Confocale microscopie is een vorm van lichtmicroscopie waarbij door een slim optisch trucje — het plaatsen van een kleine opening (pinhole) op precies de juiste plek in het stralengang — uitsluitend licht uit een dunne focuslaag van het monster bij de detector terechtkomt. Al het licht dat van boven of onder dat focusvlak komt, wordt door de pinhole tegengehouden. Het resultaat is een aanzienlijk scherper beeld dan met een gewone fluorescentiemicroscoop, zonder de wazige achtergrond van buitenfocus-licht. Door de focus stap voor stap dieper in het monster te leggen, kan een stapel scherpe optische snijvlakken worden opgenomen die samen een driedimensionaal beeld vormen — zonder dat het monster fysiek hoeft te worden gesneden. In dit artikel leest u hoe confocale microscopie werkt, wat het verschil is met breedveld-fluorescentiemicroscopie, hoe laserscanning en draaiende-schijf-systemen zich verhouden, en welke toepassingen confocale microscopie heeft in de levenswetenschappen en de materiaalkunde.
Confocale microscopie is een optische beeldvormingstechniek waarbij de resolutie en het contrast worden vergroot door een ruimtelijk filter — de pinhole — in het brandvlak van de detectie te plaatsen, zodat licht van buiten het focusvlak wordt geblokkeerd. Het belangrijkste resultaat van dit principe is dat het beeld optisch gesneden wordt: alleen de informatie uit een dunne laag van het monster draagt bij aan het uiteindelijke beeld. Doordat deze "snede" optisch tot stand komt en niet met een mes, kunnen levende, intacte monsters in drie dimensies worden onderzocht.
De term "confocaal" verwijst naar de twee optische punten die in elkaars conjugaat (gemeenschappelijk brandpunt) liggen: het punt waar het excitatielicht op het monster wordt gefocusseerd en het punt waar het emissielicht door de pinhole de detector bereikt. Beide brandpunten vallen samen — vandaar de naam con-focaal.
Een confocale microscoop bestaat uit een aantal essentiële optische onderdelen: een puntvormige lichtbron (vrijwel altijd een laser bij moderne instrumenten), een excitatie-pinhole, een dichroïsche spiegel die het excitatielicht naar het monster reflecteert en het emissielicht doorlaat, een objectief, een tweede pinhole vóór de detector (de detectie-pinhole), en een gevoelige detector. Het verloop is als volgt:
Omdat een confocaal beeld op deze manier altijd uit één punt tegelijk wordt opgebouwd, moet het hele beeldveld puntsgewijs worden afgetast. Dat scannen kan op twee manieren: met snelle spiegels die de laserbundel over het monster bewegen (laserscanning), of met een draaiende schijf met duizenden pinholes die parallel werken (draaiende schijf).
Bij een traditionele breedveld-fluorescentiemicroscoop wordt het hele monster gelijktijdig over het volle dieptebereik verlicht en wordt al het uitgezonden fluorescentielicht door de camera opgevangen — ook het licht uit lagen boven en onder het focusvlak. Het resultaat is een beeld waarin de scherpe informatie wordt verstoord door een wazige achtergrond van out-of-focus licht. Dit valt vooral op bij dikkere monsters, zoals weefselsneden van enkele tientallen micrometer of celclusters.
Bij een confocale microscoop wordt alleen het focusvlak verlicht (punt-illuminatie) en alleen het focusvlak gedetecteerd (pinhole-filter). De buitenfocus-bijdrage wordt zo nagenoeg volledig geëlimineerd. Dat geeft een aantal kenmerkende voordelen:
De prijs voor deze winst is dat een confocale opname trager is dan een breedveldopname (vanwege het puntsgewijs scannen) en dat het instrument aanzienlijk duurder is.
Elke afzonderlijke confocale opname is in feite een 2D-beeld van één optisch snijvlak. Het 3D-karakter ontstaat door z-stacking: de focus wordt in stappen van bijvoorbeeld 0,2 tot 1 µm dieper in het monster gelegd, en bij elke stap wordt opnieuw een snijvlak opgenomen. De resulterende stapel snijvlakken vormt een driedimensionaal volume dat met software (Imaris, Fiji/ImageJ, Bitplane) kan worden geroteerd, doorsneden en gerenderd. Confocale microscopie wordt daarom in de praktijk vrijwel altijd ingezet als 3D-techniek.
De laserscanning confocale microscoop — afgekort LSCM of CLSM — is het klassieke, meest verspreide type. Een laserbundel wordt via twee galvanometrisch aangedreven spiegels (een x-spiegel en een y-spiegel) over het monster geleid en tast het beeldveld punt voor punt af. Het emissielicht wordt door de detectie-pinhole gefilterd en met een photomultiplier (PMT) of een gevoeligere variant zoals een GaAsP-detector of een hybride detector (HyD) geregistreerd.
De voordelen van LSCM zijn de uitzonderlijke flexibiliteit (variabele pinhole-diameter, vrij in te stellen scangebied, frame-averaging) en de optimale beeldkwaliteit voor vastgelegde monsters. Ook spectrale detectie — waarbij het emissiespectrum in een groot aantal smalle banden wordt opgevangen — is uitsluitend op LSCM-systemen gangbaar.
De belangrijkste nadelen zijn de relatief lage opnamesnelheid (typisch 1 tot 4 frames per seconde voor full-frame opnames bij standaardresolutie) en de fotobelasting van het monster: elk punt wordt opnieuw belicht. Voor levende cellen die snel bewegen of voor langdurige time-lapse-opnames is dat een beperking.
Frame-averaging is een veelgebruikte techniek bij LSCM waarbij hetzelfde frame meerdere keren wordt opgenomen en de beelden worden gemiddeld. De ruis (die willekeurig is) middelt uit, terwijl het signaal (dat consistent is) intact blijft. Hierdoor neemt de signaal-ruisverhouding toe.
Een draaiende-schijf confocaal microscoop — ook wel spinning disc of Nipkow-disc confocaal genoemd, naar de Duitse uitvinder Paul Nipkow — werkt met een snel ronddraaiende schijf waarin duizenden pinholes in een spiraal-patroon zijn geboord. Door de rotatie scannen al deze pinholes parallel het beeldveld, en het emissielicht wordt op een gevoelige CCD- of sCMOS-camera vastgelegd. De praktische implementatie volgens Yokogawa gebruikt twee schijven die zijn gekoppeld: een microlens-schijf die het laserlicht efficiënt door de pinhole-schijf bundelt.
De voordelen van een spinning-disc systeem liggen in de snelheid en de fotobelasting:
De nadelen zijn een minder strikte buitenfocus-onderdrukking dan LSCM (door cross-talk tussen naburige pinholes), een vaste pinhole-grootte, en doorgaans minder spectrale flexibiliteit.
De keuze tussen laserscanning en draaiende schijf hangt af van de toepassing. Voor maximale beeldkwaliteit, spectrale flexibiliteit en optische sectiedikte is laserscanning de eerste keuze — bijvoorbeeld voor gedetailleerde structurele studies van vaste preparaten en voor co-localisatie-analyses. Voor snelheid, langdurige live-cell imaging en monsters die gevoelig zijn voor fototoxiciteit, presteert de draaiende-schijf-aanpak beter. In moderne onderzoekslaboratoria komen beide systemen vaak naast elkaar voor.
De keuze van detector hangt direct samen met het type confocaal:
Naast de fluorescentiemodus, die in de levenswetenschappen domineert, bestaat ook reflectie confocale microscopie. Hierbij wordt geen fluorescentie gemeten maar het door het monster teruggekaatste excitatielicht. Door de pinhole-detectie ontstaat ook hier een optisch snijvlak. Reflectie confocaal is bij uitstek geschikt voor materialen die zelf niet fluoresceren en die ook niet kunnen worden gekleurd: halfgeleiders, oppervlaktecoatings, polymeren en — in de medische sfeer — onbewerkt huidweefsel. Confocale laser-endomicroscopie (CLE) is een endoscopische toepassing van confocale microscopie voor in-vivo onderzoek van slijmvliezen tijdens een endoscopie.
In de dermatologie wordt in-vivo reflectie confocale microscopie (RCM) gebruikt om huidlaesies op cellulair niveau te onderzoeken zonder een biopt af te nemen. Een speciaal ontworpen confocaal handapparaat wordt op de huid geplaatst en levert beelden van de epidermis en de bovenste dermis met cellulaire resolutie. Toepassingen liggen vooral bij de beoordeling van mogelijk maligne pigmentlaesies, basaalcelcarcinoom en bij follow-up van behandeling. Aangezien Labvakhandel zich richt op laboratoriumtoepassingen valt klinische dermatologie buiten het bestek van dit artikel; voor medische vragen over huidaandoeningen of -screening verwijzen wij naar de huisarts of dermatoloog.
Het confocale principe werd in 1957 uitgevonden door Marvin Minsky, postdoctoraal onderzoeker aan Harvard University, die geïnteresseerd was in de driedimensionale architectuur van neurale netwerken in onbewerkt hersenweefsel. Minsky vroeg in 1957 patent aan op zijn "double-focussing stage-scanning microscope"; het patent werd in 1961 verleend (US 3,013,467). Bij gebrek aan voldoende sterke lichtbronnen (lasers bestonden nog niet) en de digitale rekenkracht om de beelden te verwerken bleef de uitvinding lange tijd onbenut.
In 1966 patenteerden de Tsjechoslowaakse onderzoekers Mojmír Petráň en Milan Hadravský een tandem-scanning microscoop op basis van een Nipkow-schijf — de eerste praktische draaiende-schijf confocaal. De eerste commerciële laserscanning confocale microscopen verschenen in 1982 (oorspronkelijk voor de halfgeleiderindustrie), en met de commerciële doorbraak rond 1987 werd confocale microscopie binnen enkele jaren een onmisbaar instrument in de levenswetenschappen.
Confocale microscopie heeft in een breed scala van vakgebieden een onmisbare plaats gekregen:
Confocale microscopie raakt aan andere laboratoriumtechnieken in de Labvakhandel-kennisbank. Voor de monstervoorbereiding van fluorescent gekleurde celpreparaten is vaak een celkweekstap nodig — zie het artikel over celkweektechnieken. Voor de zuiverheid van fluorescente kleurstoffen, immersie-oliën en spoelvloeistoffen verwijzen wij naar zuiverheidsgraden van chemicaliën. Voor de juiste opslag en hantering van gevaarsklasse-fluoroforen geldt het veiligheidsinformatieblad (VIB) van de betreffende stof.
Voor het bijbehorende glaswerk — objectglaasjes, dekglaasjes, kamertjes voor live-cell imaging — kunt u terecht in onze categorieën glaswerk voor microbiologie en petrischalen. Neem contact op voor advies over benodigdheden die passen bij uw specifieke confocale toepassing.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
