Practicum: Substraatconcentratie en enzymwerking – Biologie VWO

In dit practicum onderzoek je hoe de hoeveelheid substraat de snelheid van een enzymreactie beïnvloedt. Je laat cellobiase reageren met vijf verschillende substraatconcentraties en meet hoeveel gele kleurstof er in 10 minuten ontstaat. Je meet de kleur zonder apparatuur door hem te vergelijken met een ijkreeks. Je ontdekt dat de snelheid eerst toeneemt en dan niet verder stijgt: de verzadiging van het enzym.

Dit practicum staat los van de andere enzympractica (pH, temperatuur en reactieverloop in de tijd). Het past in één les van 45 minuten.

Leerdoelen

• uit eigen metingen de relatie tussen substraatconcentratie en reactiesnelheid weergeven in een grafiek;
• verklaren met het enzymsubstraatcomplex waarom de snelheid eerst toeneemt en daarna afvlakt (verzadiging);
• uitleggen waarom je de beginsnelheid meet en controleren of dat gelukt is;
• beredeneren welke invloed meer enzym op de maximale snelheid heeft.

Cursusniveau en vakgebied

Vak: Biologie | Domein: Zelfregulatie – enzymwerking | Duur: 1 les van 45 minuten (+ ca. 30 minuten voorbereiding door de docent of TOA) | Klas: VWO 5 (bovenbouw, na de behandeling van enzymwerking)

Aansluiting op de eindtermen

Bron: syllabi biologie havo en vwo van het College voor Toetsen en Examens (havo 2024, vwo 2025/2027). Controleer de syllabus van het actuele examenjaar.

Het effect van de substraatconcentratie op de reactiesnelheid staat niet als aparte eindterm in de syllabus. Het sluit aan op de eindterm over het enzymsubstraatcomplex. Km, Vmax en Lineweaver-Burk staan niet in het examenprogramma; ze zijn hier alleen als verdieping opgenomen.

Voorbereiding door docent of TOA

Reken op ca. 30 minuten. Zonder voortest en ijkreeks is het practicum niet uitvoerbaar.

IJkreeks voor de hele klas (docent of TOA)

De ijkreeks is de “meetlat” voor de kleurmeting. Maak één set per twee groepen, van tevoren, in zeven gelabelde eps van 1,5 mL. Pipetteer eerst de buffer, dan de standaard, en voeg de stopoplossing als laatste toe. Sluit de buisjes en meng goed (vortex of omkeren). Eindvolume 400 µL per buisje. 1 mM standaard is 1 nmol per µL, dus het aantal µL standaard is gelijk aan het aantal nmol maal 1 (zie tabel).

Maak de reeks op de dag zelf of de dag ervoor en bewaar de buisjes afgesloten en donker. Staat er op uw standaard een andere concentratie dan 1 mM, reken dan de volumes om: volume (µL) = gewenste nmol ÷ concentratie (mM).

Voortest: enzymverdunning bepalen (docent of TOA, ca. 15 minuten)

De activiteit van enzympreparaten verschilt sterk per leverancier en per batch. Zonder voortest is de kans groot dat alle buisjes bijna kleurloos of juist ver buiten de ijkreeks zijn. Doe daarom vooraf:

1. Maak drie verdunningen van het enzym in buffer pH 5: 1:10 (20 µL enzym + 180 µL buffer), 1:100 (20 µL van de 1:10 + 180 µL buffer) en 1:1000. Houd ze op ijs.
2. Pipetteer per verdunning in een eps: 100 µL buffer pH 5 + 80 µL substraat (10 mM) = [S] 4 mM. Start met 20 µL verdund enzym, meng, en incubeer precies 10 minuten bij kamertemperatuur.
3. Stop met 200 µL 2× stopoplossing, meng en vergelijk met de ijkreeks.
4. Gewenst: een kleur die overeenkomt met ijkbuisje 4 tot 5 (24 tot 32 nmol). Te licht: minder verdunnen (bijvoorbeeld 1:30). Te donker: meer verdunnen. Herhaal tot de kleur past en noteer de werkverdunning.

Controle op verzadiging: herhaal de voortest met 2 mM (40 µL substraat + 140 µL buffer) en met 0,2 mM (4 µL substraat + 176 µL buffer). Is de kleur bij 4 mM niet duidelijk donkerder dan bij 2 mM en is de kleur bij 0,2 mM nog te onderscheiden van het blanco (minimaal 4 nmol), dan is de reeks geschikt. Is er bij 0,2 mM geen kleur, verhoog dan de enzymhoeveelheid. Neemt de kleur bij 4 mM nog sterk toe, dan heeft het enzym een hoge K_m; zie Overige voorbereiding.

Overige voorbereiding

• Maak per groep ca. 300 µL werkverdunning van het enzym (op ijs), ca. 200 µL substraatoplossing (10 mM), ca. 1 mL buffer pH 5 en 1,5 mL stopoplossing.
• Controleer in de voortest of de kromme verzadigt (zie Voortest). Bereikt het enzym bij 4 mM geen plateau (hoge K_m), gebruik dan een substraatoplossing van 20 mM met dezelfde volumes als in de tabel. De concentraties in de reactie worden dan 0,4; 0,8; 2; 4 en 8 mM. Pas de kolom [S] in de tabel van de leerlingen aan.
• Noteer de kamertemperatuur. De proef verloopt bij kamertemperatuur, dus een waterbad is niet nodig.
• Controleer met pH-indicatorpapier of in een proefbuisje het eindmengsel (reactie + stopoplossing) pH 9,5 of hoger heeft.

Aanpassen aan uw materiaal – werkt met elke leverancier

De volumes in dit practicum zijn zo gekozen dat ze met een micropipet van 2–20 µL en een micropipet van 20–200 µL te pipetteren zijn. Wijkt uw materiaal af, gebruik dan deze regels:

• Substraat: in 200 µL reactie geldt [S] (mM) = volume substraat (µL) × sterkte van uw oplossing (mM) ÷ 200. Dit practicum gaat uit van een substraatoplossing van 10 mM. Is de uwe 5 mM, verdubbel dan de substraatvolumes (en neem evenveel minder buffer). Is de uwe sterker, verdun dan eerst met buffer pH 5 tot 10 mM.
• Enzym: altijd 20 µL verdund enzym per 200 µL reactie (10 %). De sterkte regel je met de verdunning, zie Voortest. Gevriesdroogd enzym reconstitueert u volgens de aanwijzing van de leverancier.
• Stopoplossing: bedoeld als 2× sterkte (1 deel reactie + 1 deel stopoplossing). Controleer met pH-indicatorpapier dat het eindmengsel pH 9,5 of hoger heeft. Is dat niet zo, gebruik dan meer stopoplossing of een sterkere oplossing en maak de ijkreeks op dezelfde manier.
• Standaard: 1 mM p-nitrofenol is 1 nmol per µL. Andere sterkte: volume (µL) = nmol ÷ concentratie (mM).
• Buffers: buffer pH 5 en buffer pH 7,2 van elke leverancier zijn bruikbaar. Wilt u buffers mengen, doe dat dan alleen met buffers van dezelfde soort en sterkte, en meet de pH altijd na.

Controle vóór de eerste les (docent of TOA)

Enzympreparaten, substraten en buffers verschillen per leverancier en per batch. Voer onderstaande controle daarom één keer uit, met één proefgroep, voordat de klas het practicum doet en telkens als u een nieuw preparaat, nieuwe buffer of nieuw substraat gebruikt. Reken op ca. 45 tot 60 minuten. Leerlingen hoeven hier niets van te weten.

Noteer na afloop: werkverdunning, ijkstap per substraatconcentratie, concentratie waarbij het plateau begint.

⚠️ CMR-check – gevaarstoffen

Voor dit practicum zijn geen CMR-stoffen nodig (kankerverwekkend, mutageen of reproductietoxisch). Controleer wel het veiligheidsinformatieblad (VIB) van uw materiaal, want sommige samenstellingen bevatten wel een CMR-stof:

• Stopoplossing: bij sommige leveranciers is de stopoplossing van pH 9–10 een boraatbuffer met boorzuur of borax (Repr. 1B, H360FD). Dat is een CMR-stof. Vervang die door een carbonaatoplossing: 0,2 M natriumcarbonaat (21,2 g Na₂CO₃ per liter water) als 2× stopoplossing. Natriumcarbonaat is irriterend voor de ogen (H319) maar niet CMR. Controleer met pH-indicatorpapier dat het eindmengsel pH 9,5 of hoger heeft.
• p-Nitrofenol (standaard) en pNPG (substraat): niet CMR-ingedeeld. Volgens de meeste VIB's is p-nitrofenol schadelijk bij inslikken, huidcontact en inademen. De verdunde standaard (1 mM, ca. 0,14 g per liter) en de reactiemengsels zijn laag-risico, maar lees het VIB van uw leverancier en gebruik handschoenen.
• Conserveermiddelen in enzym of buffer: sommige preparaten bevatten natriumazide (zeer giftig, geen CMR). Kies bij voorkeur preparaten zonder azide en lees het etiket.

Achtergrondinformatie

Enzymen zijn eiwitten die chemische reacties in cellen versnellen (katalyseren). Het substraat past op de actieve plaats van het enzym en vormt daar tijdelijk een enzymsubstraatcomplex; daarna wordt het substraat omgezet in product en komt het enzym vrij om opnieuw te werken.

Substraatconcentratie en snelheid: bij een lage substraatconcentratie zijn de meeste actieve plaatsen vrij. Verhoog je de concentratie, dan vormen zich meer enzymsubstraatcomplexen en neemt de snelheid bijna evenredig toe. Bij een hoge concentratie zijn bijna alle actieve plaatsen bezet. Extra substraat levert dan geen hogere snelheid meer op: het enzym is verzadigd en de snelheid bereikt een maximum (V_max). Die maximale snelheid hangt af van de hoeveelheid enzym.

Beginsnelheid: naarmate de reactie vordert, neemt de hoeveelheid substraat af en daarmee de snelheid. Om de snelheid bij een bepaalde substraatconcentratie te meten, laat je de reactie daarom kort lopen, zodat maar een klein deel (minder dan ca. 20 %) van het substraat is omgezet. Dat noemen we de beginsnelheid.

Het kleurstofsubstraat en de kleurmeting

In de natuur splitst cellobiase (ook wel β-glucosidase) cellobiose in twee moleculen glucose. In dit practicum gebruik je een kunstmatig substraat, p-nitrofenyl-β-D-glucopyranoside (pNPG). De actieve plaats van het enzym herkent de binding tussen glucose en de rest van het molecuul, en splitst pNPG in glucose en p-nitrofenol:

pNPG + H₂O → glucose + p-nitrofenol (gekatalyseerd door cellobiase)

pNPG is kleurloos. p-Nitrofenol is een indicator: bij een zure of neutrale pH is het vrijwel kleurloos, bij pH 9 of hoger is het geel (als p-nitrofenolaat). Voeg je na de reactie een stopoplossing met een hoge pH toe, dan gebeurt er twee dingen tegelijk: het enzym werkt niet meer (de reactie is gestopt) en de gele kleur wordt zichtbaar. Hoe geler het mengsel, hoe meer p-nitrofenol er is gevormd, en dus hoe meer substraat is omgezet.

Zonder spectrofotometer vergelijk je de kleur met een ijkreeks: buisjes met een bekende hoeveelheid p-nitrofenol (de standaard) in dezelfde stopoplossing en hetzelfde volume. Voor elk reactiebuisje zoek je het ijkbuisje met dezelfde kleur en lees je af hoeveel nmol product is gevormd (1 nmol = 10⁻⁹ mol). Die vergelijking is een schatting: reken op een leesonzekerheid van ongeveer een halve stap tussen twee ijkbuisjes.

Dit practicum gaat uit van pNPG als substraat en p-nitrofenol als standaard. Controleer dat op de etiketten van uw materiaal.

Benodigdheden – per groep van 2 tot 3 leerlingen

Veiligheid

• Draag gedurende het hele practicum een veiligheidsbril, handschoenen en een labjas.
• De stopoplossing is basisch (pH 9–10) en irriteert ogen en huid. Bij contact met de ogen minstens 15 minuten spoelen met water en een arts raadplegen.
• p-Nitrofenol (standaard en reactieproduct) en pNPG: niet inslikken, geen contact met huid of ogen, handen wassen na afloop. Lees het VIB van uw leverancier.
• Pipetteer nooit met de mond.
• Afval: de gele reactiemengsels en ijkbuisjes bevatten p-nitrofenol. Verzamel ze in een afvalcontainer voor waterige oplossingen en bied ze aan als chemisch afval volgens het schoolreglement. Niet door de gootsteen spoelen.

Werkwijze

Tijdsplanning (45 minuten): 0–5 min: instructie en veiligheid • 5–15 min: pipetteren en starten • 15–27 min: incuberen en stoppen (elk buisje precies 10 minuten) • 27–35 min: kleur aflezen • 35–45 min: grafiek en vragen (of als huiswerk). Alles gebeurt bij kamertemperatuur.

Deel A – Reacties starten en stoppen

1. Labelen: schrijf op zes eps: 1 t/m 5 en B (blanco), plus de groepsletter. Zet ze in het rekje.
2. Buffer: pipetteer in elk buisje de hoeveelheid buffer pH 5 uit de tabel hieronder.
3. Substraat: voeg de hoeveelheid substraat (10 mM) uit de tabel toe en meng. Gebruik voor kleine volumes (4 en 8 µL) de micropipet van 2–20 µL, voor de overige de micropipet van 20–200 µL.
4. Starten: start de timer en voeg volgens het schema, met intervallen van 30 seconden, 20 µL verdund enzym toe. Meng meteen 3 seconden. Het blanco-buisje krijgt 20 µL buffer pH 5 in plaats van enzym.
5. Incuberen: laat elk buisje precies 10 minuten in het rekje staan (kamertemperatuur).
6. Stoppen: voeg op de aangegeven tijd 200 µL 2× stopoplossing toe en meng.

Deel B – Kleur aflezen

Kleur aflezen zonder apparatuur

1. Zet de zeven ijkbuisjes (0 tot 40 nmol) op volgorde in een rekje, met een vel wit papier erachter.
2. Zet je reactiebuisjes er direct naast. Kijk horizontaal, op ooghoogte, bij daglicht of wit licht (geen gekleurde achtergrond, geen fel zonlicht).
3. Zoek per reactiebuisje de twee ijkbuisjes met een kleur net lichter en net donkerder en schat het aantal nmol, bijvoorbeeld “tussen 16 en 24, dus 20 nmol”. Is er geen verschil met het blanco-ijkbuisje (0 nmol), noteer dan < 4 nmol. Is het buisje donkerder dan 40 nmol, noteer dan > 40 nmol.
4. Laat een tweede leerling de buisjes onafhankelijk aflezen en noteer beide waarden. Maak een foto van de opstelling (alle buisjes in één beeld, zelfde licht).

Vul de resultatentabel in. Snelheid v (nmol/min) = gevormde nmol ÷ 10 min (trek zo nodig het blanco af). % substraat omgezet = gevormde nmol ÷ substraat (nmol) × 100 %.

Deel C – Grafiek tekenen

• Zet de substraatconcentratie (mM) op de x-as en de snelheid (nmol/min) op de y-as.
• Teken door de punten een vloeiende lijn (geen rechte stukken) en geef aan waar de lijn afvlakt.
• Noteer bij elk punt of de waarde een schatting is (< 4 nmol of > 40 nmol zijn geen exacte waarden).

Verwerkingsvragen

1. (VWO) Waarom heeft het blanco-buisje de hoogste substraatconcentratie?
2. (VWO) Beschrijf hoe de snelheid verandert als de substraatconcentratie toeneemt.
3. (VWO) Verklaar het afvlakken van de grafiek met behulp van het enzymsubstraatcomplex.
4. (VWO) Je herhaalt de proef met twee keer zoveel enzym. Wat verandert er aan de maximale snelheid? Leg uit.
5. (VWO) Waarom meet je de beginsnelheid? Bereken voor buisje 1 en 5 welk percentage van het substraat is omgezet en beoordeel of je de beginsnelheid hebt gemeten (richtwaarde: minder dan ca. 20 %).
6. (VWO) pNPG komt niet in de natuur voor, maar cellobiase splitst het wel. Wat zegt dat over de actieve plaats?
7. (VWO, verdieping – niet in de syllabus) Schat uit je grafiek V_max (het plateau) en de substraatconcentratie waarbij de snelheid de helft van V_max is (K_m). Wat zegt een lage K_m over de binding van het substraat?

Uitwerking

Verwachting: de kromme stijgt eerst bijna lineair en vlakt dan af. Bij cellobiase met een hoge K_m (bijvoorbeeld enkele mM) is bij 4 mM nog geen volledig plateau bereikt; dat is een geldige uitkomst. Gebruik de voortest om dit vooraf te zien. Bij het laagste punt (0,2 mM) is de gevormde hoeveelheid soms kleiner dan de detectiegrens (< 4 nmol); noteer dat zo.

V1: Het blanco-buisje (zonder enzym) bij 4 mM laat zien dat het substraat bij de hoogste concentratie niet vanzelf wordt gesplitst. Is er daar al geen kleur, dan is er bij lagere concentraties ook geen probleem. Is het geel, trek die waarde af van alle buisjes.

V2: Bij lage concentraties neemt de snelheid ongeveer evenredig toe met de substraatconcentratie; bij hogere concentraties neemt de toename af en nadert de snelheid een maximum.

V3: Bij een lage concentratie zijn veel actieve plaatsen vrij: meer substraat betekent meer enzymsubstraatcomplexen en een hogere snelheid. Bij een hoge concentratie zijn bijna alle actieve plaatsen bezet; de hoeveelheid enzym begrenst nu de snelheid. Extra substraat kan niet meer reageren, dus de snelheid stijgt niet verder (verzadiging).

V4: De maximale snelheid wordt ongeveer twee keer zo hoog, want er zijn twee keer zoveel actieve plaatsen. Bij elke substraatconcentratie is de snelheid dan hoger, maar de vorm van de kromme blijft vergelijkbaar.

V5: Tijdens de reactie neemt de substraatconcentratie af, waardoor de snelheid daalt. Door kort te meten, blijft de concentratie vrijwel gelijk aan de beginwaarde. Rekenvoorbeeld: bij 0,2 mM is er 40 nmol substraat (0,2 mM × 0,2 mL × 1000). Is er bijvoorbeeld 8 nmol product, dan is 8 ÷ 40 × 100 = 20 % omgezet: net op de grens. Bij 4 mM is er 800 nmol substraat en 30 nmol product slechts 3,8 %. Bij de lage concentraties is de beginsnelheid dus het minst betrouwbaar; kies bij twijfel een kortere incubatietijd.

V6: De actieve plaats herkent kennelijk niet het hele substraat, maar vooral de glucosegroep en de béta-binding. pNPG heeft dezelfde binding als cellobiose, dus het past op de actieve plaats. Een enzym is specifiek voor de vorm van het substraat; een kunstmatig substraat kan toch passen als het die kenmerken heeft.

V7: V_max is de snelheid op het plateau. K_m is de substraatconcentratie bij ½ V_max. Een lage K_m betekent dat het enzym het substraat al bij een lage concentratie goed bindt: een hoge affiniteit. Dit is verdieping en geen examenstof.

Niveauverdieping

• VWO 5: vragen 1 t/m 6 en de grafiek.
• Verdieping (profielwerkstuk, geen eindterm): teken een Lineweaver-Burk-grafiek (1/v tegen 1/[S]) en bepaal V_max en K_m uit het snijpunt en de helling. Bespreek de grote meetonzekerheid bij een visuele kleurmeting.
• Extra: herhaal het practicum met de dubbele hoeveelheid enzym (40 µL in plaats van 20 µL, 20 µL minder buffer) en vergelijk de plateaus.

Benodigde laboratoriumartikelen

Voor dit practicum heeft u onder meer micropipetten en pipetpunten, reactievaatjes, rekjes en pH-indicatorpapier nodig. Bekijk het assortiment: pipetten, pipetpunten, centrifugebuizen & reactievaatjes, rekken & standaards, indicatoren & pH-papier. Neem contact op voor advies.

Meer practicumopdrachten

Dit practicum is onderdeel van een reeks van vier enzympractica met cellobiase. Ze zijn los van elkaar uit te voeren, maar sluiten inhoudelijk op elkaar aan:

• Practicum: Invloed van pH op enzymwerking (HAVO/VWO) – bij welke pH werkt cellobiase het best en wat gebeurt er buiten het optimum?
• Practicum: Invloed van temperatuur op enzymwerking (HAVO/VWO) – hoe verandert de enzymactiviteit met de temperatuur en wanneer treedt denaturatie op?
• Practicum: Reactieverloop van een enzymreactie in de tijd (VWO) – hoe verloopt de productvorming in de tijd en waarom neemt de snelheid af?

Ook interessant: DNA knippen met restrictie-enzymen en gelelektroforese van DNA voor VWO.

Ontdek alle practica in de Labvakhandel kennisbank — voor biologie, scheikunde en natuurkunde.