Capillaire elektroforese (CE) is een analytische scheidingstechniek waarbij geladen deeltjes in een dunne, met buffer gevulde capillair worden gescheiden onder invloed van een sterk elektrisch veld. De techniek combineert de hoge scheidingsefficiëntie van elektroforese met de snelheid en automatisering van een instrumentele analyse. Capillaire elektroforese wordt toegepast voor de scheiding van ionen, eiwitten, DNA-fragmenten, geneesmiddelen en kleine organische moleculen, vaak met een resolutie die die van vloeistofchromatografie overtreft.
Bij capillaire elektroforese wordt een nauwe capillair (binnendiameter 25–100 µm, lengte 20–100 cm) gevuld met een geleidende buffer (achtergrondelektrolyt). De uiteinden van de capillair staan in twee bufferreservoirs, elk voorzien van een elektrode. Wanneer over de capillair een hoge spanning wordt aangelegd (10–30 kV), migreren geladen deeltjes door de capillair op basis van hun lading en grootte. Een detector bij het uiteinde van de capillair registreert de deeltjes naarmate ze passeren, wat resulteert in een elektroferogram: een grafiek van detectorsignaal tegen migratietijd. Elke piek in het elektroferogram correspondeert met een afzonderlijke component; de migratietijd dient als kwalitatieve identificatie en de piekoppervlakte of ‑hoogte als kwantitatieve maat voor de concentratie.
Het capillair is de kern van het CE-systeem: een uiterst dunne, open buis die dienst doet als scheidingskolom, reactiereservoir en meetcel tegelijk. In vrijwel alle CE-toepassingen wordt fused silica (gesmolten kwarts) gebruikt. De keuze voor dit materiaal berust op drie eigenschappen:
De buitenkant van de capillair is bekleed met een dunne laag polyimide, die de capillair zijn flexibiliteit en mechanische sterkte geeft — zonder deze coating is fused silica bros en moeilijk hanteerbaar. Voor toepassingen waarbij eiwitadsorptie aan de wand een probleem is, worden capillairen gebruikt met een permanente of dynamische binnencoating (polyacrylamide, polyethyleenglycol), waardoor de silanolgroepen worden afgeschermd en de EOF wordt onderdrukt. Meer over dit praktische aspect vindt u in de sectie Praktische aandachtspunten verderop in dit artikel.
De scheiding berust op twee gelijktijdige verschijnselen:
De waargenomen migratiesnelheid van een deeltje is de som van zijn eigen elektroforetische mobiliteit en de elektro-osmotische flow. Hierdoor kunnen in één analyse kationen, neutrale moleculen en anionen na elkaar worden gedetecteerd: kationen het eerst (eigen migratie plus EOF in dezelfde richting), dan neutrale deeltjes (alleen meegevoerd door de EOF), en tot slot anionen (eigen migratie tegen de EOF in, maar door de sterke EOF toch meegesleurd).
Een CE-analyse verloopt in vijf opeenvolgende stappen, die bij moderne geautomatiseerde systemen volledig door de software worden aangestuurd:
Bij een goed geoptimaliseerde methode duurt een volledige CE-analyse inclusief spoel- en injectiestappen 5 tot 30 minuten. De totale cyclustijd per monster is daarmee vergelijkbaar met of korter dan bij HPLC, terwijl de capillair geen regeneratietijd vereist zoals een HPLC-kolom na blootstelling aan agressieve monsters.
Capillaire elektroforese is een verzamelnaam voor meerdere scheidingsmodi, die elk een ander scheidingsmechanisme benutten. In de praktijk worden vier modi het meest toegepast: CZE, CGE, MEKC en CIEF. De overige modi (CITP en CEC) zijn geschikt voor specifieke nichemoepassingen.
De meest gebruikte en eenvoudigste modus. De capillair is gevuld met één homogene buffer en de scheiding berust uitsluitend op verschillen in lading-massaverhouding. CZE is breed inzetbaar voor de scheiding van ionen, organische zuren, peptiden en eiwitten.
De capillair is gevuld met een polymeernetwerk (vervangbare gelmatrix) dat als moleculaire zeef werkt. Grote moleculen bewegen langzamer door het netwerk dan kleine. CGE is de techniek achter geautomatiseerde DNA-fragmentanalyse en DNA-sequencing — de scheiding van DNA-fragmenten op lengte vormt de basis van capillaire sequencers zoals gebruikt bij Sanger-sequencing. Bij SDS-CGE worden eiwitten vooraf gedenatureerd met natriumdodecylsulfaat (SDS), waarna ze uitsluitend op moleculaire massa worden gescheiden — het capillaire equivalent van SDS-PAGE, maar dan volledig geautomatiseerd en zonder handmatige gelvoorbereiding.
Bij MEKC wordt aan de buffer een surfactant toegevoegd, doorgaans natriumdodecylsulfaat (SDS), dat boven de kritische micelconcentratie micellen vormt. Analytmoleculen verdelen zich op basis van hydrofobiciteit en lading tussen de waterige buffer en de hydrofobe kern van de micellen. Omdat de micellen zelf een elektroforetische mobiliteit bezitten die verschilt van die van de vrije analyt, ontstaat scheiding die zowel op polariteit als op lading is gebaseerd. MEKC is bij uitstek geschikt voor de gelijktijdige scheiding van neutrale en geladen verbindingen — een combinatie die met gewone CZE niet mogelijk is. Toepassingen omvatten de analyse van farmaceutische werkzame stoffen, conserveermiddelen in levensmiddelen en polycyclische aromatische koolwaterstoffen in milieumonsters.
Bij CIEF wordt de capillair gevuld met een mengsel van amfolyten — dragermoleculen met een reeks iso-elektrische punten — samen met het monstermengsel. Wanneer spanning wordt aangelegd, vormen de amfolyten een stabiele pH-gradiënt over de lengte van de capillair. Elke eiwitcomponent migreert naar de positie in de pH-gradiënt die overeenkomt met zijn eigen iso-elektrisch punt (pI), waarop de nettolading nul wordt en de migratie stopt. Vervolgens worden de gefocuste zones naar de detector gemobiliseerd door druktoepassing of chemische mobilisatie. CIEF levert nauwkeurige pI-bepalingen op tot op 0,01 pH-eenheid en wordt routinematig toegepast voor de karakterisering en kwaliteitscontrole van monoklonale antilichamen, biosimilars en andere biologische geneesmiddelen.
Voor de scheiding van enantiomeren wordt aan de bufferoplossing een chirale selector toegevoegd, doorgaans een cyclodextrine (α-, β- of γ-cyclodextrine, eventueel gederivatiseerd). De enantiomeren vormen voorbijgaande inclusiecomplexen met de selector en migreren daardoor met verschillende snelheden. Chirale CE is een aantrekkelijk alternatief voor chirale HPLC: lagere kosten, snel ontwikkelbaar en met klein monstervolume. Toegepast bij farmaceutische verbindingen, aminozuren en agrochemicaliën.
Een monster wordt geïnjecteerd via een van twee methoden:
Door slim gebruik te maken van verschillen in geleidingsvermogen kan een verdund monster bij injectie sterk worden geconcentreerd. Bij field-amplified sample stacking (FASS) wordt het monster opgelost in een buffer met lagere ionensterkte dan de scheidingsbuffer. Bij aanleggen van de spanning is het elektrische veld in het monster lokaal hoger, waardoor ionen sneller migreren tot ze de hoofdbuffer bereiken en daar afremmen en concentreren. Deze techniek kan de gevoeligheid met een factor 10 tot 1000 verbeteren en compenseert deels het kleine injectievolume van CE.
Goede monsterbereiding is bij CE minstens zo belangrijk als bij HPLC, omdat het kleine injectievolume (nanoliter-bereik) weinig ruimte biedt voor fouten. De voorbereiding verschilt per toepassing, maar de volgende stappen zijn in vrijwel alle CE-methoden relevant:
Voor DNA-analyse (CGE) volstaat in de meeste gevallen een directe verdunning van het PCR-product in water; PCR-reinigingsstappen zijn niet altijd noodzakelijk maar verbeteren de reproduceerbaarheid. Zie ook het artikel over buffers bereiden en bufferkeuze voor achtergrond over ionensterkte en pH-instelling.
De gescheiden deeltjes worden ter plaatse in de capillair gedetecteerd. De meest gebruikte detectiemethoden zijn:
Capillaire elektroforese en vloeistofchromatografie (HPLC) zijn complementaire scheidingstechnieken. De belangrijkste verschillen:
Voor reproduceerbare CE-resultaten zijn enkele praktische aspecten cruciaal:
Bij microchip-elektroforese wordt de capillair vervangen door microkanalen geëtst in glas, kwarts of polymeer. Doordat de scheidingsafstand korter is en de warmteafvoer beter, kunnen analyses in seconden worden voltooid in plaats van minuten. Microchip-CE vormt de basis van veel lab-on-a-chip-systemen, zoals de Bioanalyzer en TapeStation voor DNA- en eiwitanalyse, en wordt steeds vaker toegepast in point-of-care diagnostiek.
Bij hemoglobine-typering via capillaire elektroforese worden de hemoglobinefracties in bloed gescheiden en uitgedrukt als percentage van het totale hemoglobine. De volgende referentiewaarden gelden voor volwassenen bij alkalische capillaire elektroforese (pH 9,4, gebruikelijk in klinische automatensystemen):
De exacte referentiewaarden zijn afhankelijk van het gebruikte CE-systeem, de kalibratie en de laboratoriumspecifieke normaalwaarden. Raadpleeg altijd de documentatie van het betreffende analyseplatform en de geldende laboratoriumrichtlijnen. Capillaire elektroforese heeft voor Hb-typering grotendeels de klassieke alkalische en zure agarosegelelektroforese vervangen vanwege de hogere reproduceerbaarheid, automatisering en kwantitatieve nauwkeurigheid.
Capillaire elektroforese onderscheidt zich door een uitzonderlijk hoge scheidingsefficiëntie, een minimaal monster- en reagentiaverbruik en korte analysetijden. Wat betreft kosten zijn de instrumentatiekosten van CE vergelijkbaar met die van HPLC, maar de lopende kosten liggen aanzienlijk lager: de capillair is goedkoop en lang mee te gaan, en het bufferverbruik beperkt zich tot milliliters per analyse. De techniek is breed toepasbaar, van kleine ionen tot grote biomoleculen. Tegenover deze voordelen staan enkele beperkingen: de gevoeligheid van UV-detectie is door de korte optische weglengte lager dan bij HPLC, de reproduceerbaarheid van de migratietijd is gevoelig voor veranderingen aan het capillairoppervlak en Joule-verwarming, en de techniek vereist zorgvuldig onderhoud van de capillair en de buffers om consistente resultaten te behalen.
De aanschafprijs van een volledig geautomatiseerd CE-systeem ligt doorgaans tussen de 30.000 en 80.000 euro, afhankelijk van het detectorsysteem (UV, DAD of MS-koppeling) en de mate van automatisering. Dat is vergelijkbaar met een instap-HPLC-systeem, maar de lopende kosten liggen bij CE aanzienlijk lager:
Voor routinelaboratoria die veel serumeiwitanalyses of DNA-typering uitvoeren, is CE per analyse goedkoper dan alternatieve methoden. De relatief hoge aanschafprijs wordt doorgaans terugverdiend via lage verbruikskosten en hoge analytische doorvoer. Zie ook het artikel over HPLC voor een bredere kostenvergelijking met vloeistofchromatografie.
Capillaire elektroforese sluit aan bij andere scheidings- en analysetechnieken in de kennisbank. Zie de artikelen over vloeistofchromatografie, ionenwisselchromatografie en next-generation sequencing voor verwante methoden in de moleculaire analyse. Voor benodigde verbruiksartikelen kunt u terecht in de categorie chromatografie. Voor de thermische stabiliteitsbepaling van therapeutische eiwitten en monoklonale antilichamen die via capillaire elektroforese worden gekarakteriseerd, zie DSC voor biomoleculen: eiwitontvouwing en Tm-bepaling.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
