Circulair dichroïsme (CD) is een spectroscopische techniek die gebruikmaakt van het verschil in absorptie van links en rechts circulair gepolariseerd licht door optisch actieve moleculen. In de levenswetenschappen en de biofarmaceutische industrie is CD uitgegroeid tot een onmisbare methode voor de karakterisering van de secundaire en tertiaire structuur van eiwitten, de bestudering van eiwitvouwing en -ontvouwing, en de conformationele analyse van nucleïnezuren en polysachariden. CD is niet-destructief, relatief snel en werkt in waterige oplossing onder fysiologische omstandigheden — omstandigheden die voor veel andere structuurbepalingstechnieken onbereikbaar zijn. Een CD-meting vereist een gezuiverd, monodispers eiwitpreparaat — zie het artikel over eiwitzuivering voor de opzet van een geschikt zuiveringsprotocol.
Dit artikel behandelt het fysische principe van circulair dichroïsme, de opbouw van een CD-spectrometer, de karakteristieke CD-spectra van de belangrijkste eiwitstructuurelementen, de praktische uitvoering van een meting, de kwantitatieve secundaire-structuuranalyse, de toepassingen in onderzoek en kwaliteitscontrole, en de vergelijking met complementaire methoden als DSC voor biomoleculen, NMR-spectroscopie en fluorescentie-spectroscopie.
Licht is een elektromagnetische golf waarbij het elektrische veld loodrecht op de voortplantingsrichting oscilleert. Bij gewoon licht oscilleert het veld in alle mogelijke vlakken. Bij vlak gepolariseerd licht oscilleert het veld in één vlak. Circulair gepolariseerd licht is een speciale vorm waarbij de vector van het elektrische veld een helix beschrijft langs de voortplantingsas. Afhankelijk van de draairichting onderscheidt men linkscirculair (L) en rechtscirculair (R) gepolariseerd licht.
Een optisch actief molecuul — dat wil zeggen een molecuul dat niet samenvalt met zijn spiegelbeeld — absorbeert links en rechts circulair gepolariseerd licht in verschillende mate. Dat verschil in absorptie is circulair dichroïsme:
ΔA = AL − AR
waarbij AL de absorptie van linkscirculair licht is en AR die van rechtscirculair licht. In de praktijk wordt het CD-signaal uitgedrukt als ellipticiteit θ in millidegraden (mdeg), of — voor vergelijking tussen monsters — als molaire ellipticiteit [θ] in deg·cm²·dmol⁻¹. De molaire ellipticiteit wordt berekend op basis van de molariteit van de chromofoor en de optische weglengte van de cel.
De wet van Beer-Lambert geldt voor elk van de twee circulaire polarisatiecomponenten afzonderlijk: AL = εL · c · l en AR = εR · c · l, waarbij ε de (decimale) extinctiecoëfficiënt is, c de concentratie in mol/L en l de optische weglengte in cm. Het CD-signaal volgt daar rechtstreeks uit:
ΔA = (εL − εR) · c · l = Δε · c · l
De grootheid Δε is de differentiële extinctiecoëfficiënt (in L·mol⁻¹·cm⁻¹) en is de moleculaire eigenschap die onafhankelijk is van concentratie en weglengte. Via de omrekeningsfactor θ (mdeg) = 32.982 · ΔA is het gemeten ellipticiteitssignaal direct te vertalen naar Δε. Omdat Beer-Lambert lineair is in de concentratie, verdubbelt het CD-signaal bij verdubbeling van de eiwitconcentratie bij gelijkblijvende weglengte — zolang de totale absorptie beneden circa 1 AU blijft. Boven die grens treedt systematische afwijking op door detectieverzadiging.
Eiwitten zijn chirale moleculen bij uitstek: de aminozuren waaruit zij zijn opgebouwd (behalve glycine) zijn vrijwel alle L-gevormd, en de ruimtelijke ordening van de polypeptideketen in alfa-helices, bèta-sheets en andere structuurelementen creëert bijkomende vormen van asymmetrie. Elk structuurelement heeft daardoor een kenmerkend CD-spectrum in het verre UV (circa 185–250 nm), waar de peptidebinding absorbeert.
Eiwitten bevatten meerdere klassen chromoforen die elk een eigen golflengtegebied beslaan:
Het verre UV-gebied (185–250 nm) is de meest informatieve regio voor structuuranalyse. Hier absorbeert de C=O-groep van de peptidebinding via twee elektronische overgangen: de n→π*-overgang (circa 220 nm) en de π→π*-overgang (circa 190–195 nm). De ruimtelijke rangschikking van aaneengesloten peptidebindingen — die per structuurelement uniek is — bepaalt hoe sterk en in welke richting het CD-signaal bij elk van deze overgangen is. CD gemeten via deze elektronische overgangen wordt in de wetenschappelijke literatuur ook wel elektronisch circulair dichroïsme (ECD) genoemd, ter onderscheid van vibrationeel circulair dichroïsme (VCD), dat de chirale absorptie van infraroodlicht door moleculaire trillingen meet. In de context van eiwitstructuuranalyse is ECD synoniem aan conventionele CD-spectroscopie.
Een CD-spectrometer (ook CD-spectropolarimeter of dichrograaf genaamd) bestaat uit de volgende componenten:
De fotoelastische modulator is het hart van de CD-meting. De modulator wisselt met hoge frequentie (typisch 50 kHz) de polarisatietoestand van het invallende licht. De detector meet de resulterende intensiteitsvariaties; de lock-in-versterker isoleert het verschilsignaal dat correspondeert met ΔA = AL − AR. Dankzij dit synchrone detectieprincipe is de gevoeligheid extreem hoog: CD-signalen van 10⁻⁵ absorptie-eenheden zijn meetbaar, ook in aanwezigheid van een totale absorptie van 1 AU of meer.
Een moderne CD-spectrometer registreert gelijktijdig het CD-signaal (in mdeg) en de gewone UV-absorptie (in AU) als functie van de golflengte. De gelijktijdige absorptiemeting is diagnostisch: bij absorptiewaarden boven circa 1 AU neemt de ruis in het CD-signaal sterk toe. Dit stelt eisen aan de monsterconcentratie, de weglengte en de buffersamenstelling.
De kracht van CD-spectroscopie voor eiwitanalyse ligt in de typische patronen die de verschillende secundaire-structuurelementen vertonen:
Een alfa-helix heeft het meest kenmerkende CD-spectrum van alle secundaire structuurelementen. Het spectrum toont twee negatieve banden — één bij circa 222 nm (n→π*, kenmerkend voor de helix-conformatie) en één bij circa 208 nm (π→π*, het gesplitste exciton) — en een sterke positieve band bij circa 193 nm. De signaalsterkte bij 222 nm is de meest gebruikte maat voor het alfa-helixgehalte van een eiwit. Volledig alfa-helikale peptiden bereiken een molaire ellipticiteit van circa −35.000 deg·cm²·dmol⁻¹ bij 222 nm.
Een bèta-sheet (parallel of anti-parallel) geeft een negatieve band bij circa 218 nm en een positieve band bij circa 196 nm. Het signaal is in het algemeen minder intens dan dat van de alfa-helix. De exacte positie en intensiteit van de banden zijn afhankelijk van de twist van het sheet, de oriëntatie van de strengen en de aggregatietoestand. Anti-parallelle bèta-sheets geven doorgaans een iets scherper negatief signaal bij 218 nm dan parallelle sheets.
Polypeptiden zonder geordende secundaire structuur — random coil of intrinsiek ongeordende regio's — tonen een sterk negatief signaal bij circa 200 nm en een zwak positief signaal of geen signaal bij hogere golflengten. Prolinerijke segmenten vertonen een afwijkend patroon door de rigide imino-bindingen en de poly-proline-II-helix.
Bèta-turns en lussen geven zwakkere en minder goed gedefinieerde bijdragen aan het CD-spectrum. Hun bijdrage wordt in deconvolutieprogramma's als aparte component meegenomen, maar is in de praktijk moeilijker te kwantificeren dan die van helix en sheet.
Het ruwe CD-spectrum van een eiwit is de gewogen som van de bijdragen van alle secundaire-structuurelementen. Kwantitatieve analyse — het bepalen van het procentuele gehalte aan alfa-helix, bèta-sheet, turn en coil — wordt uitgevoerd via spectrale deconvolutie. De meest gebruikte methoden zijn:
Al deze methoden maken gebruik van een referentieset van eiwitten met bekende kristalstructuur (PDB-entries) en bijbehorend CD-spectrum. De nauwkeurigheid van de secundaire-structuurbepaling via CD is intrinsiek beperkt: CD meet een gemiddeld signaal van alle moleculen in oplossing en kan geen resolutie-informatie op aminozuurresiduniveau leveren. De methode is geschikt als kwantitatieve schatting of als relatief instrument voor conformatieverandering, niet als absolute structuurbepaling op atomair niveau.
Naast secundaire-structuuranalyse leveren de banden in het nabije UV (250–320 nm) kwalitatieve informatie over de tertiaire structuur: aanwezigheid van een gedefinieerd CD-signaal in dit gebied is een sterke aanwijzing dat de aromatische zijketens (tryptofaan, tyrosine, fenylalanine) in een asymmetrische, geordende omgeving zijn ingebed — een kenmerk van een goed gevouwen eiwit. Een eiwit dat wel correcte secundaire structuur vertoont maar geen nabij-UV CD-signaal heeft, is doorgaans niet goed gevouwen op tertiair niveau.
De cuvette (cel) is een kritieke parameter. Voor verre-UV-metingen (185–250 nm) zijn zeer korte optische weglengten vereist: 0,1 mm voor geconcentreerde monsters of buffers met hoog zoutgehalte, 0,5 mm als standaard, tot 1 mm voor verdunde monsters met lage achtergrondabsorptie. Voor nabij-UV-metingen (250–320 nm) wordt een weglengte van 5–10 mm gebruikt. Cuvetten zijn altijd van kwarts; borosilicaatglas absorbeert al sterk onder 310 nm en is volstrekt ongeschikt.
Een vuistregel is dat de totale absorptie van het monster (eiwit en buffer) in het gemeten golflengtegebied niet boven circa 1 AU mag komen, omdat daarboven de detectiegevoeligheid afneemt en ruis toeneemt. Voor een weglengte van 0,1 mm en een eiwitconcentratie tussen 0,5 en 2 mg/mL zijn de absorptieverhoudingen doorgaans gunstig. De eiwitconcentratie wordt nauwkeurig bepaald via UV/Vis-spectrofotometrie (absorptie bij 280 nm en de extinctiecoëfficiënt) of via een Bradford- of BCA-assay.
De bufferkeuze is essentieel: de meeste buffers absorberen sterk in het verre UV. Fosfaatbuffers zijn CD-compatibel tot circa 185 nm bij lage concentratie (5–10 mM). TRIS, HEPES, citroenzuur en hoge zoutconcentraties (NaCl boven 50 mM) geven aanzienlijke absorptieproblemen onder 200 nm en beperken het bruikbare golflengtevenster. Fluoride (NaF, 50–100 mM) is een uitstekend alternatief voor chloride als ionsterkte-regulerende zouttoeging in verre-UV-CD: het absorbeert niet in dit gebied.
Standaard CD-parameters voor een eiwitmeting zijn:
Het netto CD-spectrum van het eiwit wordt verkregen door het spectrum van de blinde (buffer in dezelfde cel) punt voor punt af te trekken van het monsterspectrum. Deze basislijnaftrek is geen optionele stap maar een absolute vereiste: de buffer, het kwartsvenster en het instrument hebben zelf bijdragen aan het CD-signaal die anders interfereren.
Een bijzonder waardevolle toepassing is de thermische denaturatie-meting: het CD-signaal bij een vaste golflengte (doorgaans 222 nm voor alfa-helix-gevolgde ontvouwing) wordt geregistreerd als functie van de temperatuur bij een verwarmingssnelheid van typisch 1°C/min. Het resulterende sigmoid geeft de smelttemperatuur Tm (de inflectietemperatuur), die een maat is voor de thermische stabiliteit van de tertiaire en secundaire structuur. Reversibiliteit kan worden gecontroleerd door het eiwit te laten afkoelen en een tweede opwarmrun uit te voeren. CD-temperatuurscans zijn aanvullend aan de calorimetrische data van DSC voor biomoleculen: CD volgt de structuurelementen specifiek, DSC maakt geen onderscheid naar structuurelement maar geeft absolute enthalpiewaarden.
Circulair dichroïsme is een directe manifestatie van chiraliteit op moleculair niveau. Elk molecuul dat niet samenvalt met zijn spiegelbeeld — een chiraal molecuul — bezit optische activiteit: het draait de polarisatietoestand van licht en absorbeert L en R circulair gepolariseerd licht in ongelijke mate. Het eerste verschijnsel (draaiing van het polarisatievlak) is optische rotatie; de golflengte-afhankelijke versie ervan is optische rotatiedispersie (ORD). Het tweede verschijnsel (ongelijke absorptie) is circulair dichroïsme.
Hoewel CD en ORD strikt genomen twee aspecten zijn van hetzelfde fenomeen (verbonden via de Kramers-Kronig-relaties), heeft CD zich in de praktijk als analytische methode doorgezet boven ORD. De reden: CD-banden zijn scherp en nulpunt-gebaseerd (het signaal loopt door nul buiten de absorptieband), terwijl ORD-banden breed zijn en in de staart van naburige banden overlappen. Dit maakt CD-spectra eenvoudiger te interpreteren, zeker bij multicomponent-mengsels zoals eiwitten die meerdere chromoforen bezitten.
In de organisch-chemische analytiek wordt CD ook gebruikt voor de bepaling van de absolute configuratie van kleine organische moleculen — waaronder farmaceutische werkzame stoffen — via vergelijking met berekende spectra of via excitatie-koppelings-analyse (exciton coupling CD). Hierbij is de verwantschap met chirale chromatografie zichtbaar: beide technieken dienen de stereo-analyse van chirale verbindingen, maar chirale HPLC scheidt enantiomeren en kwantificeert hun verhouding, terwijl CD de conformatietoestand in oplossing beschrijft.
De meest gebruikte toepassing van CD is de bevestiging dat een eiwit in de juiste conformatie verkeert na expressie, opzuivering of formulering. Een eiwitpreparaat dat de verwachte secundaire-structuursamenstelling vertoont — voldoende alfa-helixgehalte bij een overwegend helikaal eiwit, juiste bèta-sheet-verhouding bij een immunoglobuline — is waarschijnlijk correct gevouwen. Afwijkingen in het CD-spectrum zijn een vroegtijdig signaal voor aggregatie, gedeeltelijke ontvouwing of misfolding.
In de biofarmaceutische industrie wordt CD ingezet bij de karakterisering van monoklonale antilichamen, recombinante eiwitten en vaccin-antigenen als onderdeel van de hogere-orde-structuur (HOS)-karakterisering, conform ICH Q6B en de richtlijnen van EMA en FDA voor biosimilars. CD-temperatuurscans bij verschillende pH-waarden, ionische sterkte en hulpstofconcentraties geven direct inzicht in hoe formuleringsomstandigheden de conformationele stabiliteit beïnvloeden. Dit is complementair aan de calorimetrische data van DSC en de bindingsthermodynamica van isothermische titratiecalorimetrie (ITC).
CD is de meestgebruikte methode voor het volgen van eiwitvouwingskinetiek in stopped-flow-experimenten. Bij een stopped-flow CD-opstelling wordt de eiwitoplossing in milliseconden gemengd met een denaturans of refouderingsoplossing, waarna het CD-signaal als functie van de tijd wordt geregistreerd. Op die manier worden vouwtijden en tussentoestanden (molten globule, pre-molten globule) zichtbaar die met andere methoden nauwelijks toegankelijk zijn. Stopped-flow CD maakt gebruik van dezelfde optische detectie als conventionele CD, maar met een mengcel met dode tijd van typisch 1–5 ms. De techniek is bij uitstek geschikt voor het karakteriseren van vroege vouwingtussentoestanden en voor de kinetische analyse van denaturatie door chemische middelen zoals ureum of guanidinehydrochloride.
Naast eiwitten worden ook DNA en RNA met CD geanalyseerd. Dubbelstrengs B-DNA heeft een karakteristiek CD-spectrum met een positieve band bij 275 nm en een negatieve band bij 245 nm. A-DNA, Z-DNA en G-quadruplexen hebben elk hun eigen kenmerkende CD-patroon. RNA-eiwitkoppelingen, G-quadruplex-ligandinteracties en aptameerstructuur zijn actuele onderzoeksgebieden waarin CD een centrale rol speelt.
De meest gestelde praktische vraag is: wat is de benodigde concentratie voor een CD-meting? Het antwoord is afhankelijk van de cellengte en het golflengtegebied. Als vuistregel voor verre-UV-CD geldt:
De nauwkeurige eiwitconcentratie moet vóór de CD-meting worden bepaald, want deze is nodig voor de berekening van de molaire ellipticiteit. Gebruik hiervoor UV/Vis-spectrofotometrie bij 280 nm met de berekende of experimenteel bepaalde extinctiecoëfficiënt.
CD is één van meerdere technieken die informatie geven over de structuur van eiwitten in oplossing. De keuze van de methode hangt af van het type informatie dat gewenst is, de beschikbare hoeveelheid eiwit, de uitrusting en het tijdsbestek.
Lineair dichroïsme (LD) is het verschil in absorptie van lineair gepolariseerd licht in twee loodrechte polarisatierichtingen, gewoonlijk parallel en loodrecht op een uitlijningsrichting. LD is geen eigenschap van vrij roterende moleculen in oplossing — daarvoor gemiddelen de oriëntaties uit — maar van moleculen die gericht zijn, bijvoorbeeld via vloeikristallen, gestretcht gels of hydrodynamische vloeiing. LD en CD zijn dan ook verwante maar fundamenteel verschillende technieken: LD geeft oriëntatie-informatie van lineaire overgangsmomenten, CD geeft informatie over chiraliteit en conformatie. Voor routinematige eiwitstructuuranalyse heeft LD een beperkte rol; CD is daarvoor de standaardmethode.
Het Cotton-effect is het gecombineerde optische verschijnsel dat optreedt wanneer circulair gepolariseerd licht door een chirale chromofoor wordt geabsorbeerd: in het golflengtegebied van de absorptieband vertoont het CD-spectrum een karakteristiek piek-nuldoorgang-dal-patroon (of omgekeerd), terwijl het bijbehorende ORD-spectrum een sigmoidale S-curve laat zien. Beide signalen zijn de twee gezichten van hetzelfde fenomeen — de chiroptische respons — en zijn via de Kramers-Kronig-relaties met elkaar verbonden. Een positief Cotton-effect betekent dat de CD-band een positieve piek vertoont (AL > AR); een negatief Cotton-effect geeft een negatieve CD-band (AR > AL). De term is vernoemd naar de Franse fysicus Aimé Cotton, die het verschijnsel in 1895 als eerste systematisch beschreef voor koperoplossingen van wijnsteenzuur.
In CD-spectra van eiwitten zijn de kenmerkende banden bij 208, 218 en 222 nm direct manifestaties van Cotton-effecten van de respectieve secundaire-structuurconformaties. De richting (positief of negatief) en sterkte van elk Cotton-effect zijn direct gerelateerd aan de rotatory strength van de betreffende elektronische overgang in die specifieke ruimtelijke omgeving.
De ontdekking van optische activiteit en circulair dichroïsme verliep in etappes over de negentiende eeuw. Jean-Baptiste Biot constateerde in 1812 als eerste dat vlak gepolariseerd licht door bepaalde optisch actieve vloeistoffen en vaste stoffen wordt gedraaid — de basis van wat later optische rotatie zou heten. Wilhelm Karl Haidinger beschreef in 1845 voor het eerst het verschijnsel van ongelijke absorptie van de twee circulaire polarisatiecomponenten — de directe definitie van circulair dichroïsme. De doorbraak in de fysische interpretatie en praktische beschrijving van het gecombineerde CD/ORD-fenomeen kwam van Aimé Cotton (1895), wiens naam de term Cotton-effect draagt.
De toepassing van CD als instrumentele analytische techniek voor eiwitstructuuronderzoek begon in de jaren vijftig en zestig van de twintigste eeuw, toen Jerald Brahms, William Moffitt en anderen de karakteristieke CD-spectra van polypeptide-secundaire structuur empirisch vastlegden. Commerciële CD-spectropolarimeters kwamen beschikbaar vanaf de jaren zestig; de introductie van de fotoelastische modulator in de jaren zeventig maakte de gevoelige, snelle CD-instrumenten mogelijk die nu standaard zijn. Het verre-UV-golflengtegebied (beneden 200 nm) werd pas toegankelijk toen stikstofspoeling van de optische bank gemeengoed werd, waarmee zuurstofabsorptie in het diep-UV werd geëlimineerd.
Dichroïsme is de overkoepelende term voor het verschijnsel dat een materiaal licht met verschillende polarisatietoestanden in verschillende mate absorbeert. De voornaamste vormen die in spectroscopisch en analytisch onderzoek worden onderscheiden zijn:
Voor routinematige eiwitstructuuranalyse is ECD (conventionele CD) de meest gebruikte variant. VCD en MCD vereisen gespecialiseerde instrumentatie en worden ingezet voor specifieke analytische vragen buiten het standaard eiwitonderzoek.
Optische rotatiedispersie (ORD) en circulair dichroïsme (CD) zijn twee manifesten van hetzelfde fenomeen — optische activiteit — maar zij meten verschillende aspecten. ORD meet de draaiing van het polarisatievlak van vlak gepolariseerd licht als functie van de golflengte; CD meet het verschil in absorptie van links en rechts circulair gepolariseerd licht. Beide signalen zijn via de Kramers-Kronig-integraalrelaties wiskundig met elkaar verbonden.
In de vroege structuurbiologie (1950–1970) was ORD de dominante techniek, mede omdat de instrumentatie eenvoudiger was. Vanaf circa 1970 heeft CD ORD nagenoeg geheel vervangen, om de volgende redenen:
Zowel FTIR als CD worden ingezet voor secundaire-structuuranalyse van eiwitten, maar via fundamenteel verschillende principes. FTIR meet de absorptie van infraroodlicht door moleculaire trillingen; de amide-I-band (circa 1650 cm⁻¹) is gevoelig voor de secundaire structuur. CD meet de differentiële absorptie van circulair gepolariseerd ultraviolet licht door de chirale elektronische overgangen van de peptidebinding. De twee methoden zijn complementair:
FTIR werkt ook in vaste stof, gel en geconcentreerde suspensies, zonder minimaal molecuulgewicht of chiraliteitsvereisten. Nadeel van FTIR voor eiwitten in water: de sterke absorptie van water (H₂O) bij 1640 cm⁻¹ overlapt direct met de amide-I-band; D₂O-buffers of subtractie-algoritmen zijn vereist. CD vereist optisch heldere waterige oplossingen en werkt uitstekend in D₂O of H₂O, maar is gevoelig voor absorptie van de buffer in het verre UV.
CD en fluorescentie-spectroscopie geven elk complementaire informatie over de eiwitvouwing, maar zij richten zich op verschillende structuuraspecten. CD in het verre UV (185–250 nm) rapporteert over de gemiddelde secundaire structuur van alle peptidebindingen in het molecuul: de aan- of afwezigheid van helix, sheet en ongeordende segmenten. Fluorescentie-spectroscopie meet de emissie van aromatische zijketens — in de meeste gevallen tryptofaan (Trp) — en is daarmee gevoelig voor de lokale omgeving van één of enkele specifieke residuen. Een blauwe verschuiving van de Trp-emissie (van circa 350 nm naar 320 nm) duidt op inbedding van het tryptofaan in een hydrofobe kern; een rode verschuiving duidt op blootstelling aan oplosmiddel.
In de praktijk vullen CD en fluorescentie elkaar goed aan bij ontvouwingsstudies: CD volgt de geleidelijke afbraak van de secundaire structuur over een breed concentratiebereik van denaturans, terwijl fluorescentie gevoeliger is voor vroege veranderingen in de tertiaire omgeving van Trp-residuen. Een eiwit kan zijn tertiaire organisatie (zichtbaar als fluorescentieverschuiving) verliezen terwijl de secundaire structuur (zichtbaar via CD bij 222 nm) nog grotendeels intact is. Dit onderscheid is diagnostisch voor de aanwezigheid van een molten-globule-toestand.
Ja, CD is bijzonder geschikt voor de karakterisering van intrinsiek ongeordende eiwitten (IDP's, van het Engels intrinsically disordered proteins) en intrinsiek ongeordende regio's (IDR's). Een volledig ongeordend polypeptide zonder vaste secundaire structuur vertoont een kenmerkend CD-patroon: een sterk negatief signaal bij circa 200 nm en een zwak positief of vrijwel afwezig signaal bij 222 nm. Dit patroon is eenvoudig te onderscheiden van dat van alfa-helikale of bèta-rijke eiwitten.
CD is ook gevoelig voor de vorming van aggregaten. Grotere eiwitaggregaten verstrooien licht (optisch artefact) en kunnen het CD-signaal schijnbaar verzwakken of vervormen. Filtering van het monster door een 0,2 μm membraan vóór de meting is daarom essentieel. Als het CD-signaal na filtering sterk afwijkt van het verwachte patroon voor het monomere eiwit — bijvoorbeeld een vlak of verstoord spectrum met verhoogde ruis — kan dit een aanwijzing zijn voor resterende geaggregeerde fracties of voor structurele veranderingen die samenhangen met aggregatieprocessen. In die gevallen is combinatie met grootte-exclusiechromatografie (SEC) aangewezen om de aggregatietoestand kwantitatief te bepalen.
Een klassiek voorbeeld is het CD-spectrum van een sterk alfa-helikaal eiwit als myoglobine of calmoduline: het spectrum toont twee scherpe negatieve banden bij respectievelijk 208 en 222 nm en een sterke positieve band bij 193 nm. Verwarmt men het eiwit boven zijn smelttemperatuur, dan verdwijnen de helix-banden en resteert het kenmerkende negatieve signaal bij circa 200 nm van de ongeordende conformatie. Dit is een directe demonstratie van zowel de structuurgevoeligheid als de thermische denaturatie in één experiment.
Circulair dichroïsme bestaat omdat chirale moleculen twee zuivere enantiomere vormen van licht — links en rechts circulair gepolariseerd — niet even sterk absorberen. De fysische oorzaak is de ruimtelijke structuur van het molecuul: de elektronische overgangsdipolen en magnetische overgangsmomenten die betrokken zijn bij de lichtabsorptie zijn in chirale moleculen niet loodrecht op elkaar, waardoor een meetbare rotatory strength ontstaat. Bij eiwitten is de chiraliteit zowel lokaal (L-aminozuren) als niet-lokaal (periodieke structuurelementen als de helix die zelf een helicoïdale symmetriebreking bezitten).
Circulair dichroïsme treedt op bij alle optisch actieve materialen: aminozuren, peptiden en eiwitten, nucleïnezuren (DNA, RNA), polysachariden, chiraal synthetische polymeren, organische chirale kleine moleculen (farmaceutische werkzame stoffen), chiraal-fotonische kristallen en bepaalde anorganische verbindingen met helicoïdale structuur. Zelfs bepaalde metaalcomplexen (kobalt(III)- en ruthenium(II)-tris-polypyridylcomplexen) vertonen sterk CD door de helicoïdale symmetrie van het ligandenveld.
Molaire ellipticiteit [θ] is de genormaliseerde vorm van het CD-signaal, gecorrigeerd voor eiwitconcentratie en optische weglengte, zodat CD-spectra van verschillende monsters onderling vergelijkbaar zijn. De berekening is:
[θ] = (θ × M) / (10 × c × l)
waarbij θ het gemeten signaal is in millidegraden, M het molecuulgewicht van de chromofoor (voor eiwitten: het gemiddeld molecuulgewicht per aminozuurresidu, circa 110 g/mol), c de eiwitconcentratie in g/mL en l de optische weglengte in cm. De eenheid van [θ] is deg·cm²·dmol⁻¹. Bij eiwitten wordt molaire ellipticiteit per aminozuurresidu (mean residue ellipticity, MRE) het meest gebruikt, zodat spectra van eiwitten met verschillende ketenlengte direct vergelijkbaar zijn. Een nauwkeurig bepaalde eiwitconcentratie is een absolute voorwaarde voor een betrouwbare MRE-berekening.
Stap 1: controleer de signaalkwaliteit. Boven 1 AU totale absorptie is het signaal onbetrouwbaar; het HT-voltage van de PMT stijgt dan boven circa 600 V. Stap 2: trek de bufferbijdrage af. Stap 3: bereken de molaire ellipticiteit [θ]. Stap 4: vergelijk de spectrumvorm met de referentiespectra van helix, sheet en coil. Een dubbele negatieve band bij 208 en 222 nm wijst op helix; een enkele negatieve band bij 218 nm op sheet; een sterk negatieve band bij 200 nm op coil. Stap 5: voer deconvolutie uit via CONTIN, SELCON of CDSSTR als kwantitatieve schatting gewenst is. Stap 6: beoordeel het nabij-UV-signaal (250–320 nm) als indicator voor geordende tertiaire structuur.
Zie de concentratietabel eerder in dit artikel. Als richtlijn: voor een standaard 0,5 mm cel met fosfaatbuffer (pH 7,0, 10 mM NaPi) en 50 mM NaF is een eiwitconcentratie van 0,3–0,7 mg/mL gebruikelijk. Bij hoog zoutgehalte (≥150 mM NaCl) is een 0,1 mm cel met 1–2 mg/mL de betere keuze. Meting bij te lage concentratie geeft een te zwak signaal; bij te hoge concentratie verslechtert de signaalkwaliteit door overabsorptie.
Een CD-spectrometer wordt gekalibreerd met een gecertificeerde oplossing van 10-camfersulfozuur (CSA, ook camfersulfonzuur) in watervrij ethanol of water. CSA heeft bekende CD-banden bij 290,5 nm (positief) en 192,5 nm (negatief), met een nauwkeurig bepaalde molaire ellipticiteit bij 290,5 nm van +2,36 × 10³ deg·cm²·dmol⁻¹ (voor een 0,1% oplossing in een 1 cm cel onder standaardcondities). De kalibratie verifieert tegelijk de golflengteschaal (beide banden moeten op de nominale positie liggen) en de ellipticiteitschaal (de signaalsterkte bij 290,5 nm moet overeenkomen met de gecertificeerde waarde). Kalibratie wordt aanbevolen bij ingebruikname van het instrument, na lamp- of detectorvervanging en periodiek als onderdeel van de instrumentkwalificatie. Gebruik uitsluitend kristallijne CSA met een gecertificeerde zuiverheid; hygroscopische monsters geven afwijkende waarden.
Chiraal halide-perovskieten zijn halfgeleiderverbindingen met de perovskietstructuur waarbij een chiraal organisch ammoniumion is ingebouwd. De chirale inductie vanuit het organische kation op de anorganische perovskietstructuur leidt tot een meetbaar circulair dichroïsme-signaal en in sommige configuraties tot spin-selectief elektronentransport (chiraliteitsinduceerde spinpolarisatie, CISS). Chirale perovskieten zijn een actief onderzoeksgebied voor toepassingen in spintronica, chirale optica en fotovoltaïca, maar hebben geen rol in routinematig laboratoriumwerk voor eiwitanalyse.
Voor CD-spectroscopie zijn de volgende instrumenten en verbruiksartikelen van belang:
CD-spectrometers zijn gespecialiseerde instrumenten die u aantreft in academische kerninstrumentatiefaciliteiten, biofarmaceutische researchlaboratoria en contract-researchorganisaties. Verbruiksartikelen als kwartscuvetten en filters zijn via Labvakhandel.nl te bestellen. Neem contact op voor advies over de juiste cuvettekeuze voor uw toepassing.
Zie voor aanvullende methoden voor eiwitstructuuranalyse: DSC voor biomoleculen: eiwitontvouwing en Tm-bepaling voor de thermodynamische karakterisering van eiwitstabiliteit; isothermische titratiecalorimetrie (ITC) voor bindingsthermodynamica; grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC) voor aggregaatanalyse; fluorescentie-spectroscopie voor tertiaire structuur via tryptofaanfluorescentie; NMR-spectroscopie voor atomaire resolutie in oplossing; FTIR-spectroscopie voor secundaire structuur via de amide-I-band; massaspectrometrie voor intacte massa en post-translationele modificaties; native mass spectrometry voor intacte eiwitcomplexen en stoichiometriebepaling; proteomics en 2D-PAGE voor grootschalige eiwitanalyse; en western blot voor immunologische eiwitdetectie. Voor informatie over de chiraliteitsanalyse van kleine moleculen, zie chirale chromatografie.
Bekijk het assortiment laboratoriumapparatuur en verbruiksmaterialen van Labvakhandel, of neem contact op voor advies bij de keuze van de juiste materialen voor uw toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting op circulair dichroïsme-spectroscopie. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties. Raadpleeg de handleiding van uw instrument, de geldende normen (ICH Q6B, Ph. Eur. 5.12.02) en de vakliteratuur voor protocollen die kritisch zijn voor de kwaliteitsborging van uw analyses.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
