Wat is immunohistochemie?

Immunohistochemie (IHC) is een laboratoriumtechniek waarmee specifieke eiwitten in weefselsecties worden aangetoond met behulp van antilichamen. De naam beschrijft de drie pijlers van de methode: immuno (antilichamen), histo (weefsel) en chemie (kleurreactie). IHC maakt zichtbaar waar in een cel of weefsel een bepaald eiwit tot expressie komt, en geeft daarmee informatie over de aanwezigheid, lokalisatie en relatieve hoeveelheid van dat eiwit.

De techniek wordt breed ingezet in de pathologische diagnostiek, het oncologisch onderzoek en de farmaceutische ontwikkeling. Typische toepassingen zijn het classificeren van tumoren, het vaststellen van de primaire tumorlocatie bij gemetastaseerde kanker, en het bepalen van de expressie van therapeutische doelwitten zoals HER2 of PD-L1.

Werkingsprincipe van IHC

IHC berust op de specifieke binding van een antilichaam aan zijn antigeen. Een antigeen is in dit geval een eiwit (of peptide) dat aanwezig is in het weefsel. De detectie verloopt doorgaans via een indirecte methode met twee antilichamen:

1. Primair antilichaam — bindt rechtstreeks aan het doeleiwit (antigeen) in het weefsel.
2. Secundair antilichaam — bindt aan het primaire antilichaam en draagt een detectielabel, meestal een enzym.

Het enzym (vaak horseradish peroxidase, HRP, of alkalische fosfatase, AP) zet een kleurloos substraat om in een gekleurd, onoplosbaar neerslag dat zichtbaar is onder de lichtmicroscoop. Het meest gebruikte substraat voor HRP is DAB (3,3'-diaminobenzidine), dat een karakteristiek bruin neerslag geeft op de plaats van het antigeen.

De indirecte methode stap voor stap

1. Weefselfixatie — Weefsel wordt gefixeerd (doorgaans in 10% gebufferd formaline) om eiwitten ter plekke te fixeren en autolyse te voorkomen. Na fixatie wordt het weefsel ingebed in paraffine (FFPE) of er worden vriescoupes bereid.
2. Deparaffinisering en rehydratie — FFPE-secties worden ontparaffineerd in xyleen en via een alcoholreeks gehydrateerd tot een waterige omgeving.
3. Antigeenontsluiting (antigen retrieval) — Formalinefixatie veroorzaakt crosslinks in eiwitten waardoor epitopen gemaskeerd raken. Hitte-geïnduceerde antigeenontsluiting (HIER) in citraatbuffer (pH 6) of EDTA-buffer (pH 9) verbreekt deze crosslinks en maakt de epitopen weer toegankelijk.
4. Blokkering — Endogene peroxidase-activiteit en aspecifieke binding worden geblokkeerd (bijv. met H₂O₂ en normaal serum).
5. Incubatie primair antilichaam — Het primaire antilichaam wordt in geoptimaliseerde verdunning opgebracht en geïncubeerd (doorgaans 1 uur bij kamertemperatuur of overnight bij 4 °C).
6. Incubatie secundair antilichaam — Het enzymgekoppelde secundaire antilichaam bindt aan het primaire antilichaam.
7. Kleurreactie — Toevoeging van DAB-substraat geeft een bruin neerslag op de positieve locaties.
8. Tegenkleuring en inbedding — Hematoxyline kleurt de celkernen blauw (tegenkleuring), waarna het preparaat wordt ingebed voor microscopie.

Directe versus indirecte methode

Antilichaamtypen in IHC

Antilichamen voor IHC zijn verkrijgbaar als monoklonale of polyklonale antilichamen:

• Monoklonale antilichamen zijn afkomstig van één B-celkloon en herkennen één specifiek epitoop. Ze geven hoge specificiteit en reproduceerbare resultaten, en zijn daardoor de standaard in diagnostische IHC.
• Polyklonale antilichamen herkennen meerdere epitopen van hetzelfde antigeen. Ze zijn gevoeliger bij lage antigeen­expressie, maar kunnen meer achtergrondsignaal geven.

De meeste primaire antilichamen voor IHC zijn geproduceerd in konijn of muis. Het secundaire antilichaam is dan anti-konijn of anti-muis, en dient altijd te worden afgestemd op de gastheer­soort van het primaire antilichaam.

Veelgebruikte IHC-markers in de pathologie

In de diagnostische pathologie worden tientallen markers routinematig ingezet. Een selectie van klinisch relevante markers:

Interpretatie van IHC-resultaten

Positief versus negatief resultaat

Een positief IHC-resultaat betekent dat het doeleiwit in het onderzochte weefsel aantoonbaar aanwezig is. Het bruin gekleurde neerslag (bij DAB-detectie) geeft de locatie van het antigeen aan: kern, cytoplasma of celmembraan, afhankelijk van het eiwit. Positief betekent niet automatisch pathologisch — ook normaal weefsel kan een marker tot expressie brengen.

Een negatief IHC-resultaat geeft aan dat het eiwit afwezig of niet aantoonbaar is in het onderzochte weefsel. In diagnostische context kan een negatief resultaat even informatief zijn als een positief resultaat. Zo sluit een negatieve HER2-uitslag een HER2-gerichte therapie uit.

Semikwantitatieve scoring

IHC-resultaten worden vaak semikwantitatief gescoord. Voor HER2 bij borstkanker wordt het systeem van de ASCO/CAP-richtlijnen gebruikt, waarbij de intensiteit van de membraankleuring en het percentage positieve cellen samen een score 0, 1+, 2+ of 3+ opleveren. Score 3+ geldt als positief (overexpressie); score 2+ is equivocaal en vereist aanvullend FISH-onderzoek (fluorescentie in-situ hybridisatie).

Voor Ki-67 wordt het percentage positieve tumorkernen bepaald (de proliferatie-index). Een hoog Ki-67-percentage correleert met agressiever tumorgedrag.

IHC versus verwante technieken

Benodigde apparatuur en materialen

Voor een IHC-procedure zijn de volgende hulpmiddelen nodig:

• Microtoom — voor het snijden van FFPE-secties (doorgaans 3–5 µm dik). Zie ook het artikel over microscopen in het laboratorium.
• Waterbad — voor het strekken van weefselsecties op objectglazen. Labvakhandel levert een breed assortiment waterbaden en verwarmingsmantels.
• Incubatiekamer / vochtige kamer — om uitdrogen van secties tijdens antilichaamincubatie te voorkomen.
• Pipetten en pipetpunten — voor het nauwkeurig opbrengen van antilichaamverdunningen en substraatoplossingen.
• Lichtmicroscoop — voor beoordeling van de gekleurde preparaten; bij voorkeur met helderveldfaciliteiten en kleurencamera.
• Centrifuge — bij de bereiding van celsuspensies of bij aanvullende technieken zoals cytospin.

Geautomatiseerde IHC-platforms (zoals Leica Bond, Ventana BenchMark) zijn in ziekenhuislaboratoria gemeengoed en standaardiseren de incubatietijden, wasstappen en substraatapplicatie volledig.

Kwaliteitscontrole in IHC

Betrouwbare IHC-resultaten vereisen strikte kwaliteitsborging. Cruciale controlepunten zijn:

• Positieve controle — weefsel waarvan bekend is dat het de doelmarker tot expressie brengt, wordt meegenomen in elke run.
• Negatieve controle — het primaire antilichaam wordt weggelaten of vervangen door een isotype-controle om aspecifieke binding zichtbaar te maken.
• Fixatietijd — te korte of te lange formalinefixatie beïnvloedt de antigeenontsluiting en daarmee de signaalintensiteit.
• Antilichaamvalidatie — antilichamen dienen gevalideerd te zijn voor de specifieke toepassing (FFPE, vriessectie, celkweek) en de betreffende diersoort.

Toepassingen van IHC

Diagnostische pathologie

IHC is onmisbaar in de moderne pathologische diagnostiek. Het paneel van markers dat wordt ingezet, helpt de patholoog bij het bepalen van tumortype, graad en origine. Bij een tumor van onbekende primaire locatie (CUP) kan een combinatie van cytokeratines, CD-markers en orgaanspecifieke markers (zoals PSA voor prostaat of TTF-1 voor long) de waarschijnlijke oorsprong aanwijzen.

Biomarkeronderzoek en farmaceutische ontwikkeling

In de farmaceutische industrie en het translationeel onderzoek wordt IHC ingezet om de expressie van therapeutische doelwitten in patiëntcohorten te evalueren, en om de farmacodynamische effecten van een geneesmiddel in vivo zichtbaar te maken. Zo wordt de expressie van PD-L1 bepaald via IHC als selectiecriterium voor immuuntherapie (checkpointremmers).

Onderwijs en practica

In het hbo- en universitair onderwijs wordt IHC ingezet in practica celbiologie, histologie en moleculaire pathologie. Studenten leren daarmee de relatie tussen eiwitexpressie en weefselstructuur te begrijpen. Basisreagentia en objectglazen zijn verkrijgbaar via Labvakhandel.

Verwante technieken die in laboratoriumonderwijs en -onderzoek worden ingezet zijn onder meer Western blot, flowcytometrie, gelelectroforese en ELISA. IHC is tevens een vorm van preparaatkleuring; voor een breder overzicht van kleuringstechnieken zie het artikel over preparaatkleuringen. Voor het werken met celkweekmateriaal dat als substraat dient, zie ook het artikel over celkweektechnieken.

Voor advies over antilichamen, detectiereagentia of laboratoriumapparatuur geschikt voor IHC-toepassingen kunt u contact opnemen met Labvakhandel.