DNA-sequencing via de Sanger-methode

De Sanger-methode is de klassieke techniek voor het bepalen van de basenvolgorde van DNA. Frederick Sanger ontwikkelde de methode in 1977 en legde daarmee de basis voor het huidige vakgebied van de genomica. Hoewel next-generation sequencing (NGS) de plaats heeft ingenomen van Sanger-sequencing voor grootschalige genoomanalyse, blijft de Sanger-methode de gouden standaard voor de verificatie van korte, specifieke DNA-fragmenten: kloneringsverificatie, mutatiebevestiging en kwaliteitscontrole in vrijwel elk moleculair-biologisch laboratorium.

Wat is Sanger-sequencing?

Sanger-sequencing — ook wel de ketenterminatiemethode of dideoxymethode genoemd — is een techniek waarmee de exacte volgorde van nucleotiden (A, C, G en T) in een DNA-fragment wordt bepaald. De methode berust op gecontroleerde onderbreking van de DNA-synthese: tijdens een enzymatische reactie wordt willekeurig een gemodificeerd nucleotide ingebouwd dat verdere verlenging van de DNA-streng blokkeert. Het resultaat is een verzameling DNA-fragmenten van elke mogelijke lengte, die vervolgens gescheiden worden op grootte om de basenvolgorde af te lezen.

Frederick Sanger publiceerde de methode in 1977 in een artikel met de titel "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors", samen met collega's aan het MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge. Voor dit werk ontving Sanger in 1980 zijn tweede Nobelprijs voor de Scheikunde — een unieke prestatie die hem tot op heden een van de weinige wetenschappers maakt die deze prijs tweemaal heeft ontvangen.

Werkingsprincipe: ketenterminatie met dideoxynucleotiden

Het principe van Sanger-sequencing berust op het verschil tussen twee typen nucleotiden:

• Deoxynucleotiden (dNTP's): de normale bouwstenen van DNA. Elk dNTP bevat een 3'-hydroxylgroep (3'-OH) waarmee het volgende nucleotide in de keten kan worden gekoppeld, zodat de DNA-streng kan doorgroeien.
• Dideoxynucleotiden (ddNTP's): synthetische analogen van dNTP's waarbij de 3'-hydroxylgroep ontbreekt. Wanneer een ddNTP wordt ingebouwd, kan er geen volgend nucleotide meer aan koppelen — de keten stopt onherroepelijk op die positie.

In de reactie worden een DNA-template, een sequencingprimer, DNA-polymerase, een overmaat normale dNTP's en een kleine hoeveelheid fluorescent gelabelde ddNTP's (elk van de vier basen met een eigen kleur) samengevoegd. Tijdens de synthese bouwt het polymerase willekeurig op elke positie een ddNTP in plaats van een dNTP in. Omdat dit proces bij duizenden templatemoleculen tegelijk plaatsvindt, ontstaat een mengsel van fragmenten met elke mogelijke lengte, elk afgesloten met een gekleurd ddNTP dat de laatste base van dat fragment aangeeft.

De vier stappen van een Sanger-sequencingreactie

1. Cyclesequencing-PCR: een lineaire amplificatiereactie (één primer in plaats van twee) met DNA-template, primer, DNA-polymerase, dNTP's en fluorescent gelabelde ddNTP's. Doorgaans 25 tot 35 cycli van denaturatie, annealing en extensie.
2. Opzuivering van het reactieproduct: ongebonden ddNTP's, primers en zouten worden verwijderd via ethanolprecipitatie of een zuiveringskolom, zodat alleen de gelabelde DNA-fragmenten overblijven.
3. Capillaire elektroforese: de fragmenten worden geïnjecteerd in een dunne, met polymeer gevulde capillair en gescheiden op lengte onder invloed van een elektrisch veld. Kleinere fragmenten bewegen sneller door de capillair dan grote. Zie voor de achtergrond van deze scheidingstechniek het artikel over capillaire elektroforese.
4. Detectie en chromatogramopbouw: aan het einde van de capillair passeert elk fragment een laser die de fluorescente kleurstof aan het uiteinde van het fragment laat fluoresceren. Een detector registreert de kleur van elk gepasseerd fragment in volgorde van grootte, en software zet dit om in een chromatogram — een grafiek met vier gekleurde pieken die met elkaar de basenvolgorde vormen.

Het chromatogram interpreteren

De uitvoer van een Sanger-sequencingreactie is een chromatogram: een grafiek met op de x-as de positie in de sequentie en op de y-as de fluorescentie-intensiteit, weergegeven als vier gekleurde pieken (doorgaans groen voor A, rood voor T, zwart voor G en blauw voor C). Elke piek correspondeert met één base op die positie in het fragment.

Bij de beoordeling van een chromatogram is een aantal kenmerken relevant:

• Piekhoogte en -vorm: scherpe, goed gescheiden pieken van vergelijkbare hoogte wijzen op een schone, eenduidige sequentie. Brede of overlappende pieken duiden op een slechte scheiding of degradatie van het template.
• Dubbele pieken op één positie: twee pieken van verschillende kleur op dezelfde positie wijzen op heterozygotie (bij diploïde organismen) of op de aanwezigheid van een mengsel van templates, bijvoorbeeld bij onvolledig gezuiverde kloneringsproducten.
• Signaalverval naar het einde toe: de signaalkwaliteit neemt doorgaans af na ongeveer 700 tot 900 basen door afnemende scheiding tussen fragmenten van vergelijkbare lengte; dit is een inherente beperking van de methode en geen reactiefout.
• Ruis aan het begin van de read: de eerste 15 tot 40 basen na de primer zijn vaak minder betrouwbaar door resterende primer- en kleurstofsignalen; voor kritische toepassingen wordt dit gedeelte doorgaans niet meegenomen in de analyse.

De kwaliteit van elke individuele baseaanroep wordt vaak uitgedrukt in een Phred-kwaliteitsscore, vergelijkbaar met de kwaliteitsmaat die ook bij NGS wordt gebruikt: een hogere score komt overeen met een lagere kans op een verkeerde baseaanroep.

Sanger-sequencing versus next-generation sequencing

Sanger-sequencing en NGS zijn complementaire technieken die elk hun eigen toepassingsgebied hebben. Waar Sanger één fragment per reactie analyseert met hoge betrouwbaarheid, paralleliseert NGS het sequencen van miljoenen tot miljarden fragmenten tegelijk. De keuze tussen beide hangt af van de schaal en het doel van de analyse:

In de praktijk worden de twee methoden vaak gecombineerd binnen één workflow: NGS wordt ingezet voor brede screening en ontdekking van varianten over het hele genoom of transcriptoom, terwijl Sanger-sequencing daarna gericht wordt gebruikt om specifieke bevindingen te bevestigen. Deze combinatie wordt ook wel "Sanger-confirmatie" genoemd en is in veel klinische en regulatoire workflows een vereiste stap voordat een variant als definitief wordt gerapporteerd. Achtergrond bij de werking, platforms en toepassingen van massaal parallelle sequencing is te vinden in het artikel over next-generation sequencing (NGS).

Waarom wordt Sanger-sequencing nog steeds gebruikt?

Ondanks de komst van NGS blijft Sanger-sequencing onmisbaar in specifieke situaties:

• Kloneringsverificatie: na het inbrengen van een DNA-fragment in een plasmide wordt de inzet doorgaans met Sanger-sequencing gecontroleerd op de juiste sequentie, oriëntatie en afwezigheid van ongewenste mutaties.
• Bevestiging van puntmutaties: wanneer NGS of een andere screeningsmethode een mogelijke variant identificeert, wordt deze vaak met een onafhankelijke Sanger-reactie bevestigd voordat de bevinding als definitief geldt.
• Kleine projecten en lage doorvoer: voor het sequencen van enkele fragmenten is Sanger sneller en goedkoper op te zetten dan een volledige NGS-library, waarvoor een minimale schaal nodig is om kosteneffectief te zijn.
• Lange, ononderbroken reads van één fragment: een Sanger-read van 600 tot 1000 basen in één doorlopende sequentie is voor veel toepassingen voldoende en eenvoudiger te interpreteren dan korte, gefragmenteerde NGS-reads die eerst moeten worden samengevoegd.
• Regelgeving en accreditatie: bepaalde klinische en forensische workflows schrijven Sanger-confirmatie expliciet voor als onderdeel van de validatieprocedure, ongeacht welke methode de oorspronkelijke variant heeft gedetecteerd.

Toepassingen van Sanger-sequencing in het laboratorium

• Moleculaire klonering: verificatie van plasmide-inzetten, expressievectoren en CRISPR-Cas9-constructen vóór gebruik in vervolgexperimenten.
• Mutatieanalyse: bevestiging van puntmutaties die zijn aangetroffen via PCR-gebaseerde screening of NGS-panels, bijvoorbeeld bij erfelijkheidsonderzoek of oncologische diagnostiek.
• Microbiële identificatie: sequencing van het 16S-rRNA-gen voor de identificatie van bacteriestammen, of van het ITS-gebied voor schimmels.
• STR-analyse en forensisch onderzoek: hoewel forensische DNA-profilering doorgaans via fragmentanalyse verloopt, wordt capillaire Sanger-sequencing ingezet voor de validatie van referentiestalen en bij complexe gevallen.
• Plasmide- en construct-QC bij biotechbedrijven: routinematige kwaliteitscontrole van celbanken, productiestammen en gentherapieconstructen vóór vrijgave.
• Onderwijs en kleinschalig onderzoek: voor laboratoria zonder toegang tot een NGS-platform blijft Sanger-sequencing de meest toegankelijke manier om DNA-sequenties te bepalen.

Beperkingen van Sanger-sequencing

De methode heeft een aantal inherente beperkingen die de toepasbaarheid begrenzen:

• Lage doorvoer: een standaard capillaire sequencer verwerkt doorgaans 1 tot 96 reads per run, wat de methode ongeschikt maakt voor whole-genome of whole-transcriptome analyse.
• Beperkte gevoeligheid voor lage-frequentievarianten: Sanger-sequencing detecteert betrouwbaar varianten die in ongeveer 15 tot 20 procent of meer van de templatemoleculen aanwezig zijn; zeldzamere subklonale varianten, zoals bij minimale restziekte in oncologie, vereisen gevoeligere methoden zoals digitale PCR of diepe NGS.
• Beperkte leeslengte: een enkele Sanger-read levert doorgaans 600 tot 1000 betrouwbare basen op; langere sequenties vereisen meerdere overlappende reacties met verschillende primers ("primer walking").
• Hogere kosten per sequencingbase: vergeleken met NGS is de prijs per base aanzienlijk hoger, wat Sanger-sequencing minder geschikt maakt voor grootschalige toepassingen.
• Geen de-novo-assemblage van complexe genomen: voor het in kaart brengen van een volledig onbekend genoom is Sanger-sequencing in de praktijk vervangen door NGS- en long-read-platforms.

Hoe lang duurt een Sanger-sequencingreactie?

Een volledige Sanger-sequencingworkflow duurt doorgaans één tot twee werkdagen, afhankelijk van of de reactie intern wordt uitgevoerd of wordt uitbesteed aan een sequencingservice. De cyclesequencing-PCR zelf neemt circa twee tot drie uur in beslag, gevolgd door 30 tot 60 minuten voor opzuivering. De capillaire elektroforese en detectie nemen nog eens 30 tot 90 minuten per run in beslag, afhankelijk van het aantal samples en de leeslengte. Bij uitbesteding aan een extern sequencinglaboratorium komt hier doorgaans de verzendtijd en planning bij, waardoor de doorlooptijd vaak één tot drie werkdagen bedraagt.

Wat is de nauwkeurigheid van Sanger-sequencing?

Onder optimale omstandigheden — voldoende templatekwaliteit, een goed ontworpen primer en een schone opzuivering — bereikt Sanger-sequencing een nauwkeurigheid van meer dan 99,9 procent per base binnen het betrouwbare gedeelte van de read (doorgaans tussen positie 20 en 700 à 900). Deze hoge nauwkeurigheid, in combinatie met de directe visuele controleerbaarheid van het chromatogram, is de reden waarom Sanger-sequencing tot op heden de referentiemethode is voor de definitieve bevestiging van DNA-varianten.

Praktische uitvoering: zelf sequencen of uitbesteden?

Veel laboratoria beschikken niet over een eigen capillaire sequencer en besteden Sanger-sequencing uit aan een gespecialiseerde sequencingservice. In dat geval levert het laboratorium gezuiverd PCR-product of plasmide-DNA aan, samen met de gewenste primer, en ontvangt het de ruwe chromatogrammen en afgeleide sequentiebestanden (doorgaans in FASTA- en AB1-formaat) terug. Voor laboratoria met hogere sequencingvolumes is een eigen capillaire sequencer een investering die zich kan terugbetalen, vooral in combinatie met routinematige kloneringsverificatie of microbiële identificatie.

Voor de monstervoorbereiding voorafgaand aan sequencing is hoogwaardig, zuiver DNA essentieel. Zie het artikel over DNA-isolatie en DNA-extractie voor de gangbare isolatiemethoden en kwaliteitscriteria. Voor de opzuivering van het PCR-product na de cyclesequencing-reactie en de beoordeling van het fragmentpatroon kan gelelektroforese worden ingezet als aanvullende controlestap. Achtergrond bij de PCR-stap zelf is te vinden in het artikel over PCR en SNP-genotypering.

Veelgestelde vragen

Wie heeft DNA-sequencing ontdekt?

Frederick Sanger ontwikkelde de ketenterminatiemethode in 1977 aan het MRC Laboratory of Molecular Biology in Cambridge. Onafhankelijk daarvan publiceerden Allan Maxam en Walter Gilbert in datzelfde jaar een alternatieve chemische sequencingmethode (Maxam-Gilbert-sequencing), die destijds eveneens veel werd gebruikt maar inmiddels grotendeels is verdrongen door de eenvoudiger en veiliger Sanger-methode. Sanger wordt om die reden vaak aangeduid als grondlegger van de moderne DNA-sequencing.

Wat maakte Frederick Sanger zo belangrijk?

Frederick Sanger ontving in zijn carrière twee Nobelprijzen voor de Scheikunde: in 1958 voor de bepaling van de aminozuurvolgorde van insuline (de eerste volledige eiwitsequentie ooit bepaald), en in 1980 voor de ontwikkeling van de DNA-sequencingmethode die zijn naam draagt. Zijn werk aan insuline toonde voor het eerst aan dat eiwitten een exacte, bepaalbare volgorde van bouwstenen hebben, en legde daarmee ook conceptueel de basis voor het idee dat DNA op vergelijkbare wijze "uitgelezen" zou kunnen worden.

Wat toonde Sanger-sequencing voor het eerst aan?

Sanger en zijn team sequencede al in 1977 het genoom van bacteriofaag φX174 — met 5.386 basen het eerste volledig gesequencede DNA-genoom ooit. Dit bewees dat de volgorde van nucleotiden in DNA systematisch en betrouwbaar kon worden bepaald, en opende daarmee de weg naar grotere sequencingprojecten, waaronder uiteindelijk het Humaan Genoom Project, dat grotendeels op een geautomatiseerde, capillaire variant van de Sanger-methode steunde.

Is Sanger-sequencing hetzelfde als NGS?

Nee. Beide technieken bepalen de basenvolgorde van DNA, maar via een fundamenteel ander principe en op een andere schaal. Sanger-sequencing analyseert één fragment per reactie met ketenterminatie en capillaire elektroforese; NGS sequenced miljoenen tot miljarden fragmenten parallel via sequencing-by-synthesis of andere massaal parallelle technieken. Zie het artikel over next-generation sequencing (NGS) voor een uitgebreide toelichting op de NGS-werkwijze en -platforms.

Kan DNA-sequencing ziekten opsporen?

Ja. Zowel Sanger-sequencing als NGS worden breed ingezet in de klinische diagnostiek voor de detectie van erfelijke aandoeningen, kankermutaties en pathogenen. Sanger-sequencing wordt daarbij doorgaans gebruikt voor de gerichte bevestiging van een specifieke, al vermoede variant, terwijl NGS wordt ingezet voor brede screening van meerdere genen of het volledige genoom tegelijk. Beide methoden vereisen voorafgaande validatie volgens de geldende regelgeving voordat zij voor klinische besluitvorming worden gebruikt.

Wat zijn de drie hoofdtypen van DNA-sequencing?

In de praktijk worden DNA-sequencingtechnieken doorgaans ingedeeld in drie generaties: de eerste generatie omvat de klassieke Sanger-methode en de inmiddels verlaten Maxam-Gilbert-methode; de tweede generatie bestaat uit next-generation sequencing-platforms zoals Illumina, die kort-lezende reads massaal parallel sequencen; de derde generatie omvat long-read-technologieën zoals Pacific Biosciences en Oxford Nanopore, die individuele DNA-moleculen in real time aflezen zonder voorafgaande amplificatie. Zie het artikel over next-generation sequencing voor de details van de tweede en derde generatie.

Verwante kennisbankartikelen

Meer informatie over aanverwante onderwerpen: next-generation sequencing (NGS), DNA-isolatie en DNA-extractie, RNA-isolatie en RNA-analyse, capillaire elektroforese, gelelektroforese, PCR en SNP-genotypering en qPCR / real-time PCR.

Materialen voor Sanger-sequencing bij Labvakhandel

Voor monstervoorbereiding bij Sanger-sequencing levert Labvakhandel onder meer: centrifugebuizen en reactievaatjes, pipetpunten en laboratoriumcentrifuges voor de opzuivering van PCR-producten en plasmide-DNA. Bekijk het volledige assortiment in de categorie biotechnologie & moleculaire biologie, of neem contact op voor advies over de juiste verbruiksartikelen voor uw sequencingworkflow.

Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.