Een fasecontrastmicroscoop is een lichtmicroscoop die doorzichtige, ongekleurde preparaten zichtbaar maakt, zoals levende cellen, bacteriën en gistcellen. In een gewone helderveldmicroscoop zijn zulke preparaten nauwelijks te zien, omdat ze het licht bijna niet dempen. Fasecontrast zet de kleine vertragingen die het licht in zo’n preparaat oploopt om in verschillen in helderheid. Daardoor hoeft u niet te fixeren of te kleuren en blijven de cellen in leven. Het artikel Microscoop: types, onderdelen en gebruik behandelt de microscoop als geheel. Dit artikel gaat dieper in op fasecontrast zelf: het principe, de onderdelen, het instellen, de artefacten, de vergelijking met andere contrastmethoden en de toepassingen.
Een fasecontrastmicroscoop is een lichtmicroscoop met twee extra optische onderdelen: een ringvormig diafragma in de condensor en een faseplaat in het objectief. Samen zetten ze faseverschillen in het licht om in zichtbaar contrast. De techniek is bedacht voor preparaten die doorzichtig zijn en daardoor weinig licht absorberen.
Een irisdiafragma in de condensor regelt de opening van de lichtbundel en daarmee het evenwicht tussen contrast en resolutie. Bij fasecontrast hoort in plaats daarvan een vast ringdiafragma (annulus), dat het licht als een holle kegel op het preparaat richt. De gewone instelling van het irisdiafragma werkt dan niet meer als contrastregeling. De werking van het irisdiafragma staat uitgebreid bij Microscoop: types, onderdelen en gebruik.
Cellen bestaan grotendeels uit water en zijn doorzichtig. Het licht gaat er vrijwel ongedempt doorheen, dus het oog ziet geen helderheidsverschil. Wel is het licht dat door een cel gaat iets vertraagd ten opzichte van het licht dat erlangs gaat, omdat de cel optisch dichter is dan het medium. Dat verschil in fase kan het oog niet waarnemen. Fasecontrast maakt het zichtbaar.
Het principe is bedacht door Frits Zernike. Het draait om het scheiden en daarna weer combineren van twee lichtbundels: het directe licht dat het preparaat niet beïnvloedt en het licht dat door het preparaat is afgebogen.
Bij positief fasecontrast, de gangbare uitvoering, liggen cellen en structuren donker op een lichtgrijze achtergrond. Bij negatief fasecontrast is de faseplaat zo uitgevoerd dat de structuren juist helder oplichten tegen een donkere achtergrond. Welke u kiest, is deels een kwestie van smaak en deels van het preparaat. De fabrikant geeft op het objectief aan welk type het is.
U ziet levende, ongekleurde cellen met hun contouren, de celkern met kernlichaampjes, vacuolen, lipidedruppels en andere structuren die optisch dichter of minder dicht zijn dan hun omgeving. Ook processen zijn te volgen: celdeling, beweging van bacteriën en protozoën en het groeien en knoppen van gist. Details zijn minder scherp dan in een gekleurd preparaat, maar de cel blijft intact.
Een fasecontrastmicroscoop is een gewone lichtmicroscoop met extra onderdelen. Een helderveldmicroscoop kan vaak worden uitgebreid met een fasecontrastset, mits condensor en revolver geschikt zijn.
De tubus verbindt het oculair met de revolver en bepaalt mede de optische weg tussen objectief en oogstuk. Bij een binoculaire of trinoculaire tubus zit er ook een camerapoort op. Voor fasecontrast is de tubus van belang omdat u er het oculair uit haalt en de centreerkijker in plaatst. Meer over de typen tubus leest u in Microscoop: types, onderdelen en gebruik.
De lens bovenaan, waar u doorheen kijkt, heet het oculair of oogstuk. De lenzen onderaan, dicht bij het preparaat, heten objectieven.
Het instellen bestaat uit twee delen: eerst de belichting correct opzetten, daarna elk ringdiafragma centreren ten opzichte van de bijbehorende faseplaat.
De heldere ring van het ringdiafragma moet precies samenvallen met de donkere ring van de faseplaat. Alleen dan wordt het directe licht door de faseplaat gedempt en verschoven, terwijl het afgebogen licht ongehinderd passeert. Een objectief en een ringdiafragma met verschillende aanduidingen passen niet bij elkaar.
Fasecontrast is geschikt voor dunne, doorzichtige preparaten, maar niet zonder nadelen:
Fasecontrast is één van de technieken om doorzichtige preparaten zichtbaar te maken. De tabel zet de gangbare methoden naast elkaar.
Bij donkerveld blokkeert een schijf het directe licht, zodat alleen het verstrooide licht van het preparaat in het objectief komt. Structuren lichten op tegen een donkere achtergrond. Bij fasecontrast blijft het directe licht deel van het beeld en wordt de fase ervan verschoven. Fasecontrast toont daardoor meer interne structuur, donkerveld is gevoelig voor kleine deeltjes.
Helderveld gebruikt het licht dat door het preparaat wordt gedempt. Doorzichtige preparaten geven daardoor weinig contrast en moeten meestal worden gekleurd. Fasecontrast gebruikt faseverschillen en maakt kleuring overbodig. Een fasecontrastmicroscoop kan meestal ook in helderveld werken.
Fasecontrast toont de algemene morfologie van levende cellen zonder label. Fluorescentie toont alleen gelabelde structuren, maar wel heel specifiek. In de praktijk worden ze vaak gecombineerd: fasecontrast voor de contouren, fluorescentie voor de specifieke structuur. Zie fluorescentiemicroscopie.
Fasecontrast is vooral nuttig als een preparaat levend en doorzichtig moet blijven.
Gistcellen zijn ronde tot ovale cellen die door knopvorming delen. Een kleinere dochtercel hangt aan de grotere moedercel. In fasecontrast liggen de cellen als losse, scherp omlijnde figuren in het veld, vaak met een zichtbare vacuole. Gisten zijn groter dan bacteriën, en dat helpt bij het onderscheiden. Een veelgebruikte tweede methode is een kleuring zoals methyleenblauw. Meer over eencellige organismen vindt u in het artikel Kweken van eencelligen.
Crematie-as bestaat grotendeels uit mineraal materiaal van het bot en bevat geen herkenbare cellen of weefsels meer. Onder de microscoop ziet u vooral onregelmatige, harde deeltjes en fragmenten. Voor forensisch of medisch onderzoek is gespecialiseerd onderzoek nodig, geen eenvoudige lichtmicroscoop.
De fasecontrastmicroscoop is ontwikkeld door de Nederlandse natuurkundige Frits Zernike, hoogleraar in Groningen, begin jaren dertig van de twintigste eeuw. Hij kreeg in 1953 de Nobelprijs voor de Natuurkunde voor zijn demonstratie van de fasecontrastmethode en met name voor de uitvinding van de fasecontrastmicroscoop. Zonder deze techniek moesten cellen worden gefixeerd of gekleurd, waarmee de processen in de cel stilvallen.
De samengestelde microscoop wordt vaak toegeschreven aan de Middelburgse brillenmaker Zacharias Janssen, rond 1590, al is de exacte toeschrijving onder historici omstreden. Antonie van Leeuwenhoek uit Delft slaagde er in de zeventiende eeuw in met zelfgeslepen lenzen levende micro-organismen te beschrijven. Het artikel over microscopen geeft de geschiedenis uitgebreider.
Nederland speelt een grote rol in de geschiedenis van de microscoop, via Janssen, Van Leeuwenhoek en later Zernike met het fasecontrast. Of de microscoop strikt een Nederlandse uitvinding is, is onder historici een punt van discussie.
De hoofdgroepen zijn lichtmicroscopen (helderveld, donkerveld, fasecontrast, DIC, fluorescentie, stereomicroscoop) en elektronenmicroscopen (SEM en TEM). Daarnaast bestaan er speciale uitvoeringen zoals confocale microscopie, super-resolutiemicroscopie en omgekeerde microscopen voor celkweek.
Een microscoop maakt structuren zichtbaar die voor het blote oog te klein zijn. Toepassingen lopen uiteen van onderwijs en diagnostiek tot celkweek, microbiologie, materiaalonderzoek en kwaliteitscontrole.
Dat hangt af van het type microscoop, de vergroting en het preparaat. Een lichtmicroscoop toont cellen, bacteriën en weefselstructuren. Een elektronenmicroscoop gaat veel verder en toont tot op atomaire schaal. In het artikel Microscoop: types, onderdelen en gebruik staat per vergroting wat zichtbaar wordt.
Onder een lichtmicroscoop legt u een objectglas met een natpreparaat of een permanent preparaat onder een dekglas. Dikkere voorwerpen zoals insecten, mineralen of elektronica bekijkt u liever onder een stereomicroscoop.
Een druppel vijverwater met bewegend leven, gistcellen die knoppen, wangcellen, de opperhuid van een ui, plantendelen en zandkorrels. Bij vijverwater en gist komt fasecontrast het best tot zijn recht.
Begin met het laagste objectief en stel scherp met de grofinstelling. Centreer het preparaat, schakel pas daarna over naar een hoger objectief en gebruik bij hogere vergrotingen alleen de fijninstelling. Stel zo nodig de belichting bij. Immersieolie hoort uitsluitend bij het 100× objectief.
Werk met een schoon preparaat en schone optiek, laat de lamp na gebruik uit, draai terug naar het laagste objectief, verwijder het preparaat en dek de microscoop af. Reinig de lenzen alleen met lenspapier en geschikte vloeistof. De volledige basisregels staan in het artikel over microscopen.
Pak de microscoop met één hand vast aan de arm (het statief) en ondersteun hem met de andere hand onder de voet. Houd hem rechtop, zodat de oculairen niet uit de tubus vallen, en til hem nooit op aan de tubus, de preparaattafel of de revolver.
Dat hangt af van uw preparaat en vraagstelling: helderveld voor gekleurde preparaten, fasecontrast voor levende cellen, een omgekeerde microscoop voor kweekschalen, een stereomicroscoop voor vaste voorwerpen. Het kijktype (monoculair, binoculair of trinoculair), de camera-aansluiting en de belichting spelen ook een rol. De Welke microscoop kiezen? Keuzewijzer voor laboratoria leidt u door de keuze.
Een lichtmicroscoop haalt een resolutie van ruwweg 200 nanometer. Elektronenmicroscopen met aberratiecorrectie gaan daar ver onder, tot de schaal van atomen. Meer daarover staat bij elektronenmicroscopie (SEM en TEM).
Checklist 3 is een term uit het biologieonderwijs voor een controlelijst met drie fasen: vóór, tijdens en na het gebruik. De exacte formulering verschilt per methode of school. Raadpleeg de lijst van uw eigen lesmateriaal.
Teken met potlood op ongeruit wit papier, teken alleen wat u ziet, gebruik doorlopende lijnen zonder arcering en geef de vergroting aan. Label structuren met horizontale aanwijslijnen en geef de tekening een titel met preparaat en kleuring.
Zoek bij lage vergroting een gebied met duidelijke structuren en kies daar één of enkele cellen die u bij hogere vergroting nauwkeurig tekent. Teken wat u werkelijk ziet, niet wat u verwacht. Twijfelt u, vraag dan uw docent welk onderdeel van het preparaat moet worden getekend.
Voor microscopie vindt u bij Labvakhandel lichtmicroscopen en microscoopcamera’s in de webgroep optisch onderzoek, telkamers en objectglasdispensers in glaswerk voor microbiologie, immersieolie en kleurstoffen bij kleurstoffen en reagentia voor microscopie en steriele petrischalen en kweekflessen in laboratoriumplastics. Neem contact op voor advies over een microscoop met fasecontrastoptie.
Onderdeel van: Klinisch laboratorium · Farmaceutisch lab
Geschreven door Labvakhandel, specialist in laboratoriumbenodigdheden voor bedrijven en instellingen.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
