Practicum: Reactieverloop van een enzymreactie in de tijd – Biologie VWO

In dit practicum volg je een enzymreactie in de tijd. Je maakt één reactiemengsel met cellobiase en een kleurstofsubstraat en neemt op zes momenten een monster dat je direct stopt. Je meet de kleur zonder apparatuur door hem te vergelijken met een ijkreeks en tekent hoeveel product er na elk tijdstip is gevormd. Je ziet dat de reactie in het begin snel verloopt en daarna afvlakt, en je onderzoekt waarom.

Dit is een verdiepingsopdracht. Het reactieverloop in de tijd is geen eindterm in de syllabus; het oefent onderzoeksvaardigheden en helpt om bij andere enzymmetingen een goede incubatietijd te kiezen. Het staat los van de andere enzympractica (pH, temperatuur en substraatconcentratie).

Leerdoelen

• uit eigen metingen het verloop van een enzymreactie in de tijd weergeven in een grafiek;
• de beginsnelheid bepalen uit het eerste deel van de grafiek en berekenen welk deel van het substraat is omgezet;
• verklaren waarom de snelheid afneemt en de hoeveelheid product afvlakt;
• een geschikte incubatietijd kiezen voor een enzymmeting en dat onderbouwen.

Cursusniveau en vakgebied

Vak: Biologie | Domein: Zelfregulatie – enzymwerking en vaardigheden (onderzoeken, verwerken en analyseren van gegevens) | Duur: 1 les van 45 minuten (+ ca. 30 minuten voorbereiding door de docent of TOA) | Klas: VWO 5/6, verdieping

Aansluiting op de eindtermen

Dit practicum sluit aan op de eindterm over enzymwerking (enzymsubstraatcomplex en katalyse) en op de onderzoeksvaardigheden in het vakdomein Vaardigheden, maar het reactieverloop in de tijd wordt niet als aparte eindterm genoemd. Neem het alleen op als verdieping.

Bron: syllabi biologie havo en vwo van het College voor Toetsen en Examens (havo 2024, vwo 2025/2027). Controleer de syllabus van het actuele examenjaar.

Voorbereiding door docent of TOA

Reken op ca. 30 minuten. Zonder voortest en ijkreeks is het practicum niet uitvoerbaar.

IJkreeks voor de hele klas (docent of TOA)

De ijkreeks is de “meetlat” voor de kleurmeting. Maak één set per twee groepen, van tevoren, in zeven gelabelde eps van 1,5 mL. Pipetteer eerst de buffer, dan de standaard, en voeg de stopoplossing als laatste toe. Sluit de buisjes en meng goed (vortex of omkeren). Eindvolume 400 µL per buisje. 1 mM standaard is 1 nmol per µL, dus het aantal µL standaard is gelijk aan het aantal nmol maal 1 (zie tabel).

Maak de reeks op de dag zelf of de dag ervoor en bewaar de buisjes afgesloten en donker. Staat er op uw standaard een andere concentratie dan 1 mM, reken dan de volumes om: volume (µL) = gewenste nmol ÷ concentratie (mM).

Voortest: enzymverdunning bepalen (docent of TOA, ca. 15 minuten)

De activiteit van enzympreparaten verschilt sterk per leverancier en per batch. Zonder voortest is de kans groot dat alle buisjes bijna kleurloos of juist ver buiten de ijkreeks zijn. Doe daarom vooraf:

1. Maak drie verdunningen van het enzym in buffer pH 5: 1:10 (20 µL enzym + 180 µL buffer), 1:100 (20 µL van de 1:10 + 180 µL buffer) en 1:1000. Houd ze op ijs.
2. Pipetteer per verdunning in een eps: 176 µL buffer pH 5 + 4 µL substraat (10 mM), dus [S] = 0,2 mM. Start met 20 µL verdund enzym, meng, en incubeer precies 10 minuten bij kamertemperatuur.
3. Stop met 200 µL 2× stopoplossing, meng en vergelijk met de ijkreeks.
4. Gewenst: een kleur die overeenkomt met ijkbuisje 3 tot 4 (16 tot 24 nmol), ongeveer de helft van de 40 nmol substraat. Te licht: minder verdunnen (bijvoorbeeld 1:30). Te donker: meer verdunnen. Herhaal tot de kleur past en noteer de werkverdunning.

Overige voorbereiding

• Maak per groep 300 µL werkverdunning van het enzym (op ijs), ca. 200 µL substraatoplossing (10 mM), ca. 1,5 mL buffer pH 5 en 1,5 mL stopoplossing.
• Het hoofdmengsel is ca. 1,5 mL; bij 6 monsters van 200 µL blijft er ruim voldoende over.
• Noteer de kamertemperatuur. De proef verloopt bij kamertemperatuur.
• Controleer met pH-indicatorpapier of in een proefbuisje het eindmengsel (reactie + stopoplossing) pH 9,5 of hoger heeft.

Aanpassen aan uw materiaal – werkt met elke leverancier

De volumes in dit practicum zijn zo gekozen dat ze met een micropipet van 2–20 µL en een micropipet van 20–200 µL te pipetteren zijn. Wijkt uw materiaal af, gebruik dan deze regels:

• Substraat: in 200 µL reactie geldt [S] (mM) = volume substraat (µL) × sterkte van uw oplossing (mM) ÷ 200. Dit practicum gaat uit van een substraatoplossing van 10 mM. Is de uwe 5 mM, verdubbel dan de substraatvolumes (en neem evenveel minder buffer). Is de uwe sterker, verdun dan eerst met buffer pH 5 tot 10 mM.
• Enzym: altijd 20 µL verdund enzym per 200 µL reactie (10 %). De sterkte regel je met de verdunning, zie Voortest. Gevriesdroogd enzym reconstitueert u volgens de aanwijzing van de leverancier.
• Stopoplossing: bedoeld als 2× sterkte (1 deel reactie + 1 deel stopoplossing). Controleer met pH-indicatorpapier dat het eindmengsel pH 9,5 of hoger heeft. Is dat niet zo, gebruik dan meer stopoplossing of een sterkere oplossing en maak de ijkreeks op dezelfde manier.
• Standaard: 1 mM p-nitrofenol is 1 nmol per µL. Andere sterkte: volume (µL) = nmol ÷ concentratie (mM).
• Buffers: buffer pH 5 en buffer pH 7,2 van elke leverancier zijn bruikbaar. Wilt u buffers mengen, doe dat dan alleen met buffers van dezelfde soort en sterkte, en meet de pH altijd na.

Controle vóór de eerste les (docent of TOA)

Enzympreparaten, substraten en buffers verschillen per leverancier en per batch. Voer onderstaande controle daarom één keer uit, met één proefgroep, voordat de klas het practicum doet en telkens als u een nieuw preparaat, nieuwe buffer of nieuw substraat gebruikt. Reken op ca. 45 tot 60 minuten. Leerlingen hoeven hier niets van te weten.

Noteer na afloop: werkverdunning, ijkstap per tijdstip, tijdstip waarop de curve afvlakt.

⚠️ CMR-check – gevaarstoffen

Voor dit practicum zijn geen CMR-stoffen nodig (kankerverwekkend, mutageen of reproductietoxisch). Controleer wel het veiligheidsinformatieblad (VIB) van uw materiaal, want sommige samenstellingen bevatten wel een CMR-stof:

• Stopoplossing: bij sommige leveranciers is de stopoplossing van pH 9–10 een boraatbuffer met boorzuur of borax (Repr. 1B, H360FD). Dat is een CMR-stof. Vervang die door een carbonaatoplossing: 0,2 M natriumcarbonaat (21,2 g Na₂CO₃ per liter water) als 2× stopoplossing. Natriumcarbonaat is irriterend voor de ogen (H319) maar niet CMR. Controleer met pH-indicatorpapier dat het eindmengsel pH 9,5 of hoger heeft.
• p-Nitrofenol (standaard) en pNPG (substraat): niet CMR-ingedeeld. Volgens de meeste VIB's is p-nitrofenol schadelijk bij inslikken, huidcontact en inademen. De verdunde standaard (1 mM, ca. 0,14 g per liter) en de reactiemengsels zijn laag-risico, maar lees het VIB van uw leverancier en gebruik handschoenen.
• Conserveermiddelen in enzym of buffer: sommige preparaten bevatten natriumazide (zeer giftig, geen CMR). Kies bij voorkeur preparaten zonder azide en lees het etiket.

Achtergrondinformatie

Enzymen zijn eiwitten die chemische reacties in cellen versnellen (katalyseren). Het substraat past op de actieve plaats van het enzym en vormt daar een enzymsubstraatcomplex; daarna ontstaat product.

Reactieverloop: in het begin is er veel substraat, zijn veel actieve plaatsen bezet en ontstaat er per minuut veel product. Naarmate het substraat opraakt, daalt de substraatconcentratie en daarmee de snelheid. De hoeveelheid product nadert uiteindelijk een maximum: er is dan (vrijwel) geen substraat meer. Bij sommige enzymen remt ook het product de reactie. De beginsnelheid lees je af uit de helling van het eerste, rechte deel van de grafiek.

Dit practicum gebruikt een lage substraatconcentratie (0,2 mM, in elk monster van 200 µL ongeveer 40 nmol substraat), zodat de omzetting binnen 30 minuten duidelijk zichtbaar vordert. In de andere enzympractica gebruik je 1 mM en kort incuberen, om de beginsnelheid te meten.

Het kleurstofsubstraat en de kleurmeting

In de natuur splitst cellobiase (ook wel β-glucosidase) cellobiose in twee moleculen glucose. In dit practicum gebruik je een kunstmatig substraat, p-nitrofenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG). De actieve plaats van het enzym herkent de binding tussen glucose en de rest van het molecuul, en splitst pNPG in glucose en p-nitrofenol:

pNPG + H₂O → glucose + p-nitrofenol (gekatalyseerd door cellobiase)

pNPG is kleurloos. p-Nitrofenol is een indicator: bij een zure of neutrale pH is het vrijwel kleurloos, bij pH 9 of hoger is het geel (als p-nitrofenolaat). Voeg je na de reactie een stopoplossing met een hoge pH toe, dan gebeurt er twee dingen tegelijk: het enzym werkt niet meer (de reactie is gestopt) en de gele kleur wordt zichtbaar. Hoe geler het mengsel, hoe meer p-nitrofenol er is gevormd, en dus hoe meer substraat is omgezet.

Zonder spectrofotometer vergelijk je de kleur met een ijkreeks: buisjes met een bekende hoeveelheid p-nitrofenol (de standaard) in dezelfde stopoplossing en hetzelfde volume. Voor elk reactiebuisje zoek je het ijkbuisje met dezelfde kleur en lees je af hoeveel nmol product is gevormd (1 nmol = 10⁻⁹ mol). Die vergelijking is een schatting: reken op een leesonzekerheid van ongeveer een halve stap tussen twee ijkbuisjes.

Dit practicum gaat uit van pNPG als substraat en p-nitrofenol als standaard. Controleer dat op de etiketten van uw materiaal.

Benodigdheden – per groep van 2 tot 3 leerlingen

Veiligheid

• Draag gedurende het hele practicum een veiligheidsbril, handschoenen en een labjas.
• De stopoplossing is basisch (pH 9–10) en irriteert ogen en huid. Bij contact met de ogen minstens 15 minuten spoelen met water en een arts raadplegen.
• p-Nitrofenol (standaard en reactieproduct) en pNPG: niet inslikken, geen contact met huid of ogen, handen wassen na afloop. Lees het VIB van uw leverancier.
• Pipetteer nooit met de mond.
• Afval: de gele reactiemengsels en ijkbuisjes bevatten p-nitrofenol. Verzamel ze in een afvalcontainer voor waterige oplossingen en bied ze aan als chemisch afval volgens het schoolreglement. Niet door de gootsteen spoelen.

Werkwijze

Tijdsplanning (45 minuten): 0–7 min: instructie, buisjes labelen en stopoplossing pipetteren • 7–10 min: hoofdmengsel maken • 10–40 min: monsters nemen en stoppen op t = 0, 2, 5, 10, 20 en 30 minuten (ondertussen vragen maken) • 40–45 min: kleur aflezen. Verwerking in een tweede lesdeel of als huiswerk. Alles gebeurt bij kamertemperatuur.

Deel A – Voorbereiding

1. Labelen: schrijf op zes eps de tijden 0, 2, 5, 10, 20 en 30 (minuten), plus de groepsletter. Zet ze in het rekje.
2. Stopoplossing: pipetteer in elk van de zes eps 200 µL 2× stopoplossing. Zo hoef je tijdens de meting niet te zoeken.

Deel B – Hoofdmengsel maken en monsters nemen

1. Hoofdmengsel: maak in het grote buisje of bekertje het mengsel uit de tabel, maar voeg het enzym als laatste toe. Meng door voorzichtig op en neer te pipetteren.
2. Starten: voeg het enzym toe en start je timer (t = 0). Meng direct door 3 keer op en neer te pipetteren.
3. Eerste monster (t = 0): neem zo snel mogelijk 200 µL en pipetteer dat in het buisje met stopoplossing met label 0. Meng.
4. Volgende monsters: neem op 2, 5, 10, 20 en 30 minuten telkens 200 µL uit het hoofdmengsel (eerst zacht roeren door op en neer te pipetteren) en doe het in het buisje met de bijpassende tijd. Meng elk buisje meteen.
5. Wachten: maak tussen de monsters de verwerkingsvragen 1 en 2.

Deel C – Kleur aflezen

Kleur aflezen zonder apparatuur

1. Zet de zeven ijkbuisjes (0 tot 40 nmol) op volgorde in een rekje, met een vel wit papier erachter.
2. Zet je reactiebuisjes er direct naast. Kijk horizontaal, op ooghoogte, bij daglicht of wit licht (geen gekleurde achtergrond, geen fel zonlicht).
3. Zoek per reactiebuisje de twee ijkbuisjes met een kleur net lichter en net donkerder en schat het aantal nmol, bijvoorbeeld “tussen 16 en 24, dus 20 nmol”. Is er geen verschil met het blanco-ijkbuisje (0 nmol), noteer dan < 4 nmol. Is het buisje donkerder dan 40 nmol, noteer dan > 40 nmol.
4. Laat een tweede leerling de buisjes onafhankelijk aflezen en noteer beide waarden. Maak een foto van de opstelling (alle buisjes in één beeld, zelfde licht).

Vul de tabel in. % substraat omgezet = gevormde nmol ÷ 40 nmol × 100 % (elk monster van 200 µL bevat 40 nmol substraat).

Deel D – Grafiek tekenen

• Zet de tijd (min) op de x-as en het gevormde product (nmol) op de y-as.
• Teken door de punten een vloeiende lijn. Bepaal de beginsnelheid uit de helling van het eerste rechte deel (bijvoorbeeld tussen 0 en 5 minuten): helling = (nmol op 5 min − nmol op 0 min) ÷ 5 min.
• Geef aan vanaf welk tijdstip de grafiek afvlakt.

Verwerkingsvragen

1. (VWO) Waarom stop je elk monster direct met stopoplossing?
2. (VWO) Beschrijf het verloop van de grafiek. Waarom neemt de hoeveelheid product per minuut af?
3. (VWO) Bepaal de beginsnelheid in nmol/min en bereken welk percentage van het substraat na 30 minuten is omgezet.
4. (VWO) In de andere enzympractica is 1 mM substraat (200 nmol per reactie) en 10 minuten incubatie gebruikt, met 20 nmol product. Bereken welk percentage van het substraat dan is omgezet en beoordeel of dat een beginsnelheid is. Doe hetzelfde voor jouw meting na 10 minuten in dit practicum.
5. (VWO) Het product neemt na lange tijd niet meer toe. Hoe kun je met een extra proef nagaan of dat komt doordat het substraat op is of doordat het enzym niet meer werkt?
6. (VWO) De kleurmeting is een schatting. Noem twee manieren om de nauwkeurigheid van deze meting te verbeteren.
7. (VWO, verdieping) Noem naast het opraken van het substraat een tweede mogelijke oorzaak dat de snelheid afneemt, en leg uit hoe je dat zou onderzoeken.

Uitwerking

Verwachting: de grafiek stijgt in het begin bijna lineair en vlakt dan af naar een waarde in de buurt van 40 nmol (het substraat in een monster van 200 µL). Is het enzym zeer actief, dan is de grafiek na 10 minuten al afgevlakt; is het weinig actief, dan zijn de monsters tot en met 30 minuten nog in de stijgende fase. Stel de enzymverdunning in de voortest zo in dat de kleur na 10 minuten ongeveer halverwege de ijkreeks ligt.

V1: De reactie gaat door zolang er enzym, substraat en een bruikbare pH zijn. Stoppen met stopoplossing legt het product vast op het moment van het monster, zodat alle monsters vergelijkbaar zijn met de ijkreeks.

V2: Eerst stijgt de grafiek steil en daarna steeds minder steil tot hij vlak is. De snelheid neemt af omdat de substraatconcentratie daalt: er zijn minder enzymsubstraatcomplexen per seconde. Uiteindelijk is bijna al het substraat omgezet en komt er geen product meer bij.

V3: Beginsnelheid = helling van het eerste rechte deel. Voorbeeld: 12 nmol na 5 minuten en 0 nmol op t = 0 geeft 12 ÷ 5 = 2,4 nmol/min. Percentage omgezet na 30 minuten = nmol op 30 min ÷ 40 × 100 %; bij 36 nmol is dat 90 %.

V4: In de andere practica: 20 ÷ 200 × 100 = 10 %. Dat is minder dan ca. 20 %, dus de meting benadert de beginsnelheid. In dit practicum is 40 nmol substraat aanwezig; bij 20 nmol product is 50 % omgezet, dus na 10 minuten is de snelheid niet meer de beginsnelheid en lees je de helling uit het eerste deel van de grafiek af.

V5: Voeg aan het restant van het hoofdmengsel (of aan een nieuw mengsel op het plateau) extra substraat toe. Neemt de kleur dan weer toe, dan was het substraat op en is het enzym nog actief. Gebeurt er niets, dan werkt het enzym niet meer (bijvoorbeeld door denaturatie of remming door het product).

V6: Bijvoorbeeld: een fijnere ijkreeks met meer buisjes; twee personen onafhankelijk laten aflezen en het gemiddelde nemen; de meting in duplo uitvoeren; de blauwwaarde op een foto meten in plaats van met het oog; of een spectrofotometer gebruiken.

V7: Productremming: de reactieproducten (zoals glucose) kunnen het enzym remmen. Onderzoek: voer de proef uit met extra glucose in het mengsel en vergelijk de beginsnelheid met een proef zonder extra glucose. Een lagere snelheid wijst op productremming. Dit is verdieping en geen examenstof.

Niveauverdieping

• VWO 5/6: alle vragen, grafiek en berekening van de beginsnelheid.
• Extra: herhaal het practicum met een andere enzymverdunning (bijvoorbeeld twee keer zo geconcentreerd) en vergelijk de beginsnelheden en het tijdstip van afvlakken.
• Extra: doe de proef bij een andere temperatuur (zie het temperatuurpracticum) en vergelijk de beginsnelheden.

Benodigde laboratoriumartikelen

Voor dit practicum heeft u onder meer micropipetten en pipetpunten, reactievaatjes, rekjes en pH-indicatorpapier nodig. Bekijk het assortiment: pipetten, pipetpunten, centrifugebuizen & reactievaatjes, rekken & standaards, bekers & erlenmeyers, indicatoren & pH-papier. Neem contact op voor advies.

Meer practicumopdrachten

Dit practicum is onderdeel van een reeks van vier enzympractica met cellobiase. Ze zijn los van elkaar uit te voeren, maar sluiten inhoudelijk op elkaar aan:

• Practicum: Invloed van pH op enzymwerking (HAVO/VWO) – bij welke pH werkt cellobiase het best en wat gebeurt er buiten het optimum?
• Practicum: Invloed van temperatuur op enzymwerking (HAVO/VWO) – hoe verandert de enzymactiviteit met de temperatuur en wanneer treedt denaturatie op?
• Practicum: Substraatconcentratie en enzymwerking (VWO) – hoe hangt de reactiesnelheid af van de hoeveelheid substraat, tot aan verzadiging?

Ook interessant: DNA knippen met restrictie-enzymen en gelelektroforese van DNA voor VWO.

Ontdek alle practica in de Labvakhandel kennisbank — voor biologie, scheikunde en natuurkunde.