Super-resolutiemicroscopie is een familie van fluorescentietechnieken die de fundamentele optische limiet van de lichtmicroscoop doorbreekt. Die limiet — de zogenoemde Abbe-diffractiegrens van circa 200 nm voor zichtbaar licht — leek ruim 150 jaar onoverkomelijk. In 2014 kregen Eric Betzig, William E. Moerner en Stefan W. Hell de Nobelprijs voor Scheikunde voor de ontwikkeling van super-resolutie fluorescentiemicroscopie: een erkenning die aangeeft hoe ingrijpend deze technieken het biologisch onderzoek hebben veranderd. In dit artikel leest u hoe STED, STORM, PALM en SIM werken, hoe zij zich tot elkaar verhouden, welke fluoroforen en opstellingen vereist zijn, en voor welke toepassingen iedere methode de aangewezen keuze is.
In de internationale literatuur wordt de overkoepelende term SRM (Super-Resolution Microscopy) gebruikt als afkorting voor de volledige familie. Specifiekere afkortingen zijn SMLM (Single Molecule Localization Microscopy) voor de lokalisatiemethoden STORM en PALM, en RESOLFT (Reversible Saturable Optical Linear Fluorescence Transitions) voor de bredere klasse waartoe STED behoort. In dit artikel worden de individuele technieken bij hun eigen afkorting aangeduid; SRM verwijst naar de gehele groep.
In 1873 formuleerde Ernst Abbe de grenzen waaraan de resolutie van een lichtmicroscoop is gebonden. Twee punten op een afstand kleiner dan ongeveer λ / (2 · NA) — waarbij λ de golflengte van het licht is en NA de numerieke apertuur van het objectief — kunnen niet als afzonderlijk worden onderscheiden. Voor een goed olie-immersie-objectief (NA 1,4) en groen licht (530 nm) bedraagt dit circa 190 nm. Structuren binnen één cel, zoals individuele eiwitcomplexen, nucleaire poriën of synaptische vesikels, liggen echter typisch op 10 tot 100 nm van elkaar. Een conventionele fluorescentiemicroscoop of confocale microscoop toont deze structuren als onoplosbare vlek.
Super-resolutietechnieken omzeilen de Abbe-grens niet door betere optiek, maar door slimmer gebruik van de fotofysica van fluoroforen: ofwel door de effectieve emissiespot fysisch te verkleinen (STED), ofwel door moleculen stochastisch aan en uit te schakelen en hun positie wiskundig te bepalen (STORM, PALM), ofwel door gestructureerd licht te gebruiken om verborgen ruimtelijke informatie zichtbaar te maken (SIM).
STED-microscopie werd ontwikkeld door Stefan W. Hell en Jan Wichmann, die het principe in 1994 publiceerden; Hell presenteerde in 2000 de eerste experimentele beelden. Het basisprincipe: naast de gebruikelijke excitatie-laser wordt een tweede laser ingezet met een zorgvuldig gevormd, donutvormig intensiteitsprofiel — de STED-laser of depletielaser. Deze STED-laser heeft een golflengte die overeenkomt met het emissiegebied van de gebruikte fluorofoor. Overal waar de STED-laser het monster raakt, worden geëxciteerde fluoroforen door gestimuleerde emissie terug naar de grondtoestand gebracht vóórdat zij spontaan kunnen emitteren: zij worden als het ware stil gezet. Alleen in het centrale punt van de donut, waar de STED-intensiteit nul is, blijft spontane emissie mogelijk. Dit effectieve emissiepunt is aanzienlijk kleiner dan de diffractie-limiet — hoe hoger de STED-laservermogen, hoe kleiner het punt, tot circa 20–50 nm.
De donutvorm van de STED-laser is geen eigenschap van de laser zelf, maar wordt gecreëerd door een vortex-faseplaat (ook wel fasevertrager of phase mask) in het stralenpad. Deze optische component brengt een ruimtelijk faseprofiel aan op de laserstraal: het middelpunt van de straal ondergaat een faseverschuiving van 0 (nulgangsverschil), terwijl de buitenring een geleidelijk oplopende fase tot 2π krijgt. Door destructieve interferentie in het brandpunt ontstaat zo een intensiteitsminimum van exact nul in het centrum — de voorwaarde voor het intact laten van de centrale fluoroforen.
Na emissie door de niet-gedepleteerde centrale moleculen moeten de fotonen van het STED-kanaal worden uitgefiltered voordat zij de detector bereiken. Hiervoor worden bandpassfilters gebruikt die zijn afgestemd op het emissiegebied van de fluorofoor maar de golflengte van de STED-laser (die buiten het emissievenster valt, doordat de STED-laser roodverschoven is ten opzichte van het excitatiemaximum) blokkeren. Zonder adequate filtering zou het sterk intensieve STED-licht het detectorsignaal volledig overheersen. De combinatie van faseplaat en filters maakt STED realiseerbaar als scanmicroscoop die punt voor punt een superresolutiekaart opbouwt.
STED-microscopie kent een aantal duidelijke beperkingen naast de hoge resolutie die de techniek biedt. De instrumentkosten zijn de hoogste binnen de super-resolutiefamilie: een STED-systeem vergt doorgaans een investering vanaf circa vijfhonderdduizend euro. Daarnaast is de keuze van geschikte fluoroforen beperkter dan bij conventionele fluorescentiemicroscopie, omdat de emissieband en de verzadigingsintensiteit van het label moeten overeenkomen met de beschikbare STED-laserlijn. De hoge laserintensiteit die nodig is om het emissiepunt te verkleinen, verhoogt bovendien het risico op fotobleken en fotodamage aan het preparaat, wat de haalbare resolutie in de praktijk beperkt tot twintig à vijftig nanometer in plaats van de theoretische moleculaire schaal.
Een bijkomende beperking is de acquisitietijd bij grote beeldvelden. Omdat STED punt voor punt scant — net als een confocale microscoop — neemt de benodigde meettijd toe met het te beelden oppervlak. Voor een enkel synaptisch contactpunt of een kleine celregio is STED snel; voor een volledig overzicht van een neuronale dendriet of een groot weefseloppervlak kan de scanduur oplopen tot minuten per optisch vlak. In vergelijking daarmee bieden widefield-gebaseerde STORM en PALM het voordeel dat zij het gehele beeldveld parallel belichten, waardoor de acquisitietijd per frame onafhankelijk is van het beeldoppervlak.
De theoretische onderkant van de STED-resolutie wordt bepaald door de formule d = λ / (2n · sinα · √(1 + I/Is)), waarbij I de STED-intensiteit is en Is de verzadigingsintensiteit van de fluorofoor. Bij voldoende hoge I/Is nadert de resolutie in principe de moleculaire schaal. In de praktijk beperken fotobleken en fotodamage het haalbare, en worden resoluties van 20–50 nm routinematig gerapporteerd; specialistische opstelling bereiken soms 5–10 nm.
Niet alle fluoroforen zijn geschikt voor STED. Essentieel is dat de emissieband en de verzadigingsintensiteit Is compatibel zijn met de beschikbare STED-laserlijn. Gangbare keuzes zijn ATTO647N, Alexa Fluor 647, Oregon Green 488 en het fluorescente eiwit mCitrine (voor geel STED). Nieuwere generaties fotobestendige fluoroforen zoals SiR en carbopyronine-kleurstoffen verbeteren de stabiliteit in STED aanzienlijk.
STED is commercieel beschikbaar via Leica Microsystems (STELLARIS STED, TCS SP8 STED), Abberior Instruments en PicoQuant. Leica biedt ook een gated STED-variant (gSTED) waarbij een tijdfilter het resterende achtergrondlicht verder onderdrukt. STED-systemen worden ingezet in de neurobiologie (synaptische eiwitcomplexen, vesikeldistributie), celbiologie (kernporiën, chromatineorganisatie) en materiaalkunde (polymeerstructuren).
Een praktisch voordeel van STED ten opzichte van STORM en PALM is dat de techniek direct een scherpe optische afbeelding oplevert. STED is een scanmicroscoop: de twee lasers bewegen synchroon punt voor punt over het preparaat, en op elk punt wordt onmiddellijk een gelokaliseerd fluorescentiesignaal geregistreerd. Het eindresultaat is beschikbaar zodra de scan is voltooid, zonder dat tienduizenden frames moeten worden gecombineerd of molecuulposities berekend.
Bij STORM en PALM is de reconstructiestap onvermijdelijk: de ruwe data bestaan uit een stapel frames met geïsoleerde molecuulsignalen die pas na Gaussian-fitting en accumulatie een superresolutiekaart vormen — een rekenintensief proces dat minuten tot uren kan duren. Dit verschil maakt STED geschikter voor toepassingen waarbij snelle beeldvorming of beperkte computercapaciteit een rol speelt.
Omdat STED is opgebouwd op de architectuur van een confocale microscoop, behoudt het de optische sectiecapaciteit die confocale systemen kenmerkt. De confocale pinhole onderdrukt licht van buiten het brandpunt, waardoor beelden op verschillende diepten in het preparaat kunnen worden gemaakt. In de praktijk zijn STED-beelden op diepten tot 10–15 µm in biologische weefsels haalbaar, afhankelijk van de transparantie van het preparaat en de gebruikte immersievloeistof.
Dit onderscheidt STED van TIRF-gebaseerde STORM en PALM, die beperkt zijn tot de eerste 100–200 nm boven het dekglas (het evanescente veld). Voor studies waarbij structuren dieper in weefsel of dikke celmonsters moeten worden gevisualiseerd, biedt STED daarmee een structureel voordeel.
STED is de aangewezen keuze in vier specifieke situaties.
Oriënteert u zich op het juiste microscooptype voor uw laboratorium? De keuzewijzer voor microscoopkeuze biedt een overzicht van alle relevante opties.
STORM werd in 2006 gepubliceerd door Xiaowei Zhuang en collega's. Het principe berust op het blinking-gedrag van bepaalde fluoroforen: organische kleurstoffen als Cy5, Alexa Fluor 647 en Cy3 kunnen in aanwezigheid van een geschikt reductiechemikalie (een thiolverbinding in een ontgaste buffer) worden overgebracht in een donkere, niet-emitterende toestand. Met een activatielaser worden sporadisch afzonderlijke moleculen terug geactiveerd zodat slechts één of enkele fluoroforen per diffractievlek gelijktijdig actief zijn. Door de positie van elk geïsoleerd molecuul nauwkeurig te fitten met een Gaussian-model — in principe tot op 10–20 nm nauwkeurig — en dit over tienduizenden frames te herhalen, wordt een superresolutiekaart samengesteld.
STORM werd in 2006 uitgevonden door Xiaowei Zhuang en haar onderzoeksgroep aan de Harvard University. Zhuang combineerde twee al langer bekende fenomenen — het blinkinggedrag van fluoroforen en enkelmolecuul-detectie — tot een werkende superresolutiemethode en publiceerde de resultaten in het tijdschrift Nature Methods. De eerste STORM-beelden toonden de celbiologische structuur van een clathrine-gecoat blaasje op dertig nanometer resolutie, aanzienlijk voorbij de diffractiegrens van circa 200 nm.
STORM ontving geen eigen Nobelprijs — de prijs van 2014 ging naar Betzig (PALM), Moerner (enkelmolecuul-detectie) en Hell (STED). Xiaowei Zhuang wordt echter algemeen erkend als de grondlegger van STORM en ontving talrijke andere onderscheidingen voor haar werk. De techniek die zij beschreef vormt nog altijd de basis van moderne dSTORM- en multicolor STORM-implementaties, zoals beschreven in de paragrafen hieronder.
STORM-microscopie biedt een aantal sterke punten ten opzichte van andere super-resolutietechnieken. De lokalisatienauwkeurigheid is hoog: door de positie van geïsoleerde fluoroforen nauwkeurig te fitten, wordt doorgaans een resolutie van tien tot dertig nanometer bereikt, vergelijkbaar met PALM en beter dan SIM of Airyscan. Een belangrijk praktisch voordeel is dat STORM gebruikmaakt van organische kleurstoffen die compatibel zijn met standaard immunokleuringsprotocollen, waardoor bestaand antilichaammateriaal vaak direct bruikbaar is zonder dat genetische modificatie van het doeleiwit nodig is, zoals bij PALM wel het geval is. Daardoor is STORM breed inzetbaar voor uiteenlopende vaste preparaten in de celbiologie en microbiologie.
In de oorspronkelijke twee-kleurige STORM werd een activator-reporter-paar gebruikt (bijv. Cy3–Cy5). De eenvoudigere variant dSTORM (direct STORM) gebruikt slechts één fluorofoor — vaak Alexa Fluor 647 of Cy5 — in een speciaal reductief buffersysteem (GLOX: glucose-oxidase plus catalase met een thiol zoals MEA of BME). De fluorofoor schakelt spontaan tussen aan- en uittoestanden. dSTORM is breed inzetbaar, ook voor biologisch materiaal dat al met gangbare immunokleuring is behandeld.
De beeldkwaliteit bij STORM is sterk afhankelijk van de bufferchemie. Essentieel zijn een zuurstofverwijderingssysteem om fotobleking te vertragen, een thioldonor (bijv. β-mercaptoethylamine, MEA) om fluoroforen in de donkere triplet-toestand te stabiliseren, en een geschikte pH (typisch 7–8). Labvakhandel levert de benodigde chemicaliën, waaronder glucose-oxidase, catalase, cysteamine en natriumsulfiet, in analytische zuiverheidsgraden. Zie het artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën voor een toelichting op de kwaliteitsklassen.
De basisimplementatie van STORM levert een tweedimensionale superresolutiekaart op. Driedimensionale STORM (3D-STORM) voegt een zwakke cilindrische (astigmatische) lens in het detectiepad in. Deze lens vervormt de puntspreidingsfunctie (PSF) van geïsoleerde moleculen op een diepte-afhankelijke manier: moleculen boven het brandpunt geven een elliptische PSF met de lange as in de x-richting; moleculen onder het brandpunt geven een ellips in de y-richting. Door de ellipticiteit en oriëntatie van elke PSF te fitten kan de axiale positie van elk molecuul worden bepaald met een nauwkeurigheid van 50–75 nm — ver boven de axiale resolutie van conventionele fluorescentiemicroscopie.
3D-STORM is daarmee geschikt voor het in kaart brengen van driedimensionale structuren zoals het nucleaire poriëncomplex, de axonale periodieke cytoskelet-ring en membraanreceptorverdelingen in alle drie de dimensies. De techniek stelt geen aanvullende eisen aan de buffer of het labelingsprotocol ten opzichte van standaard dSTORM.
STORM kan worden uitgevoerd met meerdere kleurkanalen, zodat twee of meer eiwitten of structuren simultaan of sequentieel in hetzelfde preparaat worden gelokaliseerd. De meest gebruikte aanpak is sequentiële multicolor STORM: na de eerste acquisitieronde wordt de buffer vervangen en een tweede fluorofoor geactiveerd, waarna opnieuw tienduizenden frames worden opgenomen. Beide lokalisatiekaarten worden vervolgens gecombineerd tot één superresolutiebeeld met gescheiden kleurkanalen.
Een alternatief is simultane twee-kleur STORM met twee spectraal gescheiden fluoroforen (bijv. Alexa Fluor 647 en Alexa Fluor 568) die elk een eigen detectiekanaal hebben. Dit vereist zorgvuldige spectrale ontmenging om overspraak tussen kanalen te minimaliseren. Multicolor STORM is bij uitstek nuttig voor het bestuderen van co-lokalisatie en ruimtelijke relaties tussen eiwitten op nanoschaal — zoals de verhouding tussen pre- en postsynaptische markereiwitten of de co-distributie van membraanreceptoren.
PALM — ontwikkeld door Eric Betzig (en onafhankelijk als FPALM door Samuel Hess) — werkt op hetzelfde lokalisatieprincipe als STORM, maar maakt gebruik van fotoactiveerbare of fotoconverteerbare fluorescente eiwitten in plaats van organische kleurstoffen. Bekende labels zijn PA-GFP (photoactivatable GFP), Dronpa, mEos2/3/4, Kaede en mMaple. Met een UV-activatiepuls worden willekeurig slechts enkele eiwitten omgezet naar de fluorescente toestand; vervolgens worden zij gescand totdat zij onherroepelijk bleken, waarna de volgende batch wordt geactiveerd. Dit proces herhaalt zich voor tienduizenden frames.
PALM staat voor Photoactivated Localization Microscopy: microscopie op basis van fotoactivatie en lokalisatie. De naam beschrijft de twee kernstappen van de techniek. Fotoactivatie verwijst naar het in de fluorescentietoestand brengen van individuele eiwitten met een UV-activatiepuls; lokalisatie verwijst naar het wiskundig bepalen van de exacte positie van elk geactiveerd molecuul, tot op tien à dertig nanometer nauwkeurig. Door tienduizenden opeenvolgende frames te combineren ontstaat een superresolutiekaart die de Abbe-diffractiegrens ruimschoots doorbreekt. De techniek werd ontwikkeld door Eric Betzig — een van de drie Nobelprijswinnaars van 2014 — en is verwant aan FPALM (Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy), de variant die Samuel Hess onafhankelijk publiceerde. Het aanverwante principe voor organische kleurstoffen in plaats van eiwitten wordt STORM genoemd; beide methoden worden samen aangeduid als SMLM (Single Molecule Localization Microscopy), zoals toegelicht in de volgende paragraaf.
STORM en PALM worden in de wetenschappelijke literatuur samen aangeduid als SMLM (Single Molecule Localization Microscopy, ook wel lokalisatiemicroscopie genoemd). De aanduiding verwijst naar het gedeelde werkingsprincipe: beide methoden lokaliseren afzonderlijke, geïsoleerde fluorescente moleculen met subpixel-nauwkeurigheid en bouwen op basis van tienduizenden opeenvolgende frames een superresolutiekaart op. Het wezenlijke verschil zit in het type label: STORM gebruikt organische kleurstoffen met schakelbaar blinkinggedrag, terwijl PALM gebruikmaakt van genetisch gecodeerde, fotoactiveerbare fluorescente eiwitten.
Ten opzichte van STED onderscheidt SMLM zich fundamenteel in aanpak. STED verkleint de effectieve emissiespot fysisch via een donutvormige depletielaser; de beeldopbouw verloopt punt voor punt, vergelijkbaar met confocale scanning. SMLM bereikt superresolutie juist door rekentechnische lokalisatie: niet de optiek, maar de software bepaalt de uiteindelijke resolutie. Dit maakt SMLM in principe geschikter voor extreem hoge resolutie (10–30 nm versus 20–50 nm voor STED), maar ook aanzienlijk langzamer in acquisitietijd. De keuze tussen SMLM en STED hangt daarmee sterk af van de gewenste resolutie, de acquisitietijd en de aard van het label. De vergelijkingstabel verderop in dit artikel geeft een overzicht van alle methoden naast elkaar.
Omdat de labels genetisch gecodeerde eiwitten zijn, kunnen zij direct als fusiepartner met het eiwit van interesse worden geproduceerd: er is geen antilichaaminkleuring nodig. Dit maakt PALM bij uitstek geschikt voor in vivo-studies in levende cellen, mits de fotoconversiestap niet toxisch is. Een nadeel is dat fotoactiveerbare eiwitten doorgaans een lagere helderheid en lagere fotonstabiliteit hebben dan organische kleurstoffen, waardoor de lokalisatienauwkeurigheid per molecuul iets lager uitvalt.
Omdat elk geactiveerd molecuul in PALM afzonderlijk wordt gedetecteerd en gelokaliseerd, biedt de techniek de mogelijkheid tot kwantitatieve analyse van moleculaire organisatie op een manier die met conventionele fluorescentiemicroscopie niet haalbaar is. Twee toepassingen zijn bijzonder relevant.
Deze kwantitatieve toepassingen stellen hoge eisen aan de labeldichtheid, de kalibratie van het systeem en de keuze van reconstructiesoftware. Voor de beeldanalysestap worden onder meer de Fiji-plugin ThunderSTORM en het Python-pakket Picasso ingezet, zoals beschreven in het onderdeel beeldanalyse verderop in dit artikel.
Structured Illumination Microscopy (SIM) werkt op een ander principe dan STED of STORM/PALM: er zijn geen bijzondere fluoroforen of schakelgedrag nodig. Het monster wordt belicht met een gestreept, periodiek lichtpatroon dat wordt geroteerd en verschoven over meerdere oriëntaties en fases. De interactie tussen dit patroon en de fijne structuren in het preparaat genereert moiré-interferentiepatronen die ruimtelijke informatie bevatten die met conventionele belichting buiten het detecteerbare bereik valt. Wiskundige reconstructie van meerdere ruwe beelden — typisch 9 of 15 per z-niveau — levert een resolutieverbetering van een factor 2, tot circa 100 nm lateraal.
Driedimensionale SIM (3D-SIM) past het gestructureerde lichtpatroon ook axiaal toe, waardoor de axiale resolutie verbetert van 600–700 nm (conventioneel confocaal) tot circa 300 nm. 3D-SIM is een standaardkeuze voor het bestuderen van chromatineorganisatie, kernstructuur en cytoskelet-architectuur in drie dimensies. Systemen zijn commercieel beschikbaar als GE OMX Blaze en Zeiss Elyra S.1.
Dankzij de lage lichtdosis en snelle beeldacquisitie is SIM geschikt voor live-cell imaging. Latere varianten zoals Lattice SIM (Zeiss Elyra 7) combineren een TIRF-modus met SIM en bereiken beelden op een tijdresolutie van milliseconden, wat real-time visualisatie van dynamische processen als vesikeltransport en mitose mogelijk maakt.
SIM en STORM/PALM bereiken superresolutie via fundamenteel verschillende mechanismen, en dat vertaalt zich in praktische voor- en nadelen op drie vlakken.
Kortom: kies SIM wanneer snelheid, live-cell compatibiliteit en eenvoudige labeling de prioriteit zijn; kies STORM of PALM wanneer de hoogst haalbare resolutie het doorslaggevende criterium is. De vergelijkingstabel verderop in dit artikel geeft een overzicht van alle methoden naast elkaar.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is geen super-resolutietechniek op zichzelf, maar is de standaardopstelling waarop STORM en PALM worden uitgevoerd. Bij TIRF valt de laserstraal zo op het glas-water grensvlak dat totale interne reflectie optreedt. Hierdoor ontstaat een evanescent veld dat slechts 100–200 nm in het preparaat doordringt. Dit heeft twee voordelen voor lokalisatiemicroscopie: uitsluitend fluoroforen aan of vlak bij de celmembraan worden geëxciteerd, en de achtergrond-fluorescentie vanuit het cytoplasma is minimaal. Dit levert de scherpe, lage-achtergrondsituatie die noodzakelijk is voor betrouwbare enkelmolecuul-lokalisatie. TIRF is beschreven in het artikel over fluorescentiemicroscopie.
Super-resolutiemicroscopie stelt hogere eisen aan monstervoorbereiding dan conventionele lichtmicroscopie. De kwaliteit van fixatie, labeldichtheid en dekglasopbouw zijn direct bepalend voor het eindresultaat.
Voor STORM, PALM en STED van vaste preparaten is paraformaldehyde (PFA, 3–4%) de meest gebruikte fixatiestof. PFA-fixatie behoudt de cellulaire ultrastructuur terwijl antilichamen kunnen doordringen. Glutaaraldehyde (GA, 0,01–0,1%) verbetert de structurele conservering maar veroorzaakt autofluorescentie die na reductie met natriumborhydride moet worden gemitigeerd. Methanolfixatie is ongeschikt voor membraanstructuren. Het gebruik van de juiste chemische zuiverheidsgraad voor fixatiemiddelen is essentieel: onzuiverheden verhogen de achtergrond-fluorescentie en verstoren blinkingkinetiek.
De lokalisatienauwkeurigheid bij STORM is alleen zinvol wanneer de labeldichtheid hoog genoeg is om elke structuur te representeren: een te lage dichtheid leidt tot onvolledige reconstructie (het Nyquist-criterium voor lokalisatiemicroscopie). Secundaire antilichamen geconjugeerd aan enkelvoudige fluoroforen (monoconjugaten) geven de meest nauwkeurige lokalisatie; antilichamen met meerdere labels vertroebelen de positiebepaling.
Voor TIRF-gebaseerde STORM/PALM is een dekglas van de juiste dikte onmisbaar: #1.5 (170 μm) met hoge uniformiteit (tolerantie ± 5 μm). De brekingsindex van het dekglas moet overeenkomen met de specificaties van het TIRF-objectief. Suboptimale dekglasdikte veroorzaakt sferische aberratie en verslechtert de lokalisatienauwkeurigheid aanzienlijk. Voor celkweekmoeders in glasbodemplaten: zie het artikel over celkweektechnieken.
De ruwe data van een STORM/PALM-meting bestaan uit tienduizenden tot honderdduizenden frames die elk de positie van enkele moleculen bevatten. De reconstructiestap omvat drie fasen: (1) detectie van mogelijke molecuulsignalen per frame met drempelwaarden op intensiteit en sigmawaarden van de Gaussian fit, (2) fitting van elk gedetecteerd signaal met een tweedimensionale Gaussian-functie om de subpixel-positie en de lokalisatieonzekerheid te bepalen, en (3) accumulatie van alle gelokaliseerde posities tot een super-resolutiekaart.
Veel gebruikte softwareoplossingen zijn ThunderSTORM (open source, Fiji-plugin), SMLM Fiji-plugin, Picasso (Python-gebaseerd voor DNA-PAINT) en commerciële pakketten van Zeiss (ZEN) en Nikon (NIS-Elements). De kwaliteit van de reconstructie wordt beoordeeld met de Fourier Ring Correlation (FRC)-methode, die de effectieve resolutie van de uiteindelijke kaart kwantificeert zonder aannames over de structuur.
DNA-PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) is een variant van lokalisatiemicroscopie die het blinkinggedrag van fluoroforen niet gebruikt. In plaats daarvan worden korte DNA-oligomeren — de imager-strengen — voorzien van een fluorescente kleurstof. Deze imager-strengen hybridiseren transiënt met complementaire docking-strengen die zijn bevestigd aan de doelstructuur. De korte hybridisatietijd (milliseconden tot seconden) genereert de benodigde aan/uitcycli. Voordelen: geen fotobleking van de fluorofoor (er komen steeds nieuwe imager-strengen), multiplexing via sequentiële kleuring met afzonderlijke sequenties, en extreme lokalisatienauwkeurigheid (< 5 nm bij Exchange-PAINT). DNA-PAINT wordt veel gebruikt voor RNA-detectie (FISH-varianten) en voor nanoschaal-eiwitkaartering.
Expansiemicroscopie (ExM) is een hybride benadering waarbij het monster — na labeling en fixatie — chemisch wordt ingebed in een superabsorberend hydrogelnetwerk dat vervolgens door zwelling uniform wordt uitgerekt tot vier- tot tienmaal de oorspronkelijke grootte. Hierdoor worden structuren die op nanometerschaal bij elkaar lagen, fysisch uit elkaar getrokken zodat zij met een conventionele confocale microscoop opgelost kunnen worden. Expansiemicroscopie vereist geen speciale apparatuur en is geschikt voor high-throughput-toepassingen in gestandaardiseerde celkweekplaten. Een nadeel is dat kwantitatieve intensiteitsmetingen minder betrouwbaar zijn na expansie.
Super-resolutiemicroscopie en elektronenmicroscopie (SEM en TEM) zijn complementaire methoden. Elektronenmicroscopie biedt een nog hogere resolutie (0,1–20 nm) maar vereist destructieve monstervoorbereiding, werkt in vacuüm en geeft geen informatie over moleculaire identiteit. Super-resolutiemicroscopie biedt moleculaire specificiteit via fluorescente labels en kan op levend materiaal worden toegepast, maar is beperkt tot structuren die fluorescent zijn gelabeld. Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) combineert de sterke punten van beide: het monster wordt eerst geïmaged met STORM/PALM of STED voor moleculaire context, waarna het wordt voorbereid voor elektronenmicroscopie voor ultrastructureel detail op exact dezelfde locatie.
Binnen de lichtmicroscopie biedt STED in specialistische opstellingen de hoogste resolutie, met gerapporteerde waarden tot vijf à tien nanometer; STORM en PALM bereiken doorgaans tien tot dertig nanometer. Over de volle breedte van de microscopie heeft elektronenmicroscopie echter de hoogste resolutie: TEM en SEM bereiken een oplossend vermogen van 0,1 tot 20 nanometer, ruimschoots voorbij wat met fluorescentiegebaseerde technieken haalbaar is. Het verschil zit in het type informatie: elektronenmicroscopie levert ultrastructureel detail zonder moleculaire specificiteit en vereist destructieve monstervoorbereiding in vacuüm, terwijl super-resolutiemicroscopie moleculaire identiteit via fluorescente labels toevoegt en ook op levend materiaal kan worden toegepast. Voor de combinatie van beide voordelen wordt Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) ingezet.
STED-microscopie is de dominante methode voor het bestuderen van synaptische eiwitcomplexen. Eiwitten als Bassoon, RIM1, Homer en PSD-95 vormen nanoclusters van 80–150 nm binnen de synaptische scheef — structuren die onder een conventionele confocale microscoop als één bol verschijnen maar met STED als afzonderlijke domeinen zichtbaar zijn. STORM heeft de moleculaire architectuur van het actieve zone-scaffold en de periodieke axonale cytoskelet-ring (spectrine, actine met 190 nm periodiciteit) in kaart gebracht.
STORM en PALM worden gebruikt voor het bestuderen van chromatineorganisatie op nucleosoom-niveau, de distributie van transcriptiefactoren in de kern en de architectuur van nucleaire poriëncomplexen. SIM is bij uitstek geschikt voor het in kaart brengen van chromosomale territoriums en de ruimtelijke ordening van replicatiedomeinen in drie dimensies.
Focale adhesieplakken (focal adhesions) zijn multiproteïnecomplexen die de extracellulaire matrix verbinden met het intracellulaire actinecytoskelet via integrinen, talinen, vinculinen en tientallen andere eiwitten. De architectuur van deze complexen — met afmetingen van 100–300 nm in de z-richting — valt buiten het bereik van conventionele fluorescentiemicroscopie maar is goed toegankelijk voor PALM en STORM.
PALM is bij uitstek geschikt voor het bestuderen van focale adhesieplakken in levende cellen, omdat de genetisch gecodeerde labels directe fusie met het eiwit van interesse mogelijk maken. Zo is de nanoscopische verdeling van paxilline, vinculine en taline binnen individuele adhesieplakken in kaart gebracht, evenals de dynamiek van adhesieplakvorming en -dissociatie in reële tijd. Deze inzichten zijn relevant voor het begrip van celmigratieprocessen en de mechanobiologie van adhesie — een themagebied met toepassingen in weefseltechnologie en oncologisch onderzoek.
PALM en dSTORM tonen de clustergrootte en laterale mobiliteit van membraanreceptoren (EGFR, T-celreceptor, integrinen) op nanoscopische schaal — informatie die niet toegankelijk is via conventionele fluorescentiemicroscopie. TIRF-STORM maakt het mogelijk om enkelvoudige membraaneiwitten te volgen in levende cellen.
De dimensies van bacteriën (typisch 0,5–5 μm) en virussen (20–300 nm) maken super-resolutiemicroscopie bijzonder relevant voor de microbiologie. STORM toont de verdeling van celwandcomponenten, sporvormingseiwitten en flagellamotoren in bacteriën; STED visualiseert de interne organisatie van mycobacteriën. Virusassemblage, capsidestructuur en interactie met de gastheermembraan zijn bestudeerd met STORM/PALM en combinaties met cryo-EM.
Super-resolutiemicroscopie wint terrein in de farmaceutische industrie en klinische diagnostiek, omdat de techniek mechanismen zichtbaar maakt die bepalend zijn voor de werkzaamheid en veiligheid van geneesmiddelen. Drie toepassingsgebieden zijn met name relevant.
Voor deze toepassingen gelden dezelfde monstervoorbereidingseisen als elders in dit artikel beschreven: hoge fixatiekwaliteit, geoptimaliseerde labeldichtheid en geschikte dekglasdikte.
Voor single-cell studies waarbij een specifieke celpopulatie moet worden geïsoleerd vóór super-resolutiebeeldvorming, is celsortering via FACS de aangewezen methode. Gesorteerde cellen worden vervolgens aangebracht op dekglazen voor fixatie en super-resolutie-inkleuring.
De Nobelprijs voor Scheikunde 2014 werd toegekend aan Eric Betzig (Howard Hughes Medical Institute), William E. Moerner (Stanford University) en Stefan W. Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) voor de ontwikkeling van super-resolutie fluorescentiemicroscopie. Hell ontwikkelde het STED-principe; Moerner verrichtte pionierswerk op het gebied van enkelmolecuul-detectie en fotoactiveerbare eiwitten; Betzig rapporteerde PALM als eerste praktische lokalisatiemicroscoop. De toekenning markeerde de overgang van super-resolutiemicroscopie van een academische curiositeit naar een breed beschikbaar, commercieel instrument. De Nobelstichting gebruikte de formulering dat de onderzoekers de optische microscoop hadden meegenomen in het nanodomein. Aanvullende informatie over de achtergrond van de Nobelprijs is te vinden via de website van het Nobelcomité (nobelprize.org).
Nederland speelt een actieve rol in de ontwikkeling en verspreiding van super-resolutiemicroscopie. De TU Delft heeft de afgelopen jaren meerdere onderzoeksgroepen die werken aan verbeterde STORM- en STED-implementaties, open-source hardware en toegankelijke software voor lokalisatiemicroscopie. Een deel van dit werk valt onder de noemer Open Science: bouwtekeningen, laserconfiguraties en softwarepakketten worden vrij beschikbaar gesteld zodat laboratoria zonder toegang tot commerciële systemen toch kunnen werken met superresolutieopstellingen.
Daarnaast beschikken grotere Nederlandse onderzoeksinstellingen — waaronder de Universiteit Utrecht, het Hubrecht Instituut en het Netherlands Cancer Institute (NKI) — over STED- en STORM-systemen die beschikbaar zijn via gedeelde kernfaciliteiten (core facilities). Toegang via een core facility maakt het mogelijk om super-resolutiemetingen uit te voeren zonder de aanschafkosten van een eigen systeem, die voor STED oplopen tot vijfhonderdduizend euro of meer. Voor scholen en hoger-onderwijsinstellingen die kennismaking met fluorescentiemicroscopie willen faciliteren zonder eigen super-resolutieapparatuur bieden standaard fluorescentiemicroscopen een toegankelijk alternatief voor de basisprincipes.
Bij de aanschaf of het gebruik van een super-resolutiesysteem spelen de volgende overwegingen een rol:
Super-resolutiemicroscopie bouwt voort op de principes van fluorescentiemicroscopie en confocale microscopie. De monstervoorbereiding voor gefixeerde cellen overlapt sterk met die voor immunohistochemie. Voor toepassingen waarbij RNA-sequenties in intacte cellen in kaart worden gebracht is FISH (fluorescentie-in-situ-hybridisatie) de aanverwante techniek. Celsortering via FACS wordt ingezet als voorbereiding op single-cell super-resolutieonderzoek. De complementaire hoge-resolutietechniek voor ultrastructuur zonder fluorescentie is elektronenmicroscopie (SEM en TEM). Voor eiwitanalyse op nanoscopische schaal — inclusief massabepaling van eiwitcomplexen — zie atomaire krachtsmicroscopie (AFM). Oriënteert u zich op het juiste microscooptype voor uw laboratorium? Gebruik de keuzewijzer voor microscoopkeuze als startpunt voor de vergelijking van biologische lichtmicroscopen, fluorescentie-systemen en geavanceerde optische technieken.
Voor dekglazen, kweekplaten met glazen bodem, pipetpunten en chemicaliën voor STORM-buffers kunt u terecht in ons assortiment optisch onderzoek & microscopie en biotechnologie & moleculaire biologie. Neem contact op voor advies over de juiste verbruiksartikelen voor uw super-resolutie-workflow.
Onderdeel van: Klinisch laboratorium
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
