Circulair dichroïsme (CD) is een spectroscopische techniek die gebruikmaakt van het verschil in absorptie van links en rechts circulair gepolariseerd licht door optisch actieve moleculen. In de levenswetenschappen en de biofarmaceutische industrie is CD uitgegroeid tot een onmisbare methode voor de karakterisering van de secundaire en tertiaire structuur van eiwitten, de bestudering van eiwitvouwing en -ontvouwing, en de conformationele analyse van nucleïnezuren en polysachariden. CD is niet-destructief, relatief snel en werkt in waterige oplossing onder fysiologische omstandigheden — omstandigheden die voor veel andere structuurbepalingstechnieken onbereikbaar zijn.
Dit artikel behandelt het fysische principe van circulair dichroïsme, de opbouw van een CD-spectrometer, de karakteristieke CD-spectra van de belangrijkste eiwitstructuurelementen, de praktische uitvoering van een meting, de kwantitatieve secundaire-structuuranalyse, de toepassingen in onderzoek en kwaliteitscontrole, en de vergelijking met complementaire methoden als DSC voor biomoleculen, NMR-spectroscopie en fluorescentie-spectroscopie.
Licht is een elektromagnetische golf waarbij het elektrische veld loodrecht op de voortplantingsrichting oscilleert. Bij gewoon licht oscilleert het veld in alle mogelijke vlakken. Bij vlak gepolariseerd licht oscilleert het veld in één vlak. Circulair gepolariseerd licht is een speciale vorm waarbij de vector van het elektrische veld een helix beschrijft langs de voortplantingsas. Afhankelijk van de draairichting onderscheidt men linkscirculair (L) en rechtscirculair (R) gepolariseerd licht.
Een optisch actief molecuul — dat wil zeggen een molecuul dat niet samenvalt met zijn spiegelbeeld — absorbeert links en rechts circulair gepolariseerd licht in verschillende mate. Dat verschil in absorptie is circulair dichroïsme:
ΔA = AL − AR
waarbij AL de absorptie van linkscirculair licht is en AR die van rechtscirculair licht. In de praktijk wordt het CD-signaal uitgedrukt als ellipticiteit θ in millidegraden (mdeg), of — voor vergelijking tussen monsters — als molaire ellipticiteit [θ] in deg·cm²·dmol⁻¹. De molaire ellipticiteit wordt berekend op basis van de molariteit van de chromofoor en de optische weglengte van de cel.
Eiwitten zijn chirale moleculen bij uitstek: de aminozuren waaruit zij zijn opgebouwd (behalve glycine) zijn vrijwel alle L-gevormd, en de ruimtelijke ordening van de polypeptideketen in alfa-helices, bèta-sheets en andere structuurelementen creëert bijkomende vormen van asymmetrie. Elk structuurelement heeft daardoor een kenmerkend CD-spectrum in het verre UV (circa 185–250 nm), waar de peptidebinding absorbeert.
Eiwitten bevatten meerdere klassen chromoforen die elk een eigen golflengtegebied beslaan:
Het verre UV-gebied (185–250 nm) is de meest informatieve regio voor structuuranalyse. Hier absorbeert de C=O-groep van de peptidebinding via twee elektronische overgangen: de n→π*-overgang (circa 220 nm) en de π→π*-overgang (circa 190–195 nm). De ruimtelijke rangschikking van aaneengesloten peptidebindingen — die per structuurelement uniek is — bepaalt hoe sterk en in welke richting het CD-signaal bij elk van deze overgangen is.
Een CD-spectrometer (ook CD-spectropolarimeter of dichrograaf genaamd) bestaat uit de volgende componenten:
De fotoelastische modulator is het hart van de CD-meting. De modulator wisselt met hoge frequentie (typisch 50 kHz) de polarisatietoestand van het invallende licht. De detector meet de resulterende intensiteitsvariaties; de lock-in-versterker isoleert het verschilsignaal dat correspondeert met ΔA = AL − AR. Dankzij dit synchrone detectieprincipe is de gevoeligheid extreem hoog: CD-signalen van 10⁻⁵ absorptie-eenheden zijn meetbaar, ook in aanwezigheid van een totale absorptie van 1 AU of meer.
Een moderne CD-spectrometer registreert gelijktijdig het CD-signaal (in mdeg) en de gewone UV-absorptie (in AU) als functie van de golflengte. De gelijktijdige absorptiemeting is diagnostisch: bij absorptiewaarden boven circa 1 AU neemt de ruis in het CD-signaal sterk toe. Dit stelt eisen aan de monsterconcentratie, de weglengte en de buffersamenstelling.
De kracht van CD-spectroscopie voor eiwitanalyse ligt in de typische patronen die de verschillende secundaire-structuurelementen vertonen:
Een alfa-helix heeft het meest kenmerkende CD-spectrum van alle secundaire structuurelementen. Het spectrum toont twee negatieve banden — één bij circa 222 nm (n→π*, kenmerkend voor de helix-conformatie) en één bij circa 208 nm (π→π*, het gesplitste exciton) — en een sterke positieve band bij circa 193 nm. De signaalsterkte bij 222 nm is de meest gebruikte maat voor het alfa-helixgehalte van een eiwit. Volledig alfa-helikale peptiden bereiken een molaire ellipticiteit van circa −35.000 deg·cm²·dmol⁻¹ bij 222 nm.
Een bèta-sheet (parallel of anti-parallel) geeft een negatieve band bij circa 218 nm en een positieve band bij circa 196 nm. Het signaal is in het algemeen minder intens dan dat van de alfa-helix. De exacte positie en intensiteit van de banden zijn afhankelijk van de twist van het sheet, de oriëntatie van de strengen en de aggregatietoestand. Anti-parallelle bèta-sheets geven doorgaans een iets scherper negatief signaal bij 218 nm dan parallelle sheets.
Polypeptiden zonder geordende secundaire structuur — random coil of intrinsiek ongeordende regio's — tonen een sterk negatief signaal bij circa 200 nm en een zwak positief signaal of geen signaal bij hogere golflengten. Prolinerijke segmenten vertonen een afwijkend patroon door de rigide imino-bindingen en de poly-proline-II-helix.
Bèta-turns en lussen geven zwakkere en minder goed gedefinieerde bijdragen aan het CD-spectrum. Hun bijdrage wordt in deconvolutieprogramma's als aparte component meegenomen, maar is in de praktijk moeilijker te kwantificeren dan die van helix en sheet.
Het ruwe CD-spectrum van een eiwit is de gewogen som van de bijdragen van alle secundaire-structuurelementen. Kwantitatieve analyse — het bepalen van het procentuele gehalte aan alfa-helix, bèta-sheet, turn en coil — wordt uitgevoerd via spectrale deconvolutie. De meest gebruikte methoden zijn:
Al deze methoden maken gebruik van een referentieset van eiwitten met bekende kristalstructuur (PDB-entries) en bijbehorend CD-spectrum. De nauwkeurigheid van de secundaire-structuurbepaling via CD is intrinsiek beperkt: CD meet een gemiddeld signaal van alle moleculen in oplossing en kan geen resolutie-informatie op aminozuurresiduniveau leveren. De methode is geschikt als kwantitatieve schatting of als relatief instrument voor conformatieverandering, niet als absolute structuurbepaling op atomair niveau.
Naast secundaire-structuuranalyse leveren de banden in het nabije UV (250–320 nm) kwalitatieve informatie over de tertiaire structuur: aanwezigheid van een gedefinieerd CD-signaal in dit gebied is een sterke aanwijzing dat de aromatische zijketens (tryptofaan, tyrosine, fenylalanine) in een asymmetrische, geordende omgeving zijn ingebed — een kenmerk van een goed gevouwen eiwit. Een eiwit dat wel correcte secundaire structuur vertoont maar geen nabij-UV CD-signaal heeft, is doorgaans niet goed gevouwen op tertiair niveau.
De cuvette (cel) is een kritieke parameter. Voor verre-UV-metingen (185–250 nm) zijn zeer korte optische weglengten vereist: 0,1 mm voor geconcentreerde monsters of buffers met hoog zoutgehalte, 0,5 mm als standaard, tot 1 mm voor verdunde monsters met lage achtergrondabsorptie. Voor nabij-UV-metingen (250–320 nm) wordt een weglengte van 5–10 mm gebruikt. Cuvetten zijn altijd van kwarts; borosilicaatglas absorbeert al sterk onder 310 nm en is volstrekt ongeschikt.
Een vuistregel is dat de totale absorptie van het monster (eiwit en buffer) in het gemeten golflengtegebied niet boven circa 1 AU mag komen, omdat daarboven de detectiegevoeligheid afneemt en ruis toeneemt. Voor een weglengte van 0,1 mm en een eiwitconcentratie tussen 0,5 en 2 mg/mL zijn de absorptieverhoudingen doorgaans gunstig. De eiwitconcentratie wordt nauwkeurig bepaald via UV/Vis-spectrofotometrie (absorptie bij 280 nm en de extinctiecoëfficiënt) of via een Bradford- of BCA-assay.
De bufferkeuze is essentieel: de meeste buffers absorberen sterk in het verre UV. Fosfaatbuffers zijn CD-compatibel tot circa 185 nm bij lage concentratie (5–10 mM). TRIS, HEPES, citroenzuur en hoge zoutconcentraties (NaCl boven 50 mM) geven aanzienlijke absorptieproblemen onder 200 nm en beperken het bruikbare golflengtevenster. Fluoride (NaF, 50–100 mM) is een uitstekend alternatief voor chloride als ionsterkte-regulerende zouttoeging in verre-UV-CD: het absorbeert niet in dit gebied.
Standaard CD-parameters voor een eiwitmeting zijn:
Het netto CD-spectrum van het eiwit wordt verkregen door het spectrum van de blinde (buffer in dezelfde cel) punt voor punt af te trekken van het monsterspectrum. Deze basislijnaftrek is geen optionele stap maar een absolute vereiste: de buffer, het kwartsvenster en het instrument hebben zelf bijdragen aan het CD-signaal die anders interfereren.
Een bijzonder waardevolle toepassing is de thermische denaturatie-meting: het CD-signaal bij een vaste golflengte (doorgaans 222 nm voor alfa-helix-gevolgde ontvouwing) wordt geregistreerd als functie van de temperatuur bij een verwarmingssnelheid van typisch 1°C/min. Het resulterende sigmoid geeft de smelttemperatuur Tm (de inflectietemperatuur), die een maat is voor de thermische stabiliteit van de tertiaire en secundaire structuur. Reversibiliteit kan worden gecontroleerd door het eiwit te laten afkoelen en een tweede opwarmrun uit te voeren. CD-temperatuurscans zijn aanvullend aan de calorimetrische data van DSC voor biomoleculen: CD volgt de structuurelementen specifiek, DSC maakt geen onderscheid naar structuurelement maar geeft absolute enthalpiewaarden.
Circulair dichroïsme is een directe manifestatie van chiraliteit op moleculair niveau. Elk molecuul dat niet samenvalt met zijn spiegelbeeld — een chiraal molecuul — bezit optische activiteit: het draait de polarisatietoestand van licht en absorbeert L en R circulair gepolariseerd licht in ongelijke mate. Het eerste verschijnsel (draaiing van het polarisatievlak) is optische rotatie; de golflengte-afhankelijke versie ervan is optische rotatiedispersie (ORD). Het tweede verschijnsel (ongelijke absorptie) is circulair dichroïsme.
Hoewel CD en ORD strikt genomen twee aspecten zijn van hetzelfde fenomeen (verbonden via de Kramers-Kronig-relaties), heeft CD zich in de praktijk als analytische methode doorgezet boven ORD. De reden: CD-banden zijn scherp en nulpunt-gebaseerd (het signaal loopt door nul buiten de absorptieband), terwijl ORD-banden breed zijn en in de staart van naburige banden overlappen. Dit maakt CD-spectra eenvoudiger te interpreteren, zeker bij multicomponent-mengsels zoals eiwitten die meerdere chromoforen bezitten.
In de organisch-chemische analytiek wordt CD ook gebruikt voor de bepaling van de absolute configuratie van kleine organische moleculen — waaronder farmaceutische werkzame stoffen — via vergelijking met berekende spectra of via excitatie-koppelings-analyse (exciton coupling CD). Hierbij is de verwantschap met chirale chromatografie zichtbaar: beide technieken dienen de stereo-analyse van chirale verbindingen, maar chirale HPLC scheidt enantiomeren en kwantificeert hun verhouding, terwijl CD de conformatietoestand in oplossing beschrijft.
De meest gebruikte toepassing van CD is de bevestiging dat een eiwit in de juiste conformatie verkeert na expressie, opzuivering of formulering. Een eiwitpreparaat dat de verwachte secundaire-structuursamenstelling vertoont — voldoende alfa-helixgehalte bij een overwegend helikaal eiwit, juiste bèta-sheet-verhouding bij een immunoglobuline — is waarschijnlijk correct gevouwen. Afwijkingen in het CD-spectrum zijn een vroegtijdig signaal voor aggregatie, gedeeltelijke ontvouwing of misfolding.
In de biofarmaceutische industrie wordt CD ingezet bij de karakterisering van monoklonale antilichamen, recombinante eiwitten en vaccin-antigenen als onderdeel van de hogere-orde-structuur (HOS)-karakterisering, conform ICH Q6B en de richtlijnen van EMA en FDA voor biosimilars. CD-temperatuurscans bij verschillende pH-waarden, ionische sterkte en hulpstofconcentraties geven direct inzicht in hoe formuleringsomstandigheden de conformationele stabiliteit beïnvloeden. Dit is complementair aan de calorimetrische data van DSC en de bindingsthermodynamica van isothermische titratiecalorimetrie (ITC).
CD is de meestgebruikte methode voor het volgen van eiwitvouwingskinetiek in stopped-flow-experimenten: binnen milliseconden na menging van gevouwen eiwit met denaturans of refouderingsomstandigheden wordt het CD-signaal geregistreerd als functie van de tijd. Op die manier worden vouwtijden en tussentoestanden (molten globule, pre-molten globule) zichtbaar die met andere methoden nauwelijks toegankelijk zijn.
Naast eiwitten worden ook DNA en RNA met CD geanalyseerd. Dubbelstrengs B-DNA heeft een karakteristiek CD-spectrum met een positieve band bij 275 nm en een negatieve band bij 245 nm. A-DNA, Z-DNA en G-quadruplexen hebben elk hun eigen kenmerkende CD-patroon. RNA-eiwitkoppelingen, G-quadruplex-ligandinteracties en aptameerstructuur zijn actuele onderzoeksgebieden waarin CD een centrale rol speelt.
De meest gestelde praktische vraag is: wat is de benodigde concentratie voor een CD-meting? Het antwoord is afhankelijk van de cellengte en het golflengtegebied. Als vuistregel voor verre-UV-CD geldt:
De nauwkeurige eiwitconcentratie moet vóór de CD-meting worden bepaald, want deze is nodig voor de berekening van de molaire ellipticiteit. Gebruik hiervoor UV/Vis-spectrofotometrie bij 280 nm met de berekende of experimenteel bepaalde extinctiecoëfficiënt.
CD is één van meerdere technieken die informatie geven over de structuur van eiwitten in oplossing. De keuze van de methode hangt af van het type informatie dat gewenst is, de beschikbare hoeveelheid eiwit, de uitrusting en het tijdsbestek.
Lineair dichroïsme (LD) is het verschil in absorptie van lineair gepolariseerd licht in twee loodrechte polarisatierichtingen, gewoonlijk parallel en loodrecht op een uitlijningsrichting. LD is geen eigenschap van vrij roterende moleculen in oplossing — daarvoor gemiddelen de oriëntaties uit — maar van moleculen die gericht zijn, bijvoorbeeld via vloeikristallen, gestretcht gels of hydrodynamische vloeiing. LD en CD zijn dan ook verwante maar fundamenteel verschillende technieken: LD geeft oriëntatie-informatie van lineaire overgangsmomenten, CD geeft informatie over chiraliteit en conformatie. Voor routinematige eiwitstructuuranalyse heeft LD een beperkte rol; CD is daarvoor de standaardmethode.
Optische rotatiedispersie (ORD) en circulair dichroïsme (CD) zijn twee manifesten van hetzelfde fenomeen — optische activiteit — maar zij meten verschillende aspecten. ORD meet de draaiing van het polarisatievlak van vlak gepolariseerd licht als functie van de golflengte; CD meet het verschil in absorptie van links en rechts circulair gepolariseerd licht. Beide signalen zijn via de Kramers-Kronig-integraalrelaties wiskundig met elkaar verbonden.
In de vroege structuurbiologie (1950–1970) was ORD de dominante techniek, mede omdat de instrumentatie eenvoudiger was. Vanaf circa 1970 heeft CD ORD nagenoeg geheel vervangen, om de volgende redenen:
Zowel FTIR als CD worden ingezet voor secundaire-structuuranalyse van eiwitten, maar via fundamenteel verschillende principes. FTIR meet de absorptie van infraroodlicht door moleculaire trillingen; de amide-I-band (circa 1650 cm⁻¹) is gevoelig voor de secundaire structuur. CD meet de differentiële absorptie van circulair gepolariseerd ultraviolet licht door de chirale elektronische overgangen van de peptidebinding. De twee methoden zijn complementair:
FTIR werkt ook in vaste stof, gel en geconcentreerde suspensies, zonder minimaal molecuulgewicht of chiraliteitsvereisten. Nadeel van FTIR voor eiwitten in water: de sterke absorptie van water (H₂O) bij 1640 cm⁻¹ overlapt direct met de amide-I-band; D₂O-buffers of subtractie-algoritmen zijn vereist. CD vereist optisch heldere waterige oplossingen en werkt uitstekend in D₂O of H₂O, maar is gevoelig voor absorptie van de buffer in het verre UV.
Een klassiek voorbeeld is het CD-spectrum van een sterk alfa-helikaal eiwit als myoglobine of calmoduline: het spectrum toont twee scherpe negatieve banden bij respectievelijk 208 en 222 nm en een sterke positieve band bij 193 nm. Verwarmt men het eiwit boven zijn smelttemperatuur, dan verdwijnen de helix-banden en resteert het kenmerkende negatieve signaal bij circa 200 nm van de ongeordende conformatie. Dit is een directe demonstratie van zowel de structuurgevoeligheid als de thermische denaturatie in één experiment.
Circulair dichroïsme bestaat omdat chirale moleculen twee zuivere enantiomere vormen van licht — links en rechts circulair gepolariseerd — niet even sterk absorberen. De fysische oorzaak is de ruimtelijke structuur van het molecuul: de elektronische overgangsdipolen en magnetische overgangsmomenten die betrokken zijn bij de lichtabsorptie zijn in chirale moleculen niet loodrecht op elkaar, waardoor een meetbare rotatory strength ontstaat. Bij eiwitten is de chiraliteit zowel lokaal (L-aminozuren) als niet-lokaal (periodieke structuurelementen als de helix die zelf een helicoïdale symmetriebreking bezitten).
Circulair dichroïsme treedt op bij alle optisch actieve materialen: aminozuren, peptiden en eiwitten, nucleïnezuren (DNA, RNA), polysachariden, chiraal synthetische polymeren, organische chirale kleine moleculen (farmaceutische werkzame stoffen), chiraal-fotonische kristallen en bepaalde anorganische verbindingen met helicoïdale structuur. Zelfs bepaalde metaalcomplexen (kobalt(III)- en ruthenium(II)-tris-polypyridylcomplexen) vertonen sterk CD door de helicoïdale symmetrie van het ligandenveld.
Stap 1: controleer de signaalkwaliteit. Boven 1 AU totale absorptie is het signaal onbetrouwbaar; het HT-voltage van de PMT stijgt dan boven circa 600 V. Stap 2: trek de bufferbijdrage af. Stap 3: bereken de molaire ellipticiteit [θ]. Stap 4: vergelijk de spectrumvorm met de referentiespectra van helix, sheet en coil. Een dubbele negatieve band bij 208 en 222 nm wijst op helix; een enkele negatieve band bij 218 nm op sheet; een sterk negatieve band bij 200 nm op coil. Stap 5: voer deconvolutie uit via CONTIN, SELCON of CDSSTR als kwantitatieve schatting gewenst is. Stap 6: beoordeel het nabij-UV-signaal (250–320 nm) als indicator voor geordende tertiaire structuur.
Zie de concentratietabel eerder in dit artikel. Als richtlijn: voor een standaard 0,5 mm cel met fosfaatbuffer (pH 7,0, 10 mM NaPi) en 50 mM NaF is een eiwitconcentratie van 0,3–0,7 mg/mL gebruikelijk. Bij hoog zoutgehalte (≥150 mM NaCl) is een 0,1 mm cel met 1–2 mg/mL de betere keuze. Meting bij te lage concentratie geeft een te zwak signaal; bij te hoge concentratie verslechtert de signaalkwaliteit door overabsorptie.
Chiraal halide-perovskieten zijn halfgeleiderverbindingen met de perovskietstructuur waarbij een chiraal organisch ammoniumion is ingebouwd. De chirale inductie vanuit het organische kation op de anorganische perovskietstructuur leidt tot een meetbaar circulair dichroïsme-signaal en in sommige configuraties tot spin-selectief elektronentransport (chiraliteitsinduceerde spinpolarisatie, CISS). Chirale perovskieten zijn een actief onderzoeksgebied voor toepassingen in spintronica, chirale optica en fotovoltaïca, maar hebben geen rol in routinematig laboratoriumwerk voor eiwitanalyse.
Voor CD-spectroscopie zijn de volgende instrumenten en verbruiksartikelen van belang:
CD-spectrometers zijn gespecialiseerde instrumenten die u aantreft in academische kerninstrumentatiefaciliteiten, biofarmaceutische researchlaboratoria en contract-researchorganisaties. Verbruiksartikelen als kwartscuvetten en filters zijn via Labvakhandel.nl te bestellen. Neem contact op voor advies over de juiste cuvettekeuze voor uw toepassing.
Zie voor aanvullende methoden voor eiwitstructuuranalyse: DSC voor biomoleculen: eiwitontvouwing en Tm-bepaling voor de thermodynamische karakterisering van eiwitstabiliteit; isothermische titratiecalorimetrie (ITC) voor bindingsthermodynamica; grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC) voor aggregaatanalyse; fluorescentie-spectroscopie voor tertiaire structuur via tryptofaanfluorescentie; NMR-spectroscopie voor atomaire resolutie in oplossing; FTIR-spectroscopie voor secundaire structuur via de amide-I-band; massaspectrometrie voor intacte massa en post-translationele modificaties; proteomics en 2D-PAGE voor grootschalige eiwitanalyse; en western blot voor immunologische eiwitdetectie. Voor informatie over de chiraliteitsanalyse van kleine moleculen, zie chirale chromatografie.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting op circulair dichroïsme-spectroscopie. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties. Raadpleeg de handleiding van uw instrument, de geldende normen (ICH Q6B, Ph. Eur. 5.12.02) en de vakliteratuur voor protocollen die kritisch zijn voor de kwaliteitsborging van uw analyses.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
