Practicum: Invloed van pH op enzymwerking – Biologie HAVO/VWO

In dit practicum onderzoek je hoe de zuurgraad (pH) de werking van een enzym beïnvloedt. Je gebruikt cellobiase en een substraat dat bij de reactie een gele kleurstof vormt. Je meet de hoeveelheid kleurstof zonder apparatuur, door de kleur te vergelijken met een ijkreeks, en tekent daarmee een optimumkromme.

Dit practicum staat los van de andere enzympractica (temperatuur, substraatconcentratie en reactieverloop in de tijd). Het past in één les van 45 minuten.

Leerdoelen

• uitleggen hoe cellobiase met het substraat een enzymsubstraatcomplex vormt en het substraat splitst;
• uit eigen metingen een optimumkromme tekenen en het pH-optimum bepalen;
• beschrijven (HAVO) of toelichten (VWO) hoe de pH de enzymwerking beïnvloedt;
• uitleggen waarom p-nitrofenol als indicator bruikbaar is om de reactie te volgen.

Cursusniveau en vakgebied

Vak: Biologie | Domein: Zelfregulatie – enzymwerking | Duur: 1 les van 45 minuten (+ ca. 30 minuten voorbereiding door de docent of TOA) | Klas: bovenbouw (de klas waarin enzymwerking wordt behandeld verschilt per methode; meestal klas 4 en 5)

Aansluiting op de eindtermen

Bron: syllabi biologie havo en vwo van het College voor Toetsen en Examens (havo 2024, vwo 2025/2027). Controleer de syllabus van het actuele examenjaar.

Voorbereiding door docent of TOA

Reken op ca. 30 minuten. Zonder voortest en ijkreeks is het practicum niet uitvoerbaar.

IJkreeks voor de hele klas (docent of TOA)

De ijkreeks is de “meetlat” voor de kleurmeting. Maak één set per twee groepen, van tevoren, in zeven gelabelde eps van 1,5 mL. Pipetteer eerst de buffer, dan de standaard, en voeg de stopoplossing als laatste toe. Sluit de buisjes en meng goed (vortex of omkeren). Eindvolume 400 µL per buisje. 1 mM standaard is 1 nmol per µL, dus het aantal µL standaard is gelijk aan het aantal nmol maal 1 (zie tabel).

Maak de reeks op de dag zelf of de dag ervoor en bewaar de buisjes afgesloten en donker. Staat er op uw standaard een andere concentratie dan 1 mM, reken dan de volumes om: volume (µL) = gewenste nmol ÷ concentratie (mM).

Voortest: enzymverdunning bepalen (docent of TOA, ca. 15 minuten)

De activiteit van enzympreparaten verschilt sterk per leverancier en per batch. Zonder voortest is de kans groot dat alle buisjes bijna kleurloos of juist ver buiten de ijkreeks zijn. Doe daarom vooraf:

1. Maak drie verdunningen van het enzym in buffer pH 5: 1:10 (20 µL enzym + 180 µL buffer), 1:100 (20 µL van de 1:10 + 180 µL buffer) en 1:1000. Houd ze op ijs.
2. Pipetteer per verdunning in een eps: 160 µL buffer pH 5 + 20 µL substraat (10 mM). Start met 20 µL verdund enzym, meng, en incubeer precies 10 minuten bij kamertemperatuur.
3. Stop met 200 µL 2× stopoplossing, meng en vergelijk met de ijkreeks.
4. Gewenst: een kleur die overeenkomt met ijkbuisje 3 tot 4 (16 tot 24 nmol). Te licht: minder verdunnen (bijvoorbeeld 1:30). Te donker: meer verdunnen. Herhaal tot de kleur past en noteer de werkverdunning.

pH-reeks voor de hele klas (docent of TOA)

Maak vijf mengsels van buffer pH 5 en buffer pH 7,2 (ca. 5 mL per mengsel is genoeg voor een klas van 12 groepen). Meng in een schone buis, sluit af en label a t/m e. Meet de pH van elk mengsel met een pH-meter of pH-indicatorpapier en schrijf de gemeten waarde op het label. De waarden liggen tussen 5 en 7,2, maar ze zijn niet per se gelijkmatig verdeeld, zeker niet als de twee buffers van verschillende soort zijn.

Mengen levert alleen een betrouwbare reeks als beide buffers dezelfde sterkte hebben. Verschilt de sterkte, meet dan nauwkeurig na of gebruik de uitbreiding met zelfgemaakte buffers (zie onderaan).

Overige voorbereiding

• Maak per groep 300 µL werkverdunning van het enzym (op ijs) en geef elke groep een eigen set pH-mengsels a t/m e (5 × ca. 200 µL) en 1,5 mL stopoplossing.
• Geef per groep ca. 200 µL substraatoplossing (10 mM) en ca. 1 mL buffer pH 5.
• Noteer de kamertemperatuur. De proef verloopt bij kamertemperatuur, dus een waterbad is niet nodig.
• Controleer met pH-indicatorpapier of in een proefbuisje het eindmengsel (reactie + stopoplossing) pH 9,5 of hoger heeft.

Aanpassen aan uw materiaal – werkt met elke leverancier

De volumes in dit practicum zijn zo gekozen dat ze met een micropipet van 2–20 µL en een micropipet van 20–200 µL te pipetteren zijn. Wijkt uw materiaal af, gebruik dan deze regels:

• Substraat: in 200 µL reactie geldt [S] (mM) = volume substraat (µL) × sterkte van uw oplossing (mM) ÷ 200. Dit practicum gaat uit van een substraatoplossing van 10 mM. Is de uwe 5 mM, verdubbel dan de substraatvolumes (en neem evenveel minder buffer). Is de uwe sterker, verdun dan eerst met buffer pH 5 tot 10 mM.
• Enzym: altijd 20 µL verdund enzym per 200 µL reactie (10 %). De sterkte regel je met de verdunning, zie Voortest. Gevriesdroogd enzym reconstitueert u volgens de aanwijzing van de leverancier.
• Stopoplossing: bedoeld als 2× sterkte (1 deel reactie + 1 deel stopoplossing). Controleer met pH-indicatorpapier dat het eindmengsel pH 9,5 of hoger heeft. Is dat niet zo, gebruik dan meer stopoplossing of een sterkere oplossing en maak de ijkreeks op dezelfde manier.
• Standaard: 1 mM p-nitrofenol is 1 nmol per µL. Andere sterkte: volume (µL) = nmol ÷ concentratie (mM).
• Buffers: buffer pH 5 en buffer pH 7,2 van elke leverancier zijn bruikbaar. Wilt u buffers mengen, doe dat dan alleen met buffers van dezelfde soort en sterkte, en meet de pH altijd na.

Controle vóór de eerste les (docent of TOA)

Enzympreparaten, substraten en buffers verschillen per leverancier en per batch. Voer onderstaande controle daarom één keer uit, met één proefgroep, voordat de klas het practicum doet en telkens als u een nieuw preparaat, nieuwe buffer of nieuw substraat gebruikt. Reken op ca. 45 tot 60 minuten. Leerlingen hoeven hier niets van te weten.

Noteer na afloop: werkverdunning, gemeten pH van buffers en mengsels a t/m e, ijkstap per mengsel, pH waar de activiteit het hoogst is.

⚠️ CMR-check – gevaarstoffen

Voor dit practicum zijn geen CMR-stoffen nodig (kankerverwekkend, mutageen of reproductietoxisch). De Arbocatalogus VO (Voion) is leidend voor het werken met CMR-stoffen op school. Controleer wel het veiligheidsinformatieblad (VIB) van uw materiaal, want sommige samenstellingen bevatten wel een CMR-stof:

• Stopoplossing: bij sommige leveranciers is de stopoplossing van pH 9–10 een boraatbuffer met boorzuur of borax (Repr. 1B, H360FD). Dat is een CMR-stof. Vervang die door een carbonaatoplossing: 0,2 M natriumcarbonaat (21,2 g Na₂CO₃ per liter water) als 2× stopoplossing. Natriumcarbonaat is irriterend voor de ogen (H319) maar niet CMR. Controleer met pH-indicatorpapier dat het eindmengsel pH 9,5 of hoger heeft.
• p-Nitrofenol (standaard) en pNPG (substraat): niet CMR-ingedeeld. Volgens de meeste VIB's is p-nitrofenol schadelijk bij inslikken, huidcontact en inademen. De verdunde standaard (1 mM, ca. 0,14 g per liter) en de reactiemengsels zijn laag-risico, maar lees het VIB van uw leverancier en gebruik handschoenen.
• Conserveermiddelen in enzym of buffer: sommige preparaten bevatten natriumazide (zeer giftig, geen CMR). Kies bij voorkeur preparaten zonder azide en lees het etiket.

Achtergrondinformatie

Enzymen zijn eiwitten die chemische reacties in cellen versnellen (katalyseren). De stof waarop een enzym werkt heet het substraat. Het substraat past op een bepaalde plaats van het enzym, de actieve plaats. Daar ontstaat tijdelijk een enzymsubstraatcomplex, waarna het substraat wordt omgezet in product. Het enzym komt ongewijzigd uit de reactie en kan opnieuw werken.

pH en enzymwerking: de ruimtelijke bouw van een enzym, en dus de vorm en lading van de actieve plaats, hangt af van de pH. Bij een bepaalde pH, het pH-optimum, werkt een enzym het best. Wijkt de pH af van het optimum, dan verandert de lading van aminozuren in en rond de actieve plaats en past het substraat minder goed. Bij een extreme pH kan de bouw van het enzym blijvend veranderen (denaturatie). Als je de activiteit uitzet tegen de pH, krijg je een optimumkromme: een klokvormige kromme met de hoogste activiteit bij het optimum.

Het kleurstofsubstraat en de kleurmeting

In de natuur splitst cellobiase (ook wel β-glucosidase) cellobiose in twee moleculen glucose. In dit practicum gebruik je een kunstmatig substraat, p-nitrofenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG). De actieve plaats van het enzym herkent de binding tussen glucose en de rest van het molecuul, en splitst pNPG in glucose en p-nitrofenol:

pNPG + H₂O → glucose + p-nitrofenol (gekatalyseerd door cellobiase)

pNPG is kleurloos. p-Nitrofenol is een indicator: bij een zure of neutrale pH is het vrijwel kleurloos, bij pH 9 of hoger is het geel (als p-nitrofenolaat). Voeg je na de reactie een stopoplossing met een hoge pH toe, dan gebeurt er twee dingen tegelijk: het enzym werkt niet meer (de reactie is gestopt) en de gele kleur wordt zichtbaar. Hoe geler het mengsel, hoe meer p-nitrofenol er is gevormd, en dus hoe meer substraat is omgezet.

Zonder spectrofotometer vergelijk je de kleur met een ijkreeks: buisjes met een bekende hoeveelheid p-nitrofenol (de standaard) in dezelfde stopoplossing en hetzelfde volume. Voor elk reactiebuisje zoek je het ijkbuisje met dezelfde kleur en lees je af hoeveel nmol product is gevormd (1 nmol = 10⁻⁹ mol). Die vergelijking is een schatting: reken op een leesonzekerheid van ongeveer een halve stap tussen twee ijkbuisjes.

Dit practicum gaat uit van pNPG als substraat en p-nitrofenol als standaard. Controleer dat op de etiketten van uw materiaal.

Benodigdheden – per groep van 2 tot 3 leerlingen

Veiligheid

• Draag gedurende het hele practicum een veiligheidsbril, handschoenen en een labjas.
• De stopoplossing is basisch (pH 9–10) en irriteert ogen en huid. Bij contact met de ogen minstens 15 minuten spoelen met water en een arts raadplegen.
• p-Nitrofenol (standaard en reactieproduct) en pNPG: niet inslikken, geen contact met huid of ogen, handen wassen na afloop. Lees het VIB van uw leverancier.
• Pipetteer nooit met de mond.
• Afval: de gele reactiemengsels en ijkbuisjes bevatten p-nitrofenol. Verzamel ze in een afvalcontainer voor waterige oplossingen en bied ze aan als chemisch afval volgens het schoolreglement. Niet door de gootsteen spoelen.

Werkwijze

Tijdsplanning (45 minuten): 0–5 min: instructie en veiligheid • 5–15 min: pipetteren en starten • 15–27 min: incuberen en stoppen (elk buisje precies 10 minuten) • 27–35 min: kleur aflezen • 35–45 min: grafiek en vragen (of als huiswerk). Alles gebeurt bij kamertemperatuur.

Deel A – Reacties starten en stoppen

1. Labelen: schrijf op zes eps: 1 t/m 5 en B (blanco), plus de groepsletter. Zet ze in het rekje.
2. Buffer: pipetteer in elk buisje 160 µL buffer: buisje 1 mengsel a, buisje 2 mengsel b, enzovoort tot buisje 5 mengsel e. Het blanco-buisje B krijgt buffer a. Gebruik voor elke buffer een nieuwe tip.
3. Substraat: voeg aan elk buisje 20 µL substraatoplossing toe en meng door zacht aantikken of met een vortex.
4. Starten: start de timer en voeg volgens het schema hieronder, met intervallen van 30 seconden, 20 µL verdund enzym toe aan elk buisje. Meng meteen 3 seconden. Het blanco-buisje krijgt 20 µL buffer pH 5 in plaats van enzym.
5. Incuberen: laat elk buisje precies 10 minuten in het rekje staan (kamertemperatuur).
6. Stoppen: voeg op de aangegeven tijd 200 µL 2× stopoplossing toe aan het buisje en meng. De kleur ontwikkelt zich meteen.

Deel B – Kleur aflezen

Kleur aflezen zonder apparatuur

1. Zet de zeven ijkbuisjes (0 tot 40 nmol) op volgorde in een rekje, met een vel wit papier erachter.
2. Zet je reactiebuisjes er direct naast. Kijk horizontaal, op ooghoogte, bij daglicht of wit licht (geen gekleurde achtergrond, geen fel zonlicht).
3. Zoek per reactiebuisje de twee ijkbuisjes met een kleur net lichter en net donkerder en schat het aantal nmol, bijvoorbeeld “tussen 16 en 24, dus 20 nmol”. Is er geen verschil met het blanco-ijkbuisje (0 nmol), noteer dan < 4 nmol. Is het buisje donkerder dan 40 nmol, noteer dan > 40 nmol.
4. Laat een tweede leerling de buisjes onafhankelijk aflezen en noteer beide waarden. Maak een foto van de opstelling (alle buisjes in één beeld, zelfde licht).

Vul de resultatentabel in. Activiteit (nmol/min) = gevormde nmol ÷ 10 min (trek zo nodig de waarde van het blanco-buisje af). Relatieve activiteit (%) = activiteit ÷ hoogste activiteit × 100 %.

Deel C – Optimumkromme tekenen

• Zet de pH (door de docent gemeten) op de x-as en de activiteit (nmol/min) op de y-as.
• Teken door de punten een vloeiende lijn (geen rechte stukken) en geef het pH-optimum aan.
• Schrijf bij elk punt of de waarde een schatting is (< 4 nmol of > 40 nmol zijn geen exacte waarden).

Verwerkingsvragen

1. (HAVO/VWO) Waarom is er een blanco-buisje zonder enzym? Wat verwacht je dat je daar ziet?
2. (HAVO/VWO) Welke stof zorgt voor de gele kleur en hoe ontstaat die? Waarom noemen we deze stof een indicator?
3. (HAVO/VWO) Teken de optimumkromme en bepaal bij welke pH de activiteit het hoogst is.
4. (HAVO/VWO) Verklaar met de bouw van een enzym waarom de activiteit bij een andere pH dan het optimum lager is.
5. (HAVO/VWO) Waarom voeg je na de incubatie een stopoplossing met een hoge pH toe? Noem twee functies.
6. (HAVO) Bereken de activiteit in nmol/min bij het pH-optimum en de relatieve activiteit bij de hoogste pH in %.
7. (VWO) Wat gebeurt er met een enzym bij een extreme pH? Is dat omkeerbaar? Hoe zou je dat met dit practicum kunnen onderzoeken?
8. (VWO) Foutenanalyse: de leesonzekerheid is ongeveer een halve stap tussen twee ijkbuisjes (± 2 nmol bij kleine hoeveelheden, ± 4 nmol bij grotere). Bereken de relatieve onzekerheid bij 8 nmol en bij 32 nmol. Wat betekent dit voor het bepalen van het optimum?
9. (VWO) Met de twee buffers meet je maar een deel van de pH-schaal. Hoe kun je zeker weten dat het gevonden optimum echt het optimum is?
10. (VWO, verdieping) Waarom is het belangrijk dat het eindmengsel (na de stopoplossing) in alle buisjes dezelfde hoge pH heeft? p-Nitrofenol is voor de helft geel bij pH 7,15 (pK_z ≈ 7,15).

Uitwerking

Verwachting: het pH-optimum van cellobiase (β-glucosidase) uit schimmels ligt vaak rond pH 4 tot 5,5, maar dit hangt af van de herkomst van het preparaat. Reken dus niet op een vaste boekwaarde. De uitkomst van uw voortest (pH 5) is de referentie. Ligt het optimum buiten het gemeten bereik, dan zien leerlingen alleen een dalende lijn; dat is een geldige uitkomst en de reden voor vraag 9.

V1: Het blanco-buisje bevat alles behalve het enzym. Het laat zien dat de gele kleur niet ontstaat door het substraat, de buffer of de stopoplossing zelf. Verwachting: kleurloos (< 4 nmol). Is het buisje geel, dan is het substraat al gesplitst of is er vervuiling; trek die waarde dan van de andere buisjes af.

V2: p-Nitrofenol (na de stopoplossing als p-nitrofenolaat) is geel. Het ontstaat doordat cellobiase het substraat pNPG splitst in glucose en p-nitrofenol. Het is een indicator omdat de kleur afhangt van de pH: kleurloos bij een lage, geel bij een hoge pH. Na de stopoplossing is de pH hoog genoeg voor de gele vorm.

V3: Een klokvormige (of dalende) kromme door de punten; het optimum is de pH bij het hoogste punt. Omdat er maar vijf meetpunten zijn en de kleur is geschat, is het optimum een schatting (“ongeveer pH …”).

V4: De pH bepaalt de lading van aminozuren in en nabij de actieve plaats en de ruimtelijke bouw van het eiwit. Bij een andere pH dan het optimum past het substraat minder goed op de actieve plaats, er vormen zich minder enzymsubstraatcomplexen per seconde en er ontstaat minder product.

V5: (1) De reactie stopt op een bekend moment: bij een pH van 9,5 of hoger is het enzym vrijwel niet meer actief. (2) De pH stijgt zo ver dat p-nitrofenol in zijn gele vorm komt, zodat je de kleur kunt aflezen.

V6: Voorbeeld van de berekening: komt de kleur overeen met 20 nmol, dan is de activiteit 20 nmol ÷ 10 min = 2,0 nmol/min. Relatieve activiteit = activiteit bij hoogste pH ÷ hoogste activiteit × 100 %. Is die bijvoorbeeld 0,8 nmol/min bij een maximum van 2,0, dan is de relatieve activiteit 40 %.

V7: Bij een extreme pH verbreken of veranderen bindingen (zoals waterstofbruggen en ionbindingen) die de ruimtelijke bouw van het enzym vasthouden. De actieve plaats vervormt en het substraat past niet meer: denaturatie. Dit is meestal onomkeerbaar. Onderzoeken: laat enzym een tijd in een extreme-pH-buffer staan, breng het daarna terug naar het pH-optimum en meet de activiteit opnieuw. Herstelt de activiteit niet, dan is de verandering onomkeerbaar.

V8: Relatieve onzekerheid = onzekerheid ÷ waarde × 100 %. Bij 8 nmol: 2 ÷ 8 = 25 %. Bij 32 nmol: 4 ÷ 32 = 12,5 %. Verschillen tussen buisjes die kleiner zijn dan deze percentages kun je niet betrouwbaar aantonen; het optimum is dus niet op een tiende pH-eenheid te bepalen.

V9: Door bij meer pH-waarden te meten, ook onder pH 5 en boven pH 7,2. Het optimum is pas gevonden als de activiteit aan beide kanten daalt. Zie de uitbreiding met zelfgemaakte buffers.

V10: De kleur van p-nitrofenol hangt van de pH af. Bij pH 7,15 is de helft geel; bij pH 8 is ca. 88 % geel, bij pH 9,5 ca. 99,6 %. Bij verschillende eindwaarden zou een zelfde hoeveelheid product in het ene buisje minder geel zijn dan in het andere, waardoor je de activiteit onderschat. Daarom moet de stopoplossing de pH in alle buisjes boven 9,5 brengen.

Niveauverdieping

• HAVO 4/5: vragen 1 t/m 6, grafiek en berekening van de activiteit.
• VWO 4/5: alle vragen, onafhankelijke tweede aflezing en foutenanalyse (vraag 8).
• Extra (VWO): laat leerlingen de ijkreeks zelf maken uit de standaard (volumes in de tabel) en meet met een gratis beeldverwerkingsprogramma de blauwwaarde (B in RGB) van elk buisje op een foto. Geel licht absorbeert blauw, dus een lagere blauwwaarde betekent meer p-nitrofenol. Gebruik dezelfde foto en belichting voor de ijkreeks en de monsters.

Uitbreiding voor de docent: volledige optimumkromme (pH 3–8)

Met alleen de buffers pH 5 en 7,2 meet je een deel van de kromme. Wilt u de hele kromme laten zien, maak dan een reeks zelfgemaakte buffers (citraat-fosfaatbuffer, ook wel McIlvaine-buffer): meng 0,2 M dinatriumwaterstoffosfaat en 0,1 M citroenzuur volgens onderstaande tabel, verdun elk mengsel 1:4 met demiwater en meet de pH na. Gebruik deze buffers in plaats van mengsel a t/m e. Citroenzuur is irriterend voor de ogen (H319), dinatriumwaterstoffosfaat is niet ingedeeld; beide zijn niet CMR. Controleer na het stoppen of het eindmengsel pH 9,5 of hoger heeft.

Benodigde laboratoriumartikelen

Voor dit practicum heeft u onder meer micropipetten en pipetpunten, reactievaatjes, rekjes en pH-indicatorpapier nodig. Bekijk het assortiment: pipetten, pipetpunten, centrifugebuizen & reactievaatjes, rekken & standaards, indicatoren & pH-papier. Neem contact op voor advies.

Meer practicumopdrachten

Dit practicum is onderdeel van een reeks van vier enzympractica met cellobiase. Ze zijn los van elkaar uit te voeren, maar sluiten inhoudelijk op elkaar aan:

• Practicum: Invloed van temperatuur op enzymwerking (HAVO/VWO) – hoe verandert de enzymactiviteit met de temperatuur en wanneer treedt denaturatie op?
• Practicum: Substraatconcentratie en enzymwerking (VWO) – hoe hangt de reactiesnelheid af van de hoeveelheid substraat, tot aan verzadiging?
• Practicum: Reactieverloop van een enzymreactie in de tijd (VWO) – hoe verloopt de productvorming in de tijd en waarom neemt de snelheid af?

Ook interessant: DNA knippen met restrictie-enzymen en gelelektroforese van DNA voor VWO.

Ontdek alle practica in de Labvakhandel kennisbank — voor biologie, scheikunde en natuurkunde.