Native mass spectrometry (native MS) is een variant van massaspectrometrie waarbij biomoleculen worden geanalyseerd in een toestand die zo dicht mogelijk bij de fysiologische situatie ligt. Waar klassieke massaspectrometrie werkt met gedenatureerde of gedigereerde moleculen, behoudt native MS de niet-covalente interacties die eiwitcomplexen, eiwit-ligandverbindingen en multisubeenheidassemblages bij elkaar houden. Het resultaat is een massa-meting van het intacte, gevouwen macromolecuul — inclusief alle gebonden subunits, cofactoren en lipidemoleculen. Native MS is daarmee een directe brug tussen structuurbiologie en analytische chemie, en speelt een groeiende rol in de karakterisering van biofarmaceutica zoals monoklonale antilichamen, bivalente antistoffen en ADC's (antibody-drug conjugates). Native MS werkt uitsluitend met een goed gezuiverd, in vluchtige buffer overgezet monster; zie voor de opzet van het zuiveringstraject het artikel over eiwitzuivering.
Bij conventionele massaspectrometrie worden eiwitten vooraf behandeld met denaturerende oplosmiddelen (organische zuren, acetonitrile, hitte) of enzymatisch gedigereerd tot peptiden. Dit levert hoge gevoeligheid en breed toepasbare methoden op, maar verbreekt alle niet-covalente bindingen: quaternaire structuur, eiwit-eiwit-interacties en eiwit-ligandcomplexen gaan verloren voordat het monster de ionenbron bereikt.
Native MS vermijdt denaturatie door gebruik te maken van vluchtige, fysiologisch compatibele buffers — doorgaans ammoniumacetaat of ammoniumcarbonaat in concentraties van 10 tot 200 mmol/L, bij een pH die de biologische activiteit van het eiwit ondersteunt. Onder deze omstandigheden blijft de tertiaire en quaternaire structuur van het eiwit bewaard gedurende ionisatie en ionenoverdracht naar het vacuüm van de massaspectrometer.
De meest gebruikte ionisatiemethode voor native MS is elektrospray-ionisatie (ESI) onder mild-denaturing of native condities, ook wel nanoESI genoemd wanneer lage flowsnelheden (10–500 nL/min) worden gebruikt. De nanoESI-naald — een fijne glazen of kwartsen capillaire met een opening van enkele micrometer — genereert een stabiele spay bij laag elektrisch veld en lage flowsnelheid. Dit minimaliseert verhitting en solvolverende shear stress, die beide de native toestand kunnen destabiliseren.
Tijdens het verdampingsproces worden de waterige druppels steeds kleiner. Oplosmiddelmoleculen verdampen, terwijl ammoniumacetaat als vluchtig zout met het oplosmiddel mee verdampt. Het intacte eiwitcomplex behoudt daarbij zijn compacte vouwing en blijft als meervoudig geladen ion (multiply charged ion) over, maar met een lagere lading per massa-eenheid dan een gedenatureerd eiwit van gelijke grote. Dit resulteert in een karakteristiek hoog m/z-bereik en een smalle ladingstoestand-verdeling.
Membraaneiwitten vormen een speciale categorie: ze zijn hydrofob en vereisen in oplossing een membraanmimetische omgeving (detergenten of lipide-nanodiscs) om stabiel te blijven. In native MS worden membraaneiwitten doorgaans overgedragen als eiwit-detergent-micellen. In de gasphase wordt het detergent door collisie-activatie verwijderd (in-source of in-trap activation), zodat het naakte eiwit of membraaneiwit-lipidecomplex overblijft voor massabepaling.
Niet alle massaspectrometers zijn geschikt voor native MS. De combinatie van hoog molecuulgewicht (MDa-bereik voor grote complexen), hoog m/z en brede piekvormen vereist specifieke instrumentkenmerken:
De meest directe toepassing is de bepaling van de intacte massa van een eiwitcomplex. Uit de geobserveerde m/z-waarden en de bijbehorende ladingstoestanden wordt via deconvolutie de neutrale massa berekend. Voor een complex van bekende subunits kan de stoichiometrie worden bepaald: een massa van 148.000 Da voor een mogelijke tetrameer van een 37.000 Da-subunit bevestigt een A4-architectuur. Gemeten massa's worden doorgaans vergeleken met de theoretische massa berekend vanuit de aminozuursequentie (plus eventuele post-translationele modificaties).
Native MS kan niet-covalente eiwit-ligandcomplexen direct meten. Wanneer een receptor met zijn ligand (klein molecuul, peptide, nucleïnezuur) wordt gemengd en gemeten, verschijnen naast het vrije eiwit-signaal ook pieken voor het eiwit-ligandcomplex op hogere m/z. Uit de verhouding van vrij eiwit tot gebonden complex kan bij bekende concentraties een dissociatieconstante (KD) worden geschat via direct ESI-MS binding-experimenten. Native MS is hierbij complementair aan isothermische titratiecalorimetrie (ITC), dat thermodynamische parameters geeft maar geen structurele informatie.
Bij top-down native MS worden intacte eiwitten gefragmenteerd in de gasphase (ETD, ECD, HCD) zonder voorafgaande proteolytische digestie. Dit geeft informatie over de lokalisatie van modificaties (fosforylering, glycosylering, acetylering) in de context van het volledig gevouwen eiwit, inclusief informatie over welke modificatiecombinaties gelijktijdig op één molecuul voorkomen — informatie die bij bottom-up peptide-MS verloren gaat.
Ion mobility-massaspectrometrie (IM-MS of IMS-MS) meet hoe snel ionen door een gas-gevulde buis bewegen onder invloed van een elektrisch veld. Compacte, gevouwen conformaties bewegen sneller dan uitgevouwen of flexibele vormen van gelijke massa. De gemeten aankomstijd wordt omgezet naar een collisionele dwarsdoorsnede (CCS, uitgedrukt in Ų), die een directe experimentele maatstaf is voor de ruimtelijke omvang van het ion. Native IM-MS kan daarmee onderscheid maken tussen conformers, apolipoproteïne-isovormen en geaggregeerde versus monomere populaties in één meting.
De biofarmaceutische industrie heeft native MS omarmd als een kritisch hulpmiddel in de karakterisering van biologische geneesmiddelen. Drie hoofdtoepassingen domineren:
Een monoklonaal antilichaam is een heterotetrameer (twee zware en twee lichte ketens) met een molecuulmassa van circa 148 kDa. Native MS kan de intacte massa meten en bevestigen dat de correcte ketenstoichiometrie aanwezig is. Wanneer een mAb wordt onderworpen aan mild reductie (partiële reductie van de hinge-region disulfidebrug), kunnen half-antilichamen en andere assemblagevarianten worden onderscheiden. Native MS-data worden gebruikt als aanvullend bewijs naast SEC-analyse voor de beoordeling van aggregaten en fragmenten als kritische kwaliteitsattributen (CQA's).
Antibody-drug conjugates (ADC's) bevatten een antilichaam waaraan via chemische of enzymatische koppeling cytotoxische payloads zijn gehecht. Het gemiddeld aantal payload-moleculen per antilichaam, de drug-to-antibody ratio (DAR), is een kritisch kwaliteitsparameter. Native MS meet de massa van elke DAR-soort afzonderlijk en geeft daarmee de volledige DAR-distributie in één meting — een informatie die moeilijk te verkrijgen is met andere technieken.
Bispecifieke antilichamen bestaan uit twee verschillende bindingsdomeinen en zijn complexer van samenstelling dan klassieke mAb's. Native MS kan bevestigen dat de correcte heterodimeervorming heeft plaatsgevonden en dat beide bindingsarmen aanwezig zijn in de verwachte stoichiometrie, wat van groot belang is voor lot-vrijgave in de productie van biologische geneesmiddelen.
Native MS wordt ook ingezet voor de karakterisering van virale vectoren zoals adeno-associated viruses (AAV's) en virusachtige deeltjes (VLP's), die als drager worden gebruikt voor gentherapie en vaccinontwikkeling. De intacte capsidemassa — die kan oplopen tot tientallen megadalton — kan worden bepaald via native MS op instrumenten met een extreem hoog m/z-bereik, zoals de Orbitrap EMR of gespecialiseerde hoge-massa Q-TOF-platforms. Native MS onderscheidt daarmee volle capsiden (met genetisch materiaal) van lege capsiden en partieel gevulde varianten in één meting, wat van groot belang is voor kwaliteitscontrole in de productie van gentherapeutica.
Succesvolle native MS begint bij een goed voorbereide oplossing. De voornaamste stappen zijn:
Native MS-spectra tonen complexe patroon van meervoudig geladen ionen op hoog m/z. Het omrekenen van m/z-waarden naar neutrale massa's vereist gespecialiseerde deconvolutiesoftware. De ladingstoestand z van elk piek wordt bepaald door te zoeken naar een reeks pieken die onderling precies 1/z Da van elkaar verschillen (voor eenvoudige ladingstoestand-series). Veelgebruikte software zijn Agilent MassHunter, Waters MaxEnt, Bruker DataAnalysis en de open-source tools UniDec en mMass.
Bij grote, heterogene complexen (membraaneiwitten in detergent, glycoproteïnen) is de piekbreedte groot door inhomogene massadistributies. Hiervoor zijn gespecialiseerde algoritmen (zoals charge-state deconvolution met regulering) beschikbaar die toch een betrouwbare massa-schatting geven.
Native MS is de hoeksteen geworden van een bredere aanpak die structurele massaspectrometrie wordt genoemd. Hiertoe behoren ook:
Samen vormen deze methoden een integratieve toolkit die, in combinatie met cryo-EM en computationele modellering (zoals AlphaFold-gegenereerde modellen), steeds gedetailleerdere structurele kennis van complexe biomoleculaire assemblages oplevert.
In de biochemie en analytische chemie verwijst native naar de toestand van een biomolecuul zoals het van nature in de cel voorkomt: volledig gevouwen, biologisch actief, en met alle niet-covalente interacties intact. Een native eiwit heeft zijn driedimensionale structuur behouden — de zogenoemde tertiaire structuur — en bevindt zich, als het deel uitmaakt van een eiwitcomplex, ook in zijn quaternaire structuur met de juiste bindingspartners.
Het tegendeel is een gedenatureerd eiwit: door verhitting, organische oplosmiddelen, zuren of detergenten verliest het eiwit zijn gevouwen structuur en worden niet-covalente bindingen verbroken. Een gedenatureerd eiwit is biologisch inactief en heeft een andere ruimtelijke vorm dan het native eiwit, ook al is de aminozuurvolgorde (de primaire structuur) identiek.
In de context van native mass spectrometry betekent "native" dat het eiwit of eiwitcomplex de ionisatie- en meetprocedure doorloopt zonder zijn gevouwen toestand te verliezen. Dit wordt bereikt door het gebruik van vluchtige, fysiologisch compatibele buffers en milde ionisatieparameters. Het onderscheid met conventionele, denaturerende MS is uitgebreider beschreven in de sectie Wat is het verschil tussen native en denatured mass spectrometry? hierboven.
Een native MS-experiment volgt een vaste reeks stappen die erop gericht zijn de fysiologische toestand van het eiwit of eiwitcomplex te bewaren van monstervoorbereiding tot detectie:
Native MS is een massa-meettechniek waarbij eiwitten worden gewogen in hun gevouwen, actieve vorm — inclusief alle moleculen die er normaal aan vast zitten. Zo kunt u niet alleen de massa van een enkel eiwit bepalen, maar ook van een eiwitcomplex dat uit meerdere subunits bestaat, of van een eiwit met een gebonden geneesmiddelmolecuul.
Bij SDS-PAGE worden eiwitten gedenatureerd met SDS en gescheiden op molecuulmassa in een gel. Native MS maakt geen gebruik van een gel en denatureert de eiwitten niet: het meet de massa van het intacte, gevouwen eiwit of complex direct. Native MS is gevoeliger, geeft exacte molecuulmassa's en kan meerdere complexvarianten tegelijk onderscheiden, maar vereist gespecialiseerde apparatuur en monstervoorbereiding.
Native PAGE — zoals beschreven in ons artikel over gelelektroforese — scheidt eiwitcomplexen op grootte en lading in een gel en is relatief eenvoudig uit te voeren. Native MS geeft exacte massa's, stoichiometrie en directe identificatie van complexpartners, maar vereist een massaspectrometer met hoog m/z-bereik. In de praktijk worden beide technieken complementair ingezet: native PAGE voor een eerste kwaliteitscontrole of enzymactiviteitsbepaling, native MS voor gedetailleerde karakterisering.
Native eiwitten — eiwitten in hun gevouwen, biologisch actieve toestand — worden bestudeerd met een reeks complementaire technieken, elk met een eigen informatietype:
In de praktijk worden deze technieken integraal ingezet: native MS geeft snel massa en stoichiometrie, cryo-EM of kristallografie levert de driedimensionale structuur, en CD of ITC voegt thermodynamische en structurele context toe.
Ja, in strikte thermodynamische zin zijn veel native eiwitten kinetisch stabiel maar niet altijd thermodynamisch het meest stabiele systeem. De gevouwen, native toestand is doorgaans de toestand met de laagste vrije energie die het eiwit onder fysiologische omstandigheden bereikt, maar dat betekent niet dat die toestand onbeperkt stabiel is. Eiwitten kunnen spontaan ontvouwen of aggregeren als de omgevingscondities veranderen (temperatuur, pH, oplosmiddel, concentratie). In die zin zijn ze metastabiel: ze verkeren in een lokaal energetisch minimum dat stabiel is onder normale omstandigheden, maar kwetsbaar voor verstoring.
Voor native MS is dit van praktisch belang: de monstervoorbereiding (bufferwisseling, concentratie, temperatuur) moet zo worden uitgevoerd dat het eiwit in zijn native, gevouwen toestand blijft. Destabiliserende condities — zoals te lage ionsterkte, extreme pH of te hoge concentratie — kunnen leiden tot aggregatie of conformationele heterogeniteit die de kwaliteit van het native MS-spectrum verslechtert.
Native MS is een krachtige techniek, maar kent specifieke beperkingen die de keuze voor aanvullende methoden rechtvaardigen:
Nee. Native PAGE (polyacrylamide-gelelektroforese onder native condities) is uitdrukkelijk niet denaturerend. In tegenstelling tot SDS-PAGE wordt bij native PAGE geen natriumdodecylsulfaat (SDS) toegevoegd. SDS is een sterk anionisch detergent dat eiwitten ontvouwt en negatief laadt, waardoor scheiding plaatsvindt op molecuulmassa. Bij native PAGE behouden eiwitten hun gevouwen, biologisch actieve toestand en hun eigen intrinsieke lading; de scheiding is daardoor afhankelijk van zowel massa als ladingsdichtheid en ruimtelijke vorm, en niet uitsluitend van massa.
Native PAGE is daarmee geschikt voor het aantonen van eiwitcomplexen, enzymatische activiteit in-gel en conformationele varianten, maar minder geschikt voor het bepalen van exacte molecuulmassa's (daarvoor zijn SDS-PAGE of native MS aangewezen). Het verschil tussen native PAGE, SDS-PAGE en native MS wordt verder uitgewerkt in de FAQ Wanneer gebruikt u native PAGE en wanneer native MS? hierboven.
Nee. Conventionele LC-MS en LC-MS/MS werken doorgaans onder denaturerende condities met organische oplosmiddelen en zuren. Native MS kan echter ook worden gecombineerd met on-line SEC (nSEC-MS), waarbij de buffer native condities behoudt. In dat geval spreekt men van native SEC-MS of on-line native MS.
De vier functionele eenheden van een massaspectrometer zijn ionisatiebron, ionenoverdrachtsoptica, massafilter en detector — beschreven in het artikel over massaspectrometrie. Bij native MS worden dezelfde eenheden ingezet, maar zijn de ionisatiecondities (vluchtige buffer, lage desolvatiespanning) en de massafilterinstellingen (hoog m/z-bereik) aangepast voor het behoud van niet-covalente interacties.
De meest fundamentele tweedeling in massaspectrometrie is die tussen denaturerende MS en native MS. Bij denaturerende MS worden monsters behandeld met organische oplosmiddelen en zuren, waardoor eiwitten ontvouwen en niet-covalente interacties verloren gaan. Dit levert hoge gevoeligheid op voor peptide- en sequentie-analyse. Native MS behoudt de gevouwen toestand en meet intacte eiwitcomplexen, stoichiometrie en niet-covalente interacties — het onderwerp van dit artikel.
Daarnaast wordt massaspectrometrie ingedeeld naar analysatortype (quadrupool, TOF, Orbitrap, ion-trap) en naar koppelingstechniek (GC-MS, LC-MS, direct infusion). Een overzicht van de verschillende typen en hun toepassingen staat in het artikel over massaspectrometrie.
Q1, Q2 en Q3 verwijzen naar de drie secties van een triple-quadrupool-massaspectrometer: Q1 is de eerste quadrupoolfilter die een specifiek precursor-ion selecteert, q2 (doorgaans in kleine letters) is de collisiecel waar het ion wordt gefragmenteerd, en Q3 is de tweede quadrupoolfilter die één specifiek productfragment doorlaat naar de detector. Dit principe — Multiple Reaction Monitoring (MRM) — wordt breed toegepast voor kwantitatieve analyse van geneesmiddelen, hormonen en pesticiden, en staat uitgebreid beschreven in het artikel over massaspectrometrie.
Voor native MS wordt de triple-quadrupool doorgaans niet als primaire configuratie ingezet: de hoge m/z-waarden van grote eiwitcomplexen vragen om een quadrupool-TOF of Orbitrap-platform met een breder m/z-bereik. Q1/Q3-selectie op een triple-quadrupool is wel bruikbaar voor de kwantitatieve analyse van kleinere, intacte eiwitten of van specifieke eiwitadducten in bioanalytische context.
Een massaspectrometer is in essentie een weegschaal voor moleculen. Het instrument maakt van moleculen eerst geladen deeltjes (ionen), stuurt ze door een elektrisch of magnetisch veld en meet hoe zwaar ze zijn op basis van hoe snel of hoe ver ze afbuigen. Lichtere ionen bewegen anders dan zwaardere ionen, waardoor ze van elkaar worden gescheiden. Het resultaat is een massaspectrum: een grafiek die laat zien hoeveel ionen van elke massa aanwezig zijn. Uit dat spectrum kan worden afgeleid welke stoffen in het monster zitten en in welke hoeveelheid.
Bij native MS geldt hetzelfde principe, maar worden de molecules zo behandeld dat ze hun driedimensionale vorm bewaren — zodat niet alleen de massa van losse moleculen, maar ook van complete eiwitcomplexen kan worden gemeten. Een uitgebreidere uitleg van het algemene werkingsprincipe staat in het artikel over massaspectrometrie.
De naam is samengesteld uit twee woorden. Massa verwijst naar de grootheid die wordt gemeten: de massaladingverhouding (m/z) van ionen, die direct gerelateerd is aan de molecuulmassa. Spectrometrie is afgeleid van het Griekse metron (meten) en het Latijnse spectrum (beeld of verdeling): de techniek levert een spectrum op — een geordende verdeling van signaalintensiteiten over een reeks m/z-waarden — vergelijkbaar met hoe een prisma licht uiteen trekt in een kleurenspectrum. De combinatie verwijst dus naar het meten van een massaverdeling van ionen. Vroegere benamingen waren massaspectrografie (toen het signaal nog fotografisch werd vastgelegd) en massaspectroskopie; de huidige term massaspectrometrie is since de twintigste eeuw de standaard geworden.
Een massaspectrometer bestaat functioneel uit vijf onderdelen die achter elkaar werken:
Bij native MS zijn stap 2 (milde ionisatiecondities) en stap 3 (breed m/z-bereik, zachte ionenoverdracht) specifiek aangepast om de niet-covalente interacties van het eiwitcomplex te bewaren.
Vrijwel uitsluitend elektrospray-ionisatie (ESI), bij voorkeur in de nanoESI-configuratie met lage flowsnelheid. MALDI — de andere veelgebruikte ionisatiemethode bij conventionele MS — is in de meeste gevallen niet geschikt voor native MS, omdat de matrix-laser-desorptiestap de niet-covalente interacties verbreekt. Uitzondering is native MALDI onder geoptimaliseerde matrixomstandigheden, maar deze techniek is minder algemeen.
Hoge-resolutie MS (HRMS, bijv. Orbitrap of TOF) geeft preciezere m/z-waarden en maakt deconvolutie van overlappende ladingsenveloppen bij grote complexen betrouwbaarder. Lage-resolutie MS (LRMS, bijv. quadrupool) heeft een beperktere massanauwkeurigheid en is minder geschikt voor de analyse van grote multisubeenheidcomplexen waarbij exacte massabepaling vereist is.
Voor native MS zijn instrumenten met een breed m/z-bereik en zachte ionenoverdracht vereist. De meest gebruikte platforms in de praktijk zijn:
De keuze hangt af van de complexgrootte, de vereiste massanauwkeurigheid en de beschikbaarheid van ion mobility. Voor de meeste biofarmaceutische toepassingen (mAb, ADC, bispecifiek antilichaam) zijn Q-TOF- en Orbitrap-EMR-platforms het meest gangbaar.
Voor native MS zijn naast het massaspectrometer-instrument de volgende hulpmiddelen noodzakelijk: geoptimaliseerde nanoESI-naalden of borosilicaat-capillairen voor het nanoESI-proces, spin-concentratoren voor diafiltration en bufferwisseling naar ammoniumacetaat, eiwitconcentratie-bepaling via UV/Vis-spectrofotometrie, en standaard vials en tips die MS-kwaliteit (laag-bindend, zonder plasticizers) hebben. Voor de structurele context van de gemeten eiwitten levert circulair dichroïsme (CD)-spectroscopie aanvullende informatie over de secundaire structuur in oplossing.
Neem contact op voor advies over de juiste verbruiksartikelen voor uw native MS-toepassing, of bekijk het assortiment voor verbruiksmateriaal voor eiwitanalyse.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
