Super-resolutiemicroscopie is een familie van fluorescentietechnieken die de fundamentele optische limiet van de lichtmicroscoop doorbreekt. Die limiet — de zogenoemde Abbe-diffractiegrens van circa 200 nm voor zichtbaar licht — leek ruim 150 jaar onoverkomelijk. In 2014 kregen Eric Betzig, William E. Moerner en Stefan W. Hell de Nobelprijs voor Scheikunde voor de ontwikkeling van super-resolutie fluorescentiemicroscopie: een erkenning die aangeeft hoe ingrijpend deze technieken het biologisch onderzoek hebben veranderd. In dit artikel leest u hoe STED, STORM, PALM en SIM werken, hoe zij zich tot elkaar verhouden, welke fluoroforen en opstellingen vereist zijn, en voor welke toepassingen iedere methode de aangewezen keuze is.
In 1873 formuleerde Ernst Abbe de grenzen waaraan de resolutie van een lichtmicroscoop is gebonden. Twee punten op een afstand kleiner dan ongeveer λ / (2 · NA) — waarbij λ de golflengte van het licht is en NA de numerieke apertuur van het objectief — kunnen niet als afzonderlijk worden onderscheiden. Voor een goed olie-immersie-objectief (NA 1,4) en groen licht (530 nm) bedraagt dit circa 190 nm. Structuren binnen één cel, zoals individuele eiwitcomplexen, nucleaire poriën of synaptische vesikels, liggen echter typisch op 10 tot 100 nm van elkaar. Een conventionele fluorescentiemicroscoop of confocale microscoop toont deze structuren als onoplosbare vlek.
Super-resolutietechnieken omzeilen de Abbe-grens niet door betere optiek, maar door slimmer gebruik van de fotofysica van fluoroforen: ofwel door de effectieve emissiespot fysisch te verkleinen (STED), ofwel door moleculen stochastisch aan en uit te schakelen en hun positie wiskundig te bepalen (STORM, PALM), ofwel door gestructureerd licht te gebruiken om verborgen ruimtelijke informatie zichtbaar te maken (SIM).
STED-microscopie werd ontwikkeld door Stefan W. Hell, die het principe in 1994 publiceerde en in 2000 de eerste experimentele beelden presenteerde. Het basisprincipe: naast de gebruikelijke excitatie-laser wordt een tweede laser ingezet met een zorgvuldig gevormd, donutvormig intensiteitsprofiel — de STED-laser of depletielaser. Deze STED-laser heeft een golflengte die overeenkomt met het emissiegebied van de gebruikte fluorofoor. Overal waar de STED-laser het monster raakt, worden geëxciteerde fluoroforen door gestimuleerde emissie terug naar de grondtoestand gebracht vóórdat zij spontaan kunnen emitteren: zij worden als het ware stil gezet. Alleen in het centrale punt van de donut, waar de STED-intensiteit nul is, blijft spontane emissie mogelijk. Dit effectieve emissiepunt is aanzienlijk kleiner dan de diffractie-limiet — hoe hoger de STED-laservermogen, hoe kleiner het punt, tot circa 20–50 nm.
De theoretische onderkant van de STED-resolutie wordt bepaald door de formule d = λ / (2n · sinα · √(1 + I/Is)), waarbij I de STED-intensiteit is en Is de verzadigingsintensiteit van de fluorofoor. Bij voldoende hoge I/Is nadert de resolutie in principe de moleculaire schaal. In de praktijk beperken fotobleken en fotodamage het haalbare, en worden resoluties van 20–50 nm routinematig gerapporteerd; specialistische opstelling bereiken soms 5–10 nm.
Niet alle fluoroforen zijn geschikt voor STED. Essentieel is dat de emissieband en de verzadigingsintensiteit Is compatibel zijn met de beschikbare STED-laserlijn. Gangbare keuzes zijn ATTO647N, Alexa Fluor 647, Oregon Green 488 en het fluorescente eiwit mCitrine (voor geel STED). Nieuwere generaties fotobestendige fluoroforen zoals SiR en carbopyronine-kleurstoffen verbeteren de stabiliteit in STED aanzienlijk.
STED is commercieel beschikbaar via Leica Microsystems (STELLARIS STED, TCS SP8 STED), Abberior Instruments en PicoQuant. Leica biedt ook een gated STED-variant (gSTED) waarbij een tijdfilter het resterende achtergrondlicht verder onderdrukt. STED-systemen worden ingezet in de neurobiologie (synaptische eiwitcomplexen, vesikeldistributie), celbiologie (kernporiën, chromatineorganisatie) en materiaalkunde (polymeerstructuren).
STORM werd in 2006 gepubliceerd door Xiaowei Zhuang en collega's. Het principe berust op het blinking-gedrag van bepaalde fluoroforen: organische kleurstoffen als Cy5, Alexa Fluor 647 en Cy3 kunnen in aanwezigheid van een geschikt reductiechemikalie (een thiolverbinding in een ontgaste buffer) worden overgebracht in een donkere, niet-emitterende toestand. Met een activatielaser worden sporadisch afzonderlijke moleculen terug geactiveerd zodat slechts één of enkele fluoroforen per diffractievlek gelijktijdig actief zijn. Door de positie van elk geïsoleerd molecuul nauwkeurig te fitten met een Gaussian-model — in principe tot op 10–20 nm nauwkeurig — en dit over tienduizenden frames te herhalen, wordt een superresolutiekaart samengesteld.
In de oorspronkelijke twee-kleurige STORM werd een activator-reporter-paar gebruikt (bijv. Cy3–Cy5). De eenvoudigere variant dSTORM (direct STORM) gebruikt slechts één fluorofoor — vaak Alexa Fluor 647 of Cy5 — in een speciaal reductief buffersysteem (GLOX: glucose-oxidase plus catalase met een thiol zoals MEA of BME). De fluorofoor schakelt spontaan tussen aan- en uittoestanden. dSTORM is breed inzetbaar, ook voor biologisch materiaal dat al met gangbare immunokleuring is behandeld.
De beeldkwaliteit bij STORM is sterk afhankelijk van de bufferchemie. Essentieel zijn een zuurstofverwijderingssysteem om fotobleking te vertragen, een thioldonor (bijv. β-mercaptoethylamine, MEA) om fluoroforen in de donkere triplet-toestand te stabiliseren, en een geschikte pH (typisch 7–8). Labvakhandel levert de benodigde chemicaliën, waaronder glucose-oxidase, catalase, cysteamine en natriumsulfiet, in analytische zuiverheidsgraden. Zie het artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën voor een toelichting op de kwaliteitsklassen.
PALM — ontwikkeld door Eric Betzig (en onafhankelijk als FPALM door Samuel Hess) — werkt op hetzelfde lokalisatieprincipe als STORM, maar maakt gebruik van fotoactiveerbare of fotoconverteerbare fluorescente eiwitten in plaats van organische kleurstoffen. Bekende labels zijn PA-GFP (photoactivatable GFP), Dronpa, mEos2/3/4, Kaede en mMaple. Met een UV-activatiepuls worden willekeurig slechts enkele eiwitten omgezet naar de fluorescente toestand; vervolgens worden zij gescand totdat zij onherroepelijk bleken, waarna de volgende batch wordt geactiveerd. Dit proces herhaalt zich voor tienduizenden frames.
Omdat de labels genetisch gecodeerde eiwitten zijn, kunnen zij direct als fusiepartner met het eiwit van interesse worden geproduceerd: er is geen antilichaaminkleuring nodig. Dit maakt PALM bij uitstek geschikt voor in vivo-studies in levende cellen, mits de fotoconversiestap niet toxisch is. Een nadeel is dat fotoactiveerbare eiwitten doorgaans een lagere helderheid en lagere fotonstabiliteit hebben dan organische kleurstoffen, waardoor de lokalisatienauwkeurigheid per molecuul iets lager uitvalt.
Structured Illumination Microscopy (SIM) werkt op een ander principe dan STED of STORM/PALM: er zijn geen bijzondere fluoroforen of schakelgedrag nodig. Het monster wordt belicht met een gestreept, periodiek lichtpatroon dat wordt geroteerd en verschoven over meerdere oriëntaties en fases. De interactie tussen dit patroon en de fijne structuren in het preparaat genereert moiré-interferentiepatronen die ruimtelijke informatie bevatten die met conventionele belichting buiten het detecteerbare bereik valt. Wiskundige reconstructie van meerdere ruwe beelden — typisch 9 of 15 per z-niveau — levert een resolutieverbetering van een factor 2, tot circa 100 nm lateraal.
Driedimensionale SIM (3D-SIM) past het gestructureerde lichtpatroon ook axiaal toe, waardoor de axiale resolutie verbetert van 600–700 nm (conventioneel confocaal) tot circa 300 nm. 3D-SIM is een standaardkeuze voor het bestuderen van chromatineorganisatie, kernstructuur en cytoskelet-architectuur in drie dimensies. Systemen zijn commercieel beschikbaar als GE OMX Blaze en Zeiss Elyra S.1.
Dankzij de lage lichtdosis en snelle beeldacquisitie is SIM geschikt voor live-cell imaging. Latere varianten zoals Lattice SIM (Zeiss Elyra 7) combineren een TIRF-modus met SIM en bereiken beelden op een tijdresolutie van milliseconden, wat real-time visualisatie van dynamische processen als vesikeltransport en mitose mogelijk maakt.
Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopie is geen super-resolutietechniek op zichzelf, maar is de standaardopstelling waarop STORM en PALM worden uitgevoerd. Bij TIRF valt de laserstraal zo op het glas-water grensvlak dat totale interne reflectie optreedt. Hierdoor ontstaat een evanescent veld dat slechts 100–200 nm in het preparaat doordringt. Dit heeft twee voordelen voor lokalisatiemicroscopie: uitsluitend fluoroforen aan of vlak bij de celmembraan worden geëxciteerd, en de achtergrond-fluorescentie vanuit het cytoplasma is minimaal. Dit levert de scherpe, lage-achtergrondsituatie die noodzakelijk is voor betrouwbare enkelmolecuul-lokalisatie. TIRF is beschreven in het artikel over fluorescentiemicroscopie.
Super-resolutiemicroscopie stelt hogere eisen aan monstervoorbereiding dan conventionele lichtmicroscopie. De kwaliteit van fixatie, labeldichtheid en dekglasopbouw zijn direct bepalend voor het eindresultaat.
Voor STORM, PALM en STED van vaste preparaten is paraformaldehyde (PFA, 3–4%) de meest gebruikte fixatiestof. PFA-fixatie behoudt de cellulaire ultrastructuur terwijl antilichamen kunnen doordringen. Glutaaraldehyde (GA, 0,01–0,1%) verbetert de structurele conservering maar veroorzaakt autofluorescentie die na reductie met natriumborhydride moet worden gemitigeerd. Methanolfixatie is ongeschikt voor membraanstructuren. Het gebruik van de juiste chemische zuiverheidsgraad voor fixatiemiddelen is essentieel: onzuiverheden verhogen de achtergrond-fluorescentie en verstoren blinkingkinetiek.
De lokalisatienauwkeurigheid bij STORM is alleen zinvol wanneer de labeldichtheid hoog genoeg is om elke structuur te representeren: een te lage dichtheid leidt tot onvolledige reconstructie (het Nyquist-criterium voor lokalisatiemicroscopie). Secundaire antilichamen geconjugeerd aan enkelvoudige fluoroforen (monoconjugaten) geven de meest nauwkeurige lokalisatie; antilichamen met meerdere labels vertroebelen de positiebepaling.
Voor TIRF-gebaseerde STORM/PALM is een dekglas van de juiste dikte onmisbaar: #1.5 (170 μm) met hoge uniformiteit (tolerantie ± 5 μm). De brekingsindex van het dekglas moet overeenkomen met de specificaties van het TIRF-objectief. Suboptimale dekglasdikte veroorzaakt sferische aberratie en verslechtert de lokalisatienauwkeurigheid aanzienlijk. Voor celkweekmoeders in glasbodemplaten: zie het artikel over celkweektechnieken.
De ruwe data van een STORM/PALM-meting bestaan uit tienduizenden tot honderdduizenden frames die elk de positie van enkele moleculen bevatten. De reconstructiestap omvat drie fasen: (1) detectie van mogelijke molecuulsignalen per frame met drempelwaarden op intensiteit en sigmawaarden van de Gaussian fit, (2) fitting van elk gedetecteerd signaal met een tweedimensionale Gaussian-functie om de subpixel-positie en de lokalisatieonzekerheid te bepalen, en (3) accumulatie van alle gelokaliseerde posities tot een super-resolutiekaart.
Veel gebruikte softwareoplossingen zijn ThunderSTORM (open source, Fiji-plugin), SMLM Fiji-plugin, Picasso (Python-gebaseerd voor DNA-PAINT) en commerciële pakketten van Zeiss (ZEN) en Nikon (NIS-Elements). De kwaliteit van de reconstructie wordt beoordeeld met de Fourier Ring Correlation (FRC)-methode, die de effectieve resolutie van de uiteindelijke kaart kwantificeert zonder aannames over de structuur.
DNA-PAINT (Points Accumulation for Imaging in Nanoscale Topography) is een variant van lokalisatiemicroscopie die het blinkinggedrag van fluoroforen niet gebruikt. In plaats daarvan worden korte DNA-oligomeren — de imager-strengen — voorzien van een fluorescente kleurstof. Deze imager-strengen hybridiseren transiënt met complementaire docking-strengen die zijn bevestigd aan de doelstructuur. De korte hybridisatietijd (milliseconden tot seconden) genereert de benodigde aan/uitcycli. Voordelen: geen fotobleking van de fluorofoor (er komen steeds nieuwe imager-strengen), multiplexing via sequentiële kleuring met afzonderlijke sequenties, en extreme lokalisatienauwkeurigheid (< 5 nm bij Exchange-PAINT). DNA-PAINT wordt veel gebruikt voor RNA-detectie (FISH-varianten) en voor nanoschaal-eiwitkaartering.
Expansiemicroscopie (ExM) is een hybride benadering waarbij het monster — na labeling en fixatie — chemisch wordt ingebed in een superabsorberend hydrogelnetwerk dat vervolgens door zwelling uniform wordt uitgerekt tot vier- tot tienmaal de oorspronkelijke grootte. Hierdoor worden structuren die op nanometerschaal bij elkaar lagen, fysisch uit elkaar getrokken zodat zij met een conventionele confocale microscoop opgelost kunnen worden. Expansiemicroscopie vereist geen speciale apparatuur en is geschikt voor high-throughput-toepassingen in gestandaardiseerde celkweekplaten. Een nadeel is dat kwantitatieve intensiteitsmetingen minder betrouwbaar zijn na expansie.
Super-resolutiemicroscopie en elektronenmicroscopie (SEM en TEM) zijn complementaire methoden. Elektronenmicroscopie biedt een nog hogere resolutie (0,1–20 nm) maar vereist destructieve monstervoorbereiding, werkt in vacuüm en geeft geen informatie over moleculaire identiteit. Super-resolutiemicroscopie biedt moleculaire specificiteit via fluorescente labels en kan op levend materiaal worden toegepast, maar is beperkt tot structuren die fluorescent zijn gelabeld. Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) combineert de sterke punten van beide: het monster wordt eerst geïmaged met STORM/PALM of STED voor moleculaire context, waarna het wordt voorbereid voor elektronenmicroscopie voor ultrastructureel detail op exact dezelfde locatie.
STED-microscopie is de dominante methode voor het bestuderen van synaptische eiwitcomplexen. Eiwitten als Bassoon, RIM1, Homer en PSD-95 vormen nanoclusters van 80–150 nm binnen de synaptische scheef — structuren die onder een conventionele confocale microscoop als één bol verschijnen maar met STED als afzonderlijke domeinen zichtbaar zijn. STORM heeft de moleculaire architectuur van het actieve zone-scaffold en de periodieke axonale cytoskelet-ring (spectrine, actine met 190 nm periodiciteit) in kaart gebracht.
STORM en PALM worden gebruikt voor het bestuderen van chromatineorganisatie op nucleosoom-niveau, de distributie van transcriptiefactoren in de kern en de architectuur van nucleaire poriëncomplexen. SIM is bij uitstek geschikt voor het in kaart brengen van chromosomale territoriums en de ruimtelijke ordening van replicatiedomeinen in drie dimensies.
PALM en dSTORM tonen de clustergrootte en laterale mobiliteit van membraanreceptoren (EGFR, T-celreceptor, integrinen) op nanoscopische schaal — informatie die niet toegankelijk is via conventionele fluorescentiemicroscopie. TIRF-STORM maakt het mogelijk om enkelvoudige membraaneiwitten te volgen in levende cellen.
De dimensies van bacteriën (typisch 0,5–5 μm) en virussen (20–300 nm) maken super-resolutiemicroscopie bijzonder relevant voor de microbiologie. STORM toont de verdeling van celwandcomponenten, sporvormingseiwitten en flagellamotoren in bacteriën; STED visualiseert de interne organisatie van mycobacteriën. Virusassemblage, capsidestructuur en interactie met de gastheermembraan zijn bestudeerd met STORM/PALM en combinaties met cryo-EM.
Voor single-cell studies waarbij een specifieke celpopulatie moet worden geïsoleerd vóór super-resolutiebeeldvorming, is celsortering via FACS de aangewezen methode. Gesorteerde cellen worden vervolgens aangebracht op dekglazen voor fixatie en super-resolutie-inkleuring.
De Nobelprijs voor Scheikunde 2014 werd toegekend aan Eric Betzig (Howard Hughes Medical Institute), William E. Moerner (Stanford University) en Stefan W. Hell (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry) voor de ontwikkeling van super-resolutie fluorescentiemicroscopie. Hell ontwikkelde het STED-principe; Moerner verrichtte pionierswerk op het gebied van enkelmolecuul-detectie en fotoactiveerbare eiwitten; Betzig rapporteerde PALM als eerste praktische lokalisatiemicroscoop. De toekenning markeerde de overgang van super-resolutiemicroscopie van een academische curiositeit naar een breed beschikbaar, commercieel instrument. De Nobelstichting gebruikte de formulering dat de onderzoekers de optische microscoop hadden meegenomen in het nanodomein. Aanvullende informatie over de achtergrond van de Nobelprijs is te vinden via de website van het Nobelcomité (nobelprize.org).
Bij de aanschaf of het gebruik van een super-resolutiesysteem spelen de volgende overwegingen een rol:
Super-resolutiemicroscopie bouwt voort op de principes van fluorescentiemicroscopie en confocale microscopie. De monstervoorbereiding voor gefixeerde cellen overlapt sterk met die voor immunohistochemie. Voor toepassingen waarbij RNA-sequenties in intacte cellen in kaart worden gebracht is FISH (fluorescentie-in-situ-hybridisatie) de aanverwante techniek. Celsortering via FACS wordt ingezet als voorbereiding op single-cell super-resolutieonderzoek. De complementaire hoge-resolutietechniek voor ultrastructuur zonder fluorescentie is elektronenmicroscopie (SEM en TEM). Voor eiwitanalyse op nanoscopische schaal — inclusief massabepaling van eiwitcomplexen — zie atomaire krachtsmicroscopie (AFM).
Voor dekglazen, kweekplaten met glazen bodem, pipetpunten en chemicaliën voor STORM-buffers kunt u terecht in ons assortiment optisch onderzoek & microscopie en biotechnologie & moleculaire biologie. Neem contact op voor advies over de juiste verbruiksartikelen voor uw super-resolutie-workflow.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
