In dit practicum onderzoek je hoe de temperatuur de werking van een enzym beïnvloedt. Je laat cellobiase een substraat splitsen bij zes verschillende temperaturen en meet hoeveel gele kleurstof er ontstaat. Je meet de kleur zonder apparatuur door hem te vergelijken met een ijkreeks, en tekent een optimumkromme. Bij het VWO onderzoek je ook wat er met het enzym gebeurt als je het kookt (denaturatie).
Dit practicum staat los van de andere enzympractica (pH, substraatconcentratie en reactieverloop in de tijd). De klas verdeelt de temperaturen, zodat het in één les van 45 minuten past.
Vak: Biologie | Domein: Zelfregulatie – enzymwerking | Duur: 1 les van 45 minuten (+ ca. 30 minuten voorbereiding door de docent of TOA) | Klas: bovenbouw (de klas waarin enzymwerking wordt behandeld verschilt per methode; meestal klas 4 en 5)
Bron: syllabi biologie havo en vwo van het College voor Toetsen en Examens (havo 2024, vwo 2025/2027). Controleer de syllabus van het actuele examenjaar.
Reken op ca. 30 minuten. Zonder voortest en ijkreeks is het practicum niet uitvoerbaar.
De ijkreeks is de “meetlat” voor de kleurmeting. Maak één set per twee groepen, van tevoren, in zeven gelabelde eps van 1,5 mL. Pipetteer eerst de buffer, dan de standaard, en voeg de stopoplossing als laatste toe. Sluit de buisjes en meng goed (vortex of omkeren). Eindvolume 400 µL per buisje. 1 mM standaard is 1 nmol per µL, dus het aantal µL standaard is gelijk aan het aantal nmol maal 1 (zie tabel).
Maak de reeks op de dag zelf of de dag ervoor en bewaar de buisjes afgesloten en donker. Staat er op uw standaard een andere concentratie dan 1 mM, reken dan de volumes om: volume (µL) = gewenste nmol ÷ concentratie (mM).
De activiteit van enzympreparaten verschilt sterk per leverancier en per batch. Zonder voortest is de kans groot dat alle buisjes bijna kleurloos of juist ver buiten de ijkreeks zijn. Doe daarom vooraf:
Zet vóór de les zes baden klaar en controleer de temperatuur met een thermometer (afwijking maximaal 2 °C). Stuur tijdens de les bij met warm of koud water. Staat er een heatblock of thermostaatbad tot uw beschikking, dan kunt u dat voor een of meer temperaturen gebruiken.
Doe 150 µL werkverdunning van het enzym in een goed sluitende eps. Zet het buisje met veiligheidsbril, in een drijver of met een dopsluiting zodat het deksel niet opent, 5 minuten in kokend water. Koel daarna af op ijs en label het buisje K. Het enzym is dan gedenatureerd.
Elke temperatuur wordt door twee groepen gemeten, zodat u duplo-waarden heeft. Pas de indeling aan als u meer of minder groepen heeft.
De volumes in dit practicum zijn zo gekozen dat ze met een micropipet van 2–20 µL en een micropipet van 20–200 µL te pipetteren zijn. Wijkt uw materiaal af, gebruik dan deze regels:
Enzympreparaten, substraten en buffers verschillen per leverancier en per batch. Voer onderstaande controle daarom één keer uit, met één proefgroep, voordat de klas het practicum doet en telkens als u een nieuw preparaat, nieuwe buffer of nieuw substraat gebruikt. Reken op ca. 45 tot 60 minuten. Leerlingen hoeven hier niets van te weten.
Noteer na afloop: werkverdunning, gemeten badtemperaturen, ijkstap per temperatuur, temperatuur van het maximum.
Voor dit practicum zijn geen CMR-stoffen nodig (kankerverwekkend, mutageen of reproductietoxisch). Controleer wel het veiligheidsinformatieblad (VIB) van uw materiaal, want sommige samenstellingen bevatten wel een CMR-stof:
Enzymen zijn eiwitten die chemische reacties in cellen versnellen (katalyseren). Het substraat past op de actieve plaats van het enzym. Daar ontstaat tijdelijk een enzymsubstraatcomplex, waarna het substraat wordt omgezet in product.
Temperatuur en enzymwerking: bij een hogere temperatuur bewegen moleculen sneller. Enzym en substraat botsen dan vaker, er vormen zich per seconde meer enzymsubstraatcomplexen en de reactie verloopt sneller. Boven een bepaalde temperatuur nemen de bewegingen van de atomen in het enzym zo toe dat de bindingen (zoals waterstofbruggen) die de ruimtelijke bouw vasthouden, verbreken. De actieve plaats verandert van vorm en het substraat past niet meer: het enzym is gedenatureerd. Dit is meestal onomkeerbaar. De optimumkromme voor temperatuur stijgt daarom eerst, bereikt een maximum bij de optimumtemperatuur en daalt daarna snel.
In de natuur splitst cellobiase (ook wel β-glucosidase) cellobiose in twee moleculen glucose. In dit practicum gebruik je een kunstmatig substraat, p-nitrofenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG). De actieve plaats van het enzym herkent de binding tussen glucose en de rest van het molecuul, en splitst pNPG in glucose en p-nitrofenol:
pNPG + H2O → glucose + p-nitrofenol (gekatalyseerd door cellobiase)
pNPG is kleurloos. p-Nitrofenol is een indicator: bij een zure of neutrale pH is het vrijwel kleurloos, bij pH 9 of hoger is het geel (als p-nitrofenolaat). Voeg je na de reactie een stopoplossing met een hoge pH toe, dan gebeurt er twee dingen tegelijk: het enzym werkt niet meer (de reactie is gestopt) en de gele kleur wordt zichtbaar. Hoe geler het mengsel, hoe meer p-nitrofenol er is gevormd, en dus hoe meer substraat is omgezet.
Zonder spectrofotometer vergelijk je de kleur met een ijkreeks: buisjes met een bekende hoeveelheid p-nitrofenol (de standaard) in dezelfde stopoplossing en hetzelfde volume. Voor elk reactiebuisje zoek je het ijkbuisje met dezelfde kleur en lees je af hoeveel nmol product is gevormd (1 nmol = 10−9 mol). Die vergelijking is een schatting: reken op een leesonzekerheid van ongeveer een halve stap tussen twee ijkbuisjes.
Dit practicum gaat uit van pNPG als substraat en p-nitrofenol als standaard. Controleer dat op de etiketten van uw materiaal.
Tijdsplanning (45 minuten): 0–5 min: instructie en veiligheid • 5–12 min: buisjes pipetteren • 12–15 min: voorverwarmen • 15–27 min: reactie starten en stoppen (10 minuten per temperatuur) • 27–35 min: kleur aflezen • 35–45 min: klasresultaten verzamelen en grafiek.
Je groep meet twee temperaturen (zie de indeling van je docent). Voer onderstaande stappen voor beide temperaturen uit.
Laat de gestopte buisjes eerst 5 minuten op kamertemperatuur komen en lees ze dan pas af. Zet je resultaten in de tabel van de klas. Activiteit (nmol/min) = gemiddelde gevormde nmol ÷ 10 min, na aftrekken van het blanco.
Verwachting: het temperatuuroptimum van cellobiase (β-glucosidase) uit schimmels ligt vaak tussen ca. 40 en 60 °C; bij 70 °C is de activiteit meestal duidelijk lager omdat het enzym tijdens de incubatie denatureert. Dit hangt af van de herkomst en de stabiliteit van het preparaat, dus reken niet op een vaste waarde. De leerlingen moeten een kromme zien die stijgt, een maximum bereikt en daalt. De uitkomst van uw voortest (37 °C) is de referentie.
V1: De reactie moet starten bij de gewenste temperatuur. Mengen leerlingen koud enzym met warm substraat (of andersom), dan heeft het mengsel eerst een andere temperatuur en meet je het effect van de temperatuur niet zuiver.
V2: Het blanco-buisje (zonder enzym) laat zien dat het substraat bij die temperatuur niet vanzelf gesplitst wordt. Een hoge temperatuur kan de binding in het substraat zonder enzym ook enigszins verbreken. Is het blanco geel, trek die waarde af van de andere metingen bij die temperatuur.
V3: Een kromme die stijgt tot een maximum en daarna daalt. De optimumtemperatuur is de temperatuur bij het hoogste punt; gezien de ruwe kleurmeting en de afstand tussen de temperaturen (10 tot 20 °C) is dat een schatting.
V4: Bij een hogere temperatuur bewegen enzym en substraat sneller en botsen ze vaker. Er vormen zich per seconde meer enzymsubstraatcomplexen, dus er ontstaat meer product per minuut.
V5: Boven het optimum verbreekt de warmte de zwakke bindingen (zoals waterstofbruggen) die de ruimtelijke bouw van het enzym vasthouden. De actieve plaats verandert van vorm, het substraat past niet meer en steeds meer enzymmoleculen zijn niet meer actief (denaturatie). Daardoor daalt de gemeten activiteit ondanks de snellere botsingen.
V6: Het gekookte enzym geeft vrijwel geen kleur (< 4 nmol), ook niet bij 37 °C, de temperatuur waarbij het normale enzym goed werkt. Denaturatie is dus niet te herstellen door de temperatuur weer te verlagen: onomkeerbaar. Veranderd: de ruimtelijke (tertiaire) bouw en dus de actieve plaats. Niet veranderd: de aminozuurvolgorde (primaire structuur); de keten blijft heel.
V7: Factor = activiteit bij 37 °C ÷ activiteit bij 20 °C. Verwachting uit de vuistregel: 17 °C is 1,7 keer 10 °C, dus 21,7 ≈ 3,2. Een gemeten factor van ruwweg 2 tot 4 past hierbij, rekening houdend met de grove kleurmeting. Boven het optimum geldt de vuistregel niet: daar daalt de activiteit door denaturatie, en het enzym is niet meer in staat te profiteren van de hogere temperatuur.
V8: Nee. Bij 0 °C bewegen de moleculen traag, er vormen zich weinig enzymsubstraatcomplexen en de hoeveelheid product blijft onder de detectiegrens van de kleurmeting. Het enzym is niet beschadigd. Controle: breng het enzym uit het ijsbad weer naar 37 °C; de activiteit is dan weer zichtbaar. Koude is dus niet hetzelfde als denaturatie.
Voor dit practicum heeft u onder meer micropipetten en pipetpunten, reactievaatjes, rekjes en pH-indicatorpapier nodig, thermometers en bekerglazen voor de temperatuurbaden. Bekijk het assortiment: pipetten, pipetpunten, centrifugebuizen & reactievaatjes, waterbaden, verwarmingsplaten & -mantels, temperatuur, tijd & klimaat, koelboxen & ijsbaden, bekers & erlenmeyers. Neem contact op voor advies.
Dit practicum is onderdeel van een reeks van vier enzympractica met cellobiase. Ze zijn los van elkaar uit te voeren, maar sluiten inhoudelijk op elkaar aan:
Ook interessant: DNA knippen met restrictie-enzymen en gelelektroforese van DNA voor VWO.
Ontdek alle practica in de Labvakhandel kennisbank — voor biologie, scheikunde en natuurkunde.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
