Isotherme amplificatiemethoden zijn nucleïnezuurtechnieken waarbij DNA of RNA wordt vermenigvuldigd bij een constante temperatuur, zonder de temperatuurcycli die kenmerkend zijn voor de polymerasekettingreactie (PCR). Doordat geen thermocycler nodig is, zijn deze methoden bij uitstek geschikt voor diagnostiek buiten het laboratorium: in het veld, aan het bed van de patiënt of in lage-inkomenslanden. Na de COVID-19-pandemie is de toepassing van isotherme amplificatie sterk toegenomen, aangedreven door de vraag naar snelle, draagbare nucleïnezuurdetectie. Dit artikel beschrijft de voornaamste methoden — met nadruk op LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) en RPA (Recombinase Polymerase Amplification) — het principe, de vergelijking met PCR, de detectiemethoden, de vereiste apparatuur en de toepassingen in velddiagnostiek en point-of-care (POC) testing.
Bij conventionele PCR en SNP-genotypering wisselt de thermocycler cyclisch tussen drie temperatuurniveaus: denaturatie (~95 °C), primeranneling (~55–65 °C) en elongatie (~72 °C). Deze temperatuurcycli vereisen een nauwkeurig geregeld instrument met snelle verwarmings- en koelingsblokken. Bij isotherme methoden worden alle enzymatische stappen bij één temperatuur uitgevoerd, wat de vereiste apparatuur drastisch vereenvoudigt. Een eenvoudig verwarmingsblok, een waterbad of zelfs de lichaamswarmte (37 °C bij sommige methoden) volstaat.
Isotherme amplificatie lost het probleem van DNA-denaturatie op een andere manier op dan PCR: in plaats van thermisch denatureren worden DNA-strengen ontvlochten door speciale enzymen (strand-displacement polymerase, recombinase, helicase) of door de lus-structuren die bij LAMP worden gevormd. Dit heeft praktische consequenties voor toepassingen buiten het klassieke laboratorium.
LAMP werd in 2000 ontwikkeld door Notomi en collega's. De methode maakt gebruik van vier tot zes primers die zes tot acht onderscheiden regio's op het doelDNA herkennen, in combinatie met het Bst DNA-polymerase (of een variant daarvan), dat naast polymerisatie ook een krachtige strand-displacement-activiteit bezit. Het kenmerkende mechanisme verloopt als volgt.
Twee interne primers, de Forward Inner Primer (FIP) en de Backward Inner Primer (BIP), hebben elk een tweeledige structuur: het 3'-gedeelte hybridiseert aan de doelsequentie en initieert elongatie, terwijl het 5'-gedeelte identiek is aan een stroomopwaartse regio. Door de strand-displacement-activiteit van Bst-polymerase wordt de bestaande streng opzijgedrukt en tegelijk gesynthetiseerd. Wanneer de twee interne primers achtereenvolgens werken, ontstaat een dumbbellvormige structuur met aan beide uiteinden lussen. Vanaf dit moment werkt de reactie autokatalytisch: de lus-structuur fungeert als een continu gerecyclede primer die in exponentiële amplificatie resulteert. Optionele loop-primers (LF en LB) versnellen de reactie door op de lussen te binden en de cyclustijd te verkorten.
De reactietemperatuur bedraagt doorgaans 60–65 °C, waarbij de Bst-polymerase optimaal actief is. Een volledige reactie is in 15–60 minuten voltooid, vergeleken met 60–120 minuten voor conventionele PCR. De hoeveelheid geproduceerd DNA is aanzienlijk groter dan bij PCR, wat de detectie vergemakkelijkt.
LAMP-producten kunnen op meerdere manieren worden aangetoond:
Het primerdesign bij LAMP is complexer dan bij PCR. De twee interne primers (FIP en BIP) zijn bipartiet: elk bestaat uit twee aaneengekoppelde sequenties van elk 18–25 nucleotiden. De twee buitenste primers (F3 en B3) bevatten elk 15–20 nucleotiden. De optionele loop-primers beslaan typisch 15–20 nucleotiden op de gevormde lus. Gespecialiseerde softwaretools (Primer Explorer, LAMP-Designer, PrimerPlex) zijn beschikbaar voor automatisch primerdesign. De Tm-waarden van de interne primers liggen doorgaans bij 60–65 °C; de buitenste primers bij 55–60 °C.
RPA is in 2006 geïntroduceerd door TwistDx (nu onderdeel van Abbott). De methode werkt bij een nog lagere temperatuur dan LAMP: 37–42 °C, wat overeenkomt met de menselijke lichaamstemperatuur. Hierdoor is RPA geschikt voor point-of-care-toestellen zonder actieve verwarming of met minimale energiebehoefte.
Het principe is gebaseerd op de recombinase-gemedieerde DNA-homologiereactie die in levende cellen voorkomt bij DNA-reparatie en recombinatie. Het RPA-reactiemengsel bevat drie enzymatische componenten:
RPA gebruikt slechts twee primers (vergelijkbaar met PCR) van 30–35 nucleotiden. De reactietijd is uitzonderlijk kort: 10–20 minuten bij 37–42 °C volstaat voor detectie. Dit maakt RPA een van de snelste nucleïnezuuramplificatiemethoden beschikbaar.
RPA-producten worden doorgaans gedetecteerd via:
Naast LAMP en RPA zijn er verscheidene andere isotherme amplificatiemethoden die elk een eigen toepassingsgebied hebben.
NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) werkt bij 41 °C en is specifiek ontwikkeld voor RNA-amplificatie zonder voorafgaande reverse-transcriptie in een aparte stap. Het enzymcocktail bevat een reverse transcriptase, RNase H en T7 RNA-polymerase. NASBA produceert grote hoeveelheden RNA-kopieën en wordt toegepast in de detectie van RNA-virussen (hiv, influenza, SARS-CoV-2) en ook in klinische bloedbanktoepassingen.
HDA (Helicase-Dependent Amplification) maakt gebruik van een helicase-enzym om de DNA-dubbelstreng te ontvlechten, vergelijkbaar met de processen in het levende cel-DNA-replicatiesysteem. HDA werkt bij 65 °C (thermofiele helicase) en gebruikt twee primers, net als PCR. Voordeel is het eenvoudige primerdesign; nadeel is de lagere efficiëntie in vergelijking met LAMP.
SDA (Strand Displacement Amplification) maakt gebruik van een nickase-enzym dat een enkelvoudige insnijding maakt in een gemodificeerde doelsequentie met alfa-thio-dNTPs, gevolgd door strand-displacement-polymerisatie. SDA werkt bij 37–52 °C en werd vroeg commercieel toegepast in de diagnostiek van seksueel overdraagbare aandoeningen (Chlamydia, gonorroe) via de BDProbeTec-platforms.
NEAR (Nicking Enzyme Amplification Reaction) combineert nicking-enzymen met een strand-displacement-polymerase voor uiterst snelle amplificatie (minder dan vijf minuten). NEAR is de basis van commerciële snelle influenza-testen en wordt ingezet wanneer extreem korte reactietijden vereist zijn.
De hoge specificiteit van LAMP is een van de meest gewaardeerde eigenschappen. Doordat zes tot acht afzonderlijke regio's op het doelDNA worden herkend door de primerset, is de kans op vals-positieve amplificatie door niet-specifieke binding uiterst klein. Dit onderscheidt LAMP van methoden met slechts twee primers, waarbij kruisreactiviteit vaker voorkomt. In diagnostische toepassingen — zoals onderscheid tussen nauw verwante pathogenen — is deze hoge specificiteit van grote waarde.
RPA kan bij onzorgvuldig primerdesign gevoeliger zijn voor aspecifieke amplificatie door de lagere reactietemperatuur, wat de thermische drempel voor primer-mismatch verlaagt. Zorgvuldig primerdesign en het gebruik van een exo-sonde voor detectie verminderen dit risico aanzienlijk.
Een praktisch voordeel van zowel LAMP als RPA ten opzichte van PCR is de hogere tolerantie voor inhibitoren die aanwezig zijn in klinische of omgevingsmonsters. Bloed, sputum, feces, bodem en voedselextracten bevatten componenten (hemoglobine, heparine, humuszuren, polysacchariden) die de Taq-polymerase bij PCR remmen. Bst-polymerase (LAMP) en de RPA-enzymmix zijn minder gevoelig voor deze stoffen, waardoor een eenvoudigere monstervoorbereiding mogelijk is. In sommige LAMP- en RPA-toepassingen wordt het monster direct (geresuspendeerd in water of een eenvoudig lysisbuffer) aan de reactie toegevoegd, zonder uitgebreide nucleïnezuurzuivering.
Bij DNA-isolatie en DNA-extractie is volledige zuivering van het nucleïnezuur standaard vereist voor PCR-toepassingen; bij isotherme methoden voor POC-gebruik kan een verkorte of vereenvoudigde extractie volstaan, wat bijdraagt aan de snelheid en eenvoud van het gehele testproces.
Een inherent nadeel van isotherme amplificatie — en in het bijzonder van LAMP — is het grote volume aan geproduceerd amplicon in een open reactievat. Bij visuele of turbidimetrische detectie moet het deksel van het reactievat worden geopend, wat de kans op carry-over-besmetting vergroot. Dit is vergelijkbaar met het risico bij conventionele PCR vóór de introductie van gesloten real-time systemen. In laboratoriumcontext zijn de gebruikelijke voorzorgsmaatregelen van toepassing: fysieke scheiding van pre- en post-amplificatieruimtes, gebruik van dedicated pipetten en gefilterde tips, en het werken op een schoon werkoppervlak. In geïntegreerde POC-cartridges is dit probleem opgelost doordat de amplificatie en detectie plaatsvinden in een gesloten, wegwerpbaar systeem.
Point-of-care (POC) diagnostiek verwijst naar diagnostische testen die worden uitgevoerd op de locatie van de patiënt of in de onmiddellijke nabijheid ervan, zonder dat het monster naar een centraal laboratorium hoeft te worden gestuurd. De ASSURED-criteria van de WHO beschrijven de eigenschappen waaraan een ideale POC-test voldoet: Affordable (betaalbaar), Sensitive (gevoelig), Specific (specifiek), User-friendly (gebruiksvriendelijk), Rapid and robust (snel en robuust), Equipment-free (uitrustingsvrij), en Deliverable to end-users (toegankelijk).
Isotherme amplificatiemethoden — en met name LAMP en RPA — voldoen aan de meeste van deze criteria beter dan PCR. De combinatie van minimale apparatuurvereisten, korte reactietijden en een breed scala aan eenvoudige detectiemethoden maakt ze bij uitstek geschikt voor implementatie in huisartsenpraktijken, spoedeisende hulp, ambulances, apotheken, luchthavens en veldlaboratoria in lage-inkomenslanden.
De COVID-19-pandemie heeft de ontwikkeling en implementatie van isotherme amplificatiemethoden in een stroomversnelling gebracht. Toen de wereldwijde vraag naar SARS-CoV-2-diagnostiek in 2020 explodeerde, bleken de beschikbare PCR-capaciteit en het benodigde instrumentarium een bottleneck. RT-LAMP (reverse-transcriptase LAMP voor RNA-detectie) bood een alternatief dat kon worden geïmplementeerd met minder gespecialiseerde apparatuur en eenvoudiger getraind personeel. Tientallen RT-LAMP-assays voor SARS-CoV-2-detectie werden in 2020–2022 gepubliceerd en gedeeltelijk voor noodgebruik goedgekeurd.
Tegelijkertijd stimuleerde de pandemie de ontwikkeling van geïntegreerde, volledig gesloten POC-platforms die extractie, amplificatie en detectie combineren in één wegwerppatroon. Bedrijven als Abbott (ID NOW, op basis van NEAR), Cepheid (GeneXpert, op basis van PCR maar met geïntegreerde extractie) en diverse fabrikanten van LAMP-gebaseerde cartridges brachten systemen op de markt die door minimaal getraind personeel kunnen worden bediend. De standaardisatie en validatie van deze platforms heeft de basis gelegd voor bredere toepassing na de pandemie in syndromische diagnostiek, resistentietesting en tropische ziekten.
LAMP- en RPA-assays zijn beschikbaar voor een groot aantal pathogenen: malaria (Plasmodium-species), tuberculose (Mycobacterium tuberculosis), dengue, Zika, chikungunya, HIV, hepatitis B en C, SARS-CoV-2, influenza en RSV. In lage-inkomenslanden met beperkte laboratoriuminfrastructuur bieden LAMP-gebaseerde testen diagnostische capaciteit die voorheen niet beschikbaar was. In het bijzonder voor malaria zijn LAMP-assays met gevoeligheden vergelijkbaar met microscopie — en in sommige studies gevoeliger — aangetoond in veldomstandigheden in sub-Sahara Afrika.
Detectie van pathogenen in voedsel (Salmonella, Listeria, E. coli O157:H7, norovirus) vereist gevoelige methoden die snel resultaten geven in de productieketen. LAMP-assays voor voedselanalyse zijn robuust genoeg voor directe toepassing op verrijkte voedselmonsters met beperkte voorzuivering. Ook in de omgevingsmonitoring — wateranalyse op fecale indicatoren of legionella — zijn LAMP-methoden beschikbaar.
Uitbraken van dierziekten (mond-en-klauwzeer, vogelgriep, Afrikaanse varkenspest) vereisen snelle diagnostiek in het veld om verspreiding te beperken. LAMP- en RPA-assays die in mobiele laboratoriumeenheden kunnen worden uitgevoerd, zijn hiervoor operationeel ingezet.
Voor forensische toepassingen waarbij snel de aanwezigheid van humaan DNA op een locatie moet worden bevestigd, of voor de detectie van invasieve soorten in omgevingsmonsters (eDNA-monitoring), bieden isotherme methoden een praktisch alternatief voor PCR in het veld. Vergelijkbare technieken worden ingezet in de detectie van GMO's in graan- en zaadpartijen. Voor de forensische context van DNA-amplificatie, zie ook het kennisbankartikel over PCR en SNP-genotypering.
Detectie van virussen en schimmels in gewassen (Phytophthora, tomatenmozaïekvirus, bacterievuur bij appel- en peerteelt) is van groot belang voor gewasbescherming. LAMP-assays kunnen worden uitgevoerd in het veld door agronomen zonder laboratoriumachtergrond, waardoor snelle interventiebeslissingen mogelijk worden.
Een geavanceerde toepassing is digitale LAMP (dLAMP), analogisch aan digitale PCR (dPCR). Het monster wordt verdeeld over duizenden microreacties (microchips, druppels of buisjes), waarna bij elke individuele reactie de amplificatie als positief of negatief wordt gescoord. Via Poisson-statistiek wordt de absolute kopieaantalbepaling berekend zonder kalibratiestd. dLAMP heeft potentie voor de detectie van zeldzame mutaties (ctDNA in oncologie), de kwantificering van virale load en het bewaken van therapierespons — toepassingen die vergelijkbaar zijn met die van digitale PCR en qPCR.
De meest geavanceerde toepassing van isotherme amplificatie is de integratie in volledig gesloten, zelfstandige cartridges waarbij extractie, amplificatie en detectie plaatsvinden zonder tussenkomst van de gebruiker na monsterinvoer. Voorbeelden zijn microfluidische chips waarop het monster via capillaire krachten of peristaltische micropompen door extractie-, amplificatie- en detectiezones wordt getransporteerd. Detectie vindt plaats via geïntegreerde fluorescentiesensoren, impedantiemetingen of laterale-vloeistofstrips. Deze platforms elimineren de variabiliteit van handmatige monsterverwerking, minimaliseren het risico op kruisbesmetting en verlagen de vereiste opleiding van de gebruiker. Ze sluiten conceptueel aan bij de microchip-elektroforeseplatforms die worden beschreven in het kennisbankartikel over capillaire elektroforese.
Voor de detectie van RNA-doelwitten (virussen zoals SARS-CoV-2, influenza, HIV) wordt een reverse-transcriptase-stap gecombineerd met LAMP in één reactie: RT-LAMP. Het reverse transcriptase zet het RNA om in cDNA in dezelfde buis en bij dezelfde temperatuur als de LAMP-amplificatie, waardoor geen extra stap of temperatuurwisseling nodig is. Commercieel beschikbare enzymmixen combineren een thermostabiel reverse transcriptase met Bst-polymerase. De RT-LAMP-assay verloopt bij 60–65 °C en is voltooid binnen 30 minuten, inclusief de reverse-transcriptiestap. Dit is vergelijkbaar met RT-qPCR, maar zonder de vereiste thermocycler. Zie voor de achtergrond van RNA-isolatie als voorbereidende stap het kennisbankartikel over RNA-isolatie en RNA-analyse.
Voor LAMP en RPA in een laboratoriumomgeving zijn de volgende instrumenten en materialen benodigd.
Voor LAMP: een thermostaat of thermoblock (60–65 °C), bij voorkeur met deksel om condensatie te voorkomen; reactievaatjes (0,2 ml PCR-buisjes of strips); pipetten en gefilterde tips; een fluorescentielezer bij gebruik van real-time LAMP (analoog aan een qPCR-apparaat); of een eenvoudige UV-lamp bij gebruik van calcein. Bekijk het assortiment biotechnologie & moleculaire biologie voor thermostaten, thermoblock-apparatuur en reactievaatjes.
Voor RPA: een incubator of thermoblock (37–42 °C); RPA-enzymkits (commercieel verkrijgbaar van TwistDx/Abbott); reactievaten (geleverd bij de kit); laterale-vloeistofstrips voor detectie; of een fluorescentieapparaat voor real-time RPA. RPA-kits zijn doorgaans lyofylisaat-gebaseerd, wat koelkettingvereisten beperkt in vergelijking met PCR-enzymmengsels.
Verbruiksartikelen die voor beide methoden van belang zijn: centrifugebuizen en reactievaatjes, pipetpunten (bij voorkeur gefilterd voor contaminatiepreventie), nucleasevrij water, en buffers en zoutoplossingen voor monstervoorbereiding.
Isotherme amplificatiemethoden die worden gebruikt als diagnostisch hulpmiddel voor menselijke pathogenen vallen in de EU onder de Verordening medische hulpmiddelen voor in-vitrodiagnostiek (IVDR, EU 2017/746). Voor bepaalde toepassingen (detectie van meldingsplichtige infectieziekten, hiv, hepatitis B/C) gelden aanvullende prestatie-eisen en is CE-IVD-markering vereist. Validatie conform ISO 15189 of CLSI-richtlijnen — inclusief analytische gevoeligheid, specificiteit, reproduceerbaarheid en interferentiestudie — is vereist voor klinische implementatie. Raadpleeg voor implementatie in een geaccrediteerd diagnostisch laboratorium de geldende normen en de bevoegde autoriteiten (RIVM, NEN, accreditatie-instantie RvA).
PCR vereist een thermocycler die cyclisch tussen drie temperatuurniveaus wisselt (denaturatie ~95 °C, anneling ~55–65 °C, elongatie ~72 °C). LAMP werkt bij één constante temperatuur (60–65 °C) met een strand-displacement polymerase en een set van vier tot zes primers. LAMP is daardoor sneller (15–60 min), eenvoudiger uitvoerbaar buiten het laboratorium en produceert meer amplicon. PCR heeft echter als voordeel een eenvoudiger primerdesign, betere kwantificeerbaarheid en een bredere beschikbaarheid van gevalideerde assays.
LAMP heeft inherent een hogere specificiteit dan tweeprimersystemen doordat het zes tot acht afzonderlijke regio's op het doelDNA herkent. Toch kunnen bij onzorgvuldig primerdesign of bij lange incubatietijden niet-specifieke amplificaties optreden, met name wanneer de doelsequentie in grote concentraties aanwezig is of bij contaminatie. Gebruik van smeltcurveanalyse (bij real-time LAMP), sequentie-specifieke sondes, of CRISPR-gebaseerde detectie verkleint het risico op vals-positieve resultaten. Altijd een niet-template-controle (NTC) meenemen.
De analytische gevoeligheid van RPA (detectielimiet) is vergelijkbaar met conventionele PCR: typisch 1–10 kopieën per reactie bij geoptimaliseerde assays. Voor sommige pathogenen en matrices is de gevoeligheid iets lager dan qPCR, maar in de praktijk volstaat de gevoeligheid van RPA voor de meeste diagnostische toepassingen. Het grote voordeel van RPA ten opzichte van qPCR is de snelheid (10–20 min versus 60–90 min) en de eenvoud van uitvoering zonder gespecialiseerde apparatuur.
De standaard LAMP-reactietemperatuur is 60–65 °C, met 63 °C als meest gebruikte optimum voor Bst 2.0 WarmStart-polymerase. Sommige geoptimaliseerde LAMP-assays werken bij 65 °C voor verhoogde specificiteit. RPA werkt bij 37–42 °C, met 39 °C als aanbevolen temperatuur voor de meeste TwistDx-kits.
Er bestaat geen specifieke ISO-norm voor LAMP als zodanig. Diagnostische LAMP-assays voor klinisch gebruik vallen onder de bredere richtlijnen voor nucleïnezuuramplificatietechnieken: ISO 15189 (medische laboratoria), ISO/TS 5798 (nucleïnezuuramplificatietests voor infectieziekten), EN/ISO 17511 (traceerbaarheid van ijkwaarden) en de IVDR (EU 2017/746). Verificatie en validatie zijn verplicht voor klinische implementatie ongeacht de amplificatiemethode.
In laboratoriumopstellingen: gebruik gesloten detectiesystemen (real-time fluorescentie), voer de reactie uit in een gesloten vaatje en open dit niet na amplificatie voor visuele detectie. Gebruik gefilterde pipetpunten, dedicated pipetten voor de pre-amplificatiefase, en scheid pre- en post-amplificatieruimtes. In POC-cartridges is het systeem inherent gesloten en is kruisbesmetting niet mogelijk.
Isotherme amplificatie sluit aan bij meerdere andere technieken in de Labvakhandel-kennisbank. Voor PCR als referentiemethode, primers, thermocyclers en genotypering: PCR en SNP-genotypering. Voor kwantitatieve nucleïnezuurdetectie via real-time fluorescentiemeting: qPCR / real-time PCR. Voor de isolatie en zuivering van DNA en RNA als voorbereiding op isotherme amplificatie: DNA-isolatie en DNA-extractie en RNA-isolatie en RNA-analyse. Voor genoomsequencing als aanvullende techniek bij pathogeen-karakterisering: next-generation sequencing (NGS). Voor CRISPR-gebaseerde detectiesystemen (SHERLOCK, DETECTR) die worden gecombineerd met isotherme preamplificatie: CRISPR-Cas9 en genoombewerking. Voor controle van amplificatieproducten op grootte: gelelectroforese.
Voor aanvullende externe informatie raadpleegt u de WHO-richtlijnen voor diagnostische evaluaties en de gepubliceerde MIQE-extensie voor isotherme amplificatie (MIQE-IA), beschikbaar via de websites van de MIQE-auteurs en de betreffende peer-reviewde tijdschriften. Het ECDC publiceert op ecdc.europa.eu overzichten van goedgekeurde moleculaire diagnostische methoden voor infectieziekten in de EU.
Bekijk het assortiment biotechnologie & moleculaire biologie of neem contact op voor advies over de juiste apparatuur en verbruiksartikelen voor uw isotherme amplificatie-toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting op isotherme amplificatiemethoden. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
