaliteitscontrole (NanoDrop, RIN-bepaling) vraagt nog 15–30 minuten extra per batch.
RNA-isolatie is nauw verbonden met een reeks aanvullende analytische technieken in de Labvakhandel-kennisbank. Voor genexpressieanalyse op mRNA-niveau is qPCR / real-time PCR de aangewezen methode; de reverse-transcriptiestap die mRNA omzet naar cDNA is beschreven in het RT-qPCR-gedeelte van dat artikel. Voor transcriptoom-brede expressieanalyse is next-generation sequencing (NGS) de aangewezen techniek; RNA-seq-workflows beginnen altijd met RNA-isolatie van hoge kwaliteit. Voor de detectie van specifieke RNA-transcripten via hybridisatie en groottescheiding is Northern blot beschikbaar als aanvullende methode. Voor isolatie van specifieke RNA-populaties (mRNA via poly-A-selectie) is affiniteitschromatografie de aangewezen techniek. Groottescheiding en integriteitsbeoordeling van RNA gebeurt via gelelektroforese. Voor spectrofotometrische kwantificering en zuiverheidsbeoordeling (A260/A280-ratio) is UV/Vis-spectrofotometrie het basisinstrument. DNA-isolatie als vergelijkende en complementaire techniek staat beschreven in het artikel over DNA-isolatie en DNA-extractie in het laboratorium. Voor celkweekmethoden als startmateriaal voor RNA-isolatie uit cultuurcellen, zie het artikel over celkweektechnieken in het laboratorium. Voor detectie van chromosomale RNA-lokalisatie in intacte cellen is FISH (fluorescentie-in-situ-hybridisatie) de aanvullende in-situ-methode.
Neem contact op voor advies over RNA-isolatiematerialen, kits of verbruiksartikelen passend bij uw toepassing en monstertype.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
