Immunohistochemie (IHC) is een laboratoriumtechniek waarmee specifieke eiwitten in weefselsecties worden aangetoond met behulp van antilichamen. De naam beschrijft de drie pijlers van de methode: immuno (antilichamen), histo (weefsel) en chemie (kleurreactie). IHC maakt zichtbaar waar in een cel of weefsel een bepaald eiwit tot expressie komt, en geeft daarmee informatie over de aanwezigheid, lokalisatie en relatieve hoeveelheid van dat eiwit.
De techniek wordt breed ingezet in de pathologische diagnostiek, het oncologisch onderzoek en de farmaceutische ontwikkeling. Typische toepassingen zijn het classificeren van tumoren, het vaststellen van de primaire tumorlocatie bij gemetastaseerde kanker, en het bepalen van de expressie van therapeutische doelwitten zoals HER2 of PD-L1.
Immunohistochemie wordt in de praktijk aangeduid met verschillende termen die grotendeels synoniem zijn. De afkorting IHC is de meest gebruikte aanduiding in zowel de klinische als de wetenschappelijke context. De term immunokleuring (Engels: immunostaining) beschrijft hetzelfde principe en wordt zowel voor weefsel- als celpreparaten gebruikt. Immunoperoxidasekleuring verwijst specifieker naar de meest toegepaste detectievariant waarbij het enzym horseradish peroxidase (HRP) wordt ingezet. De term immunohistologie wordt incidenteel gebruikt als alternatief voor IHC, met nadruk op de histologische component. Is immunohistochemie hetzelfde als immunokleuring? In de meeste situaties wel: beide termen dekken het aantonen van eiwitten met antilichamen in weefsel- of celpreparaten. Het onderscheid zit hoofdzakelijk in het substraat — weefsel bij IHC, losse cellen bij immunocytochemie (ICC) — en niet in de detectiemethode zelf.
Immunohistochemie en immunocytochemie (ICC) maken gebruik van hetzelfde principe — antilichamen die een doeleiwit herkennen — maar verschillen in het gebruikte substraat. Bij IHC worden dunne coupes gesneden van weefsel (FFPE of vriessectie). Bij ICC worden losse cellen onderzocht: celkweekcellen die op objectglazen zijn gegroeid of door centrifugatie zijn neergeslagen (cytospin). ICC wordt ingezet wanneer weefselarchitectuur niet relevant is en volstaan kan worden met individuele celanalyse, bijvoorbeeld bij uitstrijkjes of celkweekmateriaal.
IHC berust op de specifieke binding van een antilichaam aan zijn antigeen. Een antigeen is in dit geval een eiwit (of peptide) dat aanwezig is in het weefsel. De detectie verloopt doorgaans via een indirecte methode met twee antilichamen:
Het enzym (vaak horseradish peroxidase, HRP, of alkalische fosfatase, AP) zet een kleurloos substraat om in een gekleurd, onoplosbaar neerslag dat zichtbaar is onder de lichtmicroscoop. Het meest gebruikte substraat voor HRP is DAB (3,3’-diaminobenzidine), dat een karakteristiek bruin neerslag geeft op de plaats van het antigeen.
DAB (3,3’-diaminobenzidine) is een chromogeen substraat dat door het HRP-enzym wordt geoxideerd tot een bruin, in organische oplosmiddelen onoplosbaar polymeer. Dit neerslag slaat neer op de exacte locatie waar het antilichaam-antigeencomplex aanwezig is en blijft stabiel na inbedding van het preparaat. De bruine kleur contrasteert goed met de blauwe hematoxyline-tegenkleuring van celkernen. DAB is lichtgevoelig en wordt doorgaans vers bereid voor gebruik. Alternatief voor toepassingen waarbij bruine achtergrondkleuring storend is, is het substraat AEC (3-amino-9-ethylcarbazol), dat een rood neerslag geeft maar oplosbaar is in alcohol en daarmee minder geschikt voor bepaalde inbeddingsmedia.
Een volledige IHC-procedure neemt doorgaans één tot twee werkdagen in beslag, afhankelijk van het protocol en de mate van automatisering. De meest tijdrovende stap is de formalinefixatie van het weefsel, die idealiter 6–24 uur duurt. Deparaffinisering, antigeenontsluiting en blokkering beslaan samen circa 1–2 uur. De incubatie met het primaire antilichaam varieert van 1 uur bij kamertemperatuur tot overnight bij 4 °C. De overige stappen (secundair antilichaam, kleurreactie, tegenkleuring) zijn in 30–60 minuten afgerond. Op geautomatiseerde platforms zoals Leica Bond of Ventana BenchMark is de totale processtijd na fixatie en inbedding teruggebracht tot 3–5 uur per run.
FFPE-secties (formaline-gefixeerd, paraffine-ingebed) zijn de standaard in diagnostische IHC. Formalinefixatie conserveert de weefselarchitectuur uitstekend en maakt langdurige opslag mogelijk. Het nadeel is dat fixatie epitopen kan maskeren, waardoor antigeenontsluiting noodzakelijk is. Vriessecties worden bereid door weefsel direct in te vriezen en te snijden op een cryostaat. De weefselarchitectuur is minder goed geconserveerd dan bij FFPE, maar epitopen blijven beter intact — antigeenontsluiting is vaak niet nodig. Vriessecties worden voornamelijk gebruikt bij intra-operatieve sneldiagnostiek (vriescoupes) en bij antigenen die niet bestand zijn tegen formalinefixatie.
Bij lage antigeenexpressie kan het signaal van de standaard indirecte methode onvoldoende zijn voor betrouwbare detectie. Signaalversterkingssystemen vergroten de hoeveelheid detectielabel per antilichaam-antigeencomplex. De meest gebruikte methoden zijn polymeersystemen, waarbij meerdere HRP-moleculen zijn gekoppeld aan één secundair antilichaam via een dextranpolymeer, en tyramide-signaalversterking (TSA), waarbij een tyramide-HRP-substraat covalente neerslag vormt op en rondom het antilichaamcomplex. Polymersystemen bieden een goede balans tussen gevoeligheid en achtergrond en zijn geïntegreerd in de meeste geautomatiseerde IHC-platforms.
Antilichamen voor IHC zijn verkrijgbaar als monoklonale of polyklonale antilichamen:
De meeste primaire antilichamen voor IHC zijn geproduceerd in konijn of muis. Het secundaire antilichaam is dan anti-konijn of anti-muis, en dient altijd te worden afgestemd op de gastheersoort van het primaire antilichaam.
In de diagnostische pathologie worden tientallen markers routinematig ingezet. Een selectie van klinisch relevante markers:
Een positief IHC-resultaat betekent dat het doeleiwit in het onderzochte weefsel aantoonbaar aanwezig is. Het bruin gekleurde neerslag (bij DAB-detectie) geeft de locatie van het antigeen aan: kern, cytoplasma of celmembraan, afhankelijk van het eiwit. Positief betekent niet automatisch pathologisch — ook normaal weefsel kan een marker tot expressie brengen.
Een negatief IHC-resultaat geeft aan dat het eiwit afwezig of niet aantoonbaar is in het onderzochte weefsel. In diagnostische context kan een negatief resultaat even informatief zijn als een positief resultaat. Zo sluit een negatieve HER2-uitslag een HER2-gerichte therapie uit.
IHC-resultaten worden vaak semikwantitatief gescoord. Voor HER2 bij borstkanker wordt het systeem van de ASCO/CAP-richtlijnen gebruikt, waarbij de intensiteit van de membraankleuring en het percentage positieve cellen samen een score 0, 1+, 2+ of 3+ opleveren. Score 3+ geldt als positief (overexpressie); score 2+ is equivocaal en vereist aanvullend FISH-onderzoek (fluorescentie in-situ hybridisatie).
Voor Ki-67 wordt het percentage positieve tumorkernen bepaald (de proliferatie-index). Een hoog Ki-67-percentage correleert met agressiever tumorgedrag.
IHC en immunofluorescentie (IF) delen hetzelfde antilichaamprincipe, maar verschillen in detectiemethode. Bij IHC genereert een enzym (HRP of AP) een gekleurd chemisch neerslag dat zichtbaar is onder de gewone lichtmicroscoop en permanent is na inbedding. Bij immunofluorescentie is het secundaire antilichaam gelabeld met een fluorescerende kleurstof (fluorofoor) die zichtbaar is onder UV- of laserbelichting. IF biedt als voordeel dat meerdere antigenen tegelijk in één preparaat kunnen worden gedetecteerd via fluoroforen met verschillende emissiegolflengten (multiplexing), en leent zich beter voor kwantitatieve analyse en confocale microscopie. IHC heeft als voordeel dat preparaten permanent zijn, geen speciale verlichting vereisen en gemakkelijk te beoordelen zijn in de klinische routinediagnostiek. Zie ook het artikel over fluorescentiemicroscopie voor een uitgebreid overzicht van fluorescente detectiemethoden.
Multiplex-IHC maakt het mogelijk om meerdere antigenen gelijktijdig in één weefselsectie aan te tonen. Bij chromogene multiplexing worden verschillende enzymen (HRP en AP) gecombineerd met substraten die elk een andere kleur geven (bijv. bruin voor DAB en rood voor Fast Red). Bij fluorescentie-multiplexing worden meerdere fluoroforen gebruikt, vergelijkbaar met multi-color immunofluorescentie. Geavanceerde platforms zoals spectrale beeldvorming (multispectrale IHC) maken het mogelijk om vijf tot acht markers tegelijk te visualiseren in één coupe, wat met name waardevol is voor de karakterisering van het tumor-immuunmilieu (tumor microenvironment, TME).
Voor een IHC-procedure zijn de volgende hulpmiddelen nodig:
Geautomatiseerde IHC-platforms (zoals Leica Bond, Ventana BenchMark) zijn in ziekenhuislaboratoria gemeengoed en standaardiseren de incubatietijden, wasstappen en substraatapplicatie volledig.
Betrouwbare IHC-resultaten vereisen strikte kwaliteitsborging. Cruciale controlepunten zijn:
Een negatieve controle toont aan of een positief signaal daadwerkelijk afkomstig is van specifieke antilichaambinding, of dat het achtergrondsignaal betreft. Er zijn twee vormen: bij een reagens-negatieve controle wordt het primaire antilichaam volledig weggelaten; bij een isotype-controle wordt het primaire antilichaam vervangen door een niet-specifiek antilichaam van hetzelfde isotype (bijv. IgG konijn) in gelijke concentratie. De isotype-controle controleert op aspecifieke binding van het primaire antilichaam op basis van het Fc-gedeelte, los van de antigeenspecificiteit. Zonder negatieve controle is het onmogelijk onderscheid te maken tussen specifiek signaal en achtergrondkleuring door endogene peroxidase, avidinebinding of niet-specifieke adsorptie.
Achtergrondsignaal bij IHC heeft meerdere oorzaken en vereist gerichte tegenmaatregelen. Endogene peroxidase-activiteit (in erytrocyten, eosinofielen) wordt geblokkeerd met waterstofperoxide vóór de antilichaamincubatie. Aspecifieke eiwitbinding wordt verminderd door de sectie voor incubatie te blokken met normaal serum of BSA (bovine serum albumin) van dezelfde diersoort als het secundaire antilichaam. Endogene biotine (aanwezig in nieren, lever en hersenen) kan bij avidinebased detectiesystemen een vals-positief signaal geven; avidin-biotineblokkering of overstap naar polymeersystemen lost dit op. Een te hoge antilichaamconcentratie of te lange incubatietijd verhoogt eveneens het achtergrondsignaal; titratie van het primaire antilichaam is daarom essentieel bij methodevalidatie.
Bij IHC kunnen verschillende technische problemen optreden die de uitkomst beïnvloeden:
IHC is onmisbaar in de moderne pathologische diagnostiek. Het paneel van markers dat wordt ingezet, helpt de patholoog bij het bepalen van tumortype, graad en origine. Bij een tumor van onbekende primaire locatie (CUP) kan een combinatie van cytokeratines, CD-markers en orgaanspecifieke markers (zoals PSA voor prostaat of TTF-1 voor long) de waarschijnlijke oorsprong aanwijzen.
Aanvullende immunohistochemie verwijst naar IHC-onderzoek dat wordt uitgevoerd nadat een eerste histologische diagnose is gesteld maar onvoldoende informatie oplevert voor een definitieve classificatie of behandelbeslissing. De patholoog vraagt aanvullend IHC aan wanneer het standaard kleuringspatroon (hematoxyline-eosine) niet onderscheidend genoeg is, of wanneer aanvullende markering nodig is voor een behandelrelevante uitspraak. Typische situaties zijn: het bepalen van de primaire tumorlocatie bij een carcinoom van onbekende oorsprong (CUP), het onderscheiden van een primair longcarcinoom van een metastase, of het vaststellen van HER2-overexpressie ter voorbereiding op doelgerichte therapie. Aanvullende IHC leidt in de klinische praktijk dus tot een verfijning of herclassificatie van de diagnose op basis van eiwitexpressieprofielen.
In de farmaceutische industrie en het translationeel onderzoek wordt IHC ingezet om de expressie van therapeutische doelwitten in patiëntcohorten te evalueren, en om de farmacodynamische effecten van een geneesmiddel in vivo zichtbaar te maken. Zo wordt de expressie van PD-L1 bepaald via IHC als selectiecriterium voor immuuntherapie (checkpointremmers).
In het hbo- en universitair onderwijs wordt IHC ingezet in practica celbiologie, histologie en moleculaire pathologie. Studenten leren daarmee de relatie tussen eiwitexpressie en weefselstructuur te begrijpen. Basisreagentia en objectglazen zijn verkrijgbaar via Labvakhandel.
Verwante technieken die in laboratoriumonderwijs en -onderzoek worden ingezet zijn onder meer Western blot, flowcytometrie, gelelectroforese en ELISA. IHC is tevens een vorm van preparaatkleuring; voor een breder overzicht van kleuringstechnieken zie het artikel over preparaatkleuringen. Voor eiwitlokalisatie op nanometerschaal met fluorescente antilichamen biedt super-resolutiemicroscopie (STORM/PALM/STED) hogere resolutie dan conventionele fluorescentiekleuring.
Voor advies over antilichamen, detectiereagentia of laboratoriumapparatuur geschikt voor IHC-toepassingen kunt u contact opnemen met Labvakhandel.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
