LC-MS is de combinatie van vloeistofchromatografie (LC) met massaspectrometrie (MS). De LC-stap scheidt de componenten van een mengsel in de tijd; de MS-stap identificeert vervolgens elke component op basis van zijn massa-tot-ladingverhouding (m/z). De koppeling combineert het scheidende vermogen van LC met de zeer hoge gevoeligheid en specificiteit van MS, en behoort daarmee tot de krachtigste analytische technieken in het moderne laboratorium. LC-MS/MS, ook wel tandem-massaspectrometrie genoemd, voegt een tweede massascheiding toe en biedt structuurinformatie en nog lagere detectielimieten. Dit artikel legt uit hoe beide technieken werken, hoe ze van elkaar verschillen en wanneer u welke variant inzet.
LC-MS staat voor Liquid Chromatography – Mass Spectrometry, in het Nederlands: vloeistofchromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie. De afkorting LC-MS/MS staat voor Liquid Chromatography – Tandem Mass Spectrometry, waarbij twee massascheidingen achter elkaar plaatsvinden met een fragmentatiestap ertussen. In de praktijk gebruikt men ook de term HPLC-MS, wat hetzelfde betekent: de LC-stap is dan een HPLC-systeem.
Een LC-MS-systeem bestaat uit drie functionele delen die direct aan elkaar gekoppeld zijn: het LC-deel, de ionisatie-interface en het MS-deel. De onderstaande figuur toont de opbouw.
Aan de voorkant staat een conventioneel HPLC-systeem of een nano-LC-systeem. Een pomp transporteert de mobiele fase door de kolom, een autosampler injecteert het monster en de kolom scheidt de componenten op basis van hun affiniteit voor de stationaire fase. Voor LC-MS wordt vrijwel altijd omgekeerde-fase HPLC toegepast, met als mobiele fase een mengsel van water en methanol of acetonitril, voorzien van een vluchtig additief zoals mierenzuur of ammoniumformiaat. Niet-vluchtige zouten (fosfaten, sulfaten) zijn onverenigbaar met de MS-koppeling en moeten worden vermeden.
Tussen LC en MS bevindt zich de cruciale interface: hier worden de analyt-moleculen, die uit de kolom in vloeibare vorm aankomen, omgezet naar geladen ionen in gasfase. De meest gebruikte techniek is elektrospray-ionisatie (ESI), waarbij de vloeistof door een fijne capillaire naald wordt gespoten in een sterk elektrisch veld. Hierdoor ontstaat een nevel van kleine, geladen druppels die uitdrogen tot er kale ionen overblijven. Een tweede veelgebruikte techniek is atmospheric pressure chemical ionization (APCI), die geschikter is voor minder polaire moleculen. ESI levert vooral protonadducten op (positieve modus, [M+H]+) of gedeprotoneerde ionen (negatieve modus, [M-H]-).
Eenmaal in gasfase en geladen, gaan de ionen de massaspectrometer in. Daar worden ze gescheiden op basis van hun massa-tot-ladingverhouding (m/z) door een massa-analysator: doorgaans een quadrupool, time-of-flight (TOF), iontrap of Orbitrap. Op geïntegreerde platforms zoals de Bruker timsTOF en Waters SYNAPT wordt vóór de massaspectrometer een ion mobility-module (IMS of TIMS) geplaatst die ionen scheidt op conformatie (botsingscoördinatie, CCS), waarmee isobaren en isomeren worden onderscheiden die dezelfde m/z-waarde delen. De gescheiden ionen bereiken een detector (elektronenvermenigvuldiger), die het signaal omzet in een elektronische stroom. Het data-systeem stelt op basis daarvan een massaspectrum samen: een grafiek van intensiteit tegen m/z. Het MS-deel werkt onder hoog vacuüm om botsingen tussen ionen en luchtmoleculen te voorkomen.
Bij LC-MS bevat het MS-deel één massa-analysator. Het systeem geeft één massaspectrum per component en biedt voornamelijk informatie over de moleculaire massa. Bij LC-MS/MS — ook tandem-MS genoemd — staan twee massa-analysatoren achter elkaar, gescheiden door een botsingscel. De volgende figuur toont het verschil.
In een triple-quadrupool LC-MS/MS-systeem selecteert Q1 een specifiek precursor-ion (de moleculaire massa van interesse). In Q2 — de botsingscel — wordt dit ion verbroken door botsing met een inert gas (collision-induced dissociation, CID). De fragmenten gaan vervolgens naar Q3, dat één of meer specifieke fragmentmassa's selecteert. Pas dan bereiken de ionen de detector. Deze methode, bekend als selected reaction monitoring (SRM) of multiple reaction monitoring (MRM), levert twee belangrijke voordelen op:
LC-MS/MS is daarmee de standaard geworden in klinische analyses, dopingcontrole, voedselveiligheid en farmacokinetiek, waar het kwantificeren van zeer lage concentraties in complexe matrices essentieel is.
De belangrijkste componenten en hun rol op een rij:
LC-MS bereikt detectielimieten in het bereik van nanogram per liter tot picogram per liter, afhankelijk van het instrument, de analyt en de matrix. LC-MS/MS in MRM-modus gaat nog een orde of twee lager. Massa-nauwkeurigheid hangt af van het type analysator: een quadrupool levert eenheidsresolutie (massascheiding op gehele m/z-eenheden), terwijl hoge-resolutie analysatoren zoals Orbitrap en TOF nauwkeurigheden van minder dan 5 ppm halen. Deze hoge massa-nauwkeurigheid maakt het mogelijk om de empirische formule van een onbekend molecuul af te leiden.
LC-MS en LC-MS/MS worden ingezet in vrijwel elk vakgebied waar moleculaire identificatie en kwantificering op spoorniveau nodig is. De voornaamste toepassingsgebieden:
De voornaamste sterktes van LC-MS zijn de combinatie van scheidende kracht en uitzonderlijke specificiteit, de mogelijkheid om niet-vluchtige en thermisch labiele moleculen te analyseren (zoals eiwitten, in tegenstelling tot gaschromatografie–MS), en de brede toepasbaarheid van zeer kleine moleculen tot intacte biomoleculen. Tegelijk zijn er beperkingen:
Bezoekers stellen bij dit onderwerp regelmatig de volgende vragen.
Een HPLC-systeem perst een vloeibare mobiele fase onder hoge druk door een gepakte kolom. Het monster wordt geïnjecteerd in deze stroom; componenten worden gescheiden op basis van hun affiniteit voor de stationaire fase. Een detector aan het einde van de kolom registreert de gescheiden componenten. Bij LC-MS is die detector vervangen door een massaspectrometer.
In de klinische chemie wordt testosteron in bloed of speeksel kwantitatief bepaald met LC-MS/MS. Deze methode heeft de oudere immunologische test grotendeels vervangen omdat ze specifieker is en betrouwbaarder bij lage concentraties, zoals bij vrouwen en kinderen. De analyse gebruikt doorgaans deuterium-gelabeld testosteron als interne standaard.
Een interne standaard is een bekende referentiestof die in een vaste, bekende hoeveelheid aan elk monster wordt toegevoegd vóór de analyse. Bij LC-MS/MS worden hiervoor bij voorkeur stabiel-isotoop-gelabelde varianten van de doelanalyt gebruikt, bijvoorbeeld een deuterium- of ¹³C-gelabeld analogon. Omdat de interne standaard vrijwel identiek gedraagt als de analyt in de LC- en de MS-stap, corrigeert het signaalverhouding (analyt/interne standaard) automatisch voor variaties in injectie, ionisatie-efficiëntie en matrix-effecten. Dit is essentieel voor betrouwbare kwantificering in complexe matrices zoals plasma, urine of voedsel.
ESI staat voor elektrospray-ionisatie (electrospray ionization). Bij ESI wordt de vloeibare uitstroom van de LC-kolom door een dunne capillaire naald gespoten in een sterk elektrisch veld. Door de combinatie van elektrische kracht en verhitting ontstaat een nevel van steeds kleiner wordende, geladen druppels. Wanneer het oplosmiddel volledig verdampt, blijven kale gasionnen over die de massaspectrometer ingaan. ESI werkt uitzonderlijk goed voor polaire, niet-vluchtige moleculen zoals geneesmiddelen, peptiden en lipiden. Een bijzondere eigenschap van ESI is dat grote moleculen zoals eiwitten meerdere ladingen kunnen dragen, waardoor ook zware biomoleculen binnen het meetbereik van de massa-analysator vallen.
Bij LC-MS kiest u de ionisatiemodus op basis van de chemische eigenschappen van de doelanalyt. In de positieve modus ([M+H]+) neemt het molecuul een proton op; dit werkt goed voor basische verbindingen zoals aminozuren, alkaloïden en de meeste geneesmiddelen. In de negatieve modus ([M-H]-) verliest het molecuul een proton; dit is bij uitstek geschikt voor zure verbindingen zoals nucleotiden, vetzuren en veel pesticiden. Sommige verbindingen geven in beide modi een bruikbaar signaal; in dat geval bepaalt de gevoeligheid welke modus de voorkeur verdient. Moderne systemen ondersteunen snelle polariteitsomschakeling, zodat positief en negatief ioniserende analyte in één chromatografische run gemeten kunnen worden.
MRM (multiple reaction monitoring) en SRM (selected reaction monitoring) beschrijven in feite dezelfde LC-MS/MS-meetstrategie: de triple-quadrupool selecteert een precursor-ion in Q1, fragmenteert het in Q2, en detecteert een specifiek fragment-ion in Q3. Het verschil is louter terminologisch: SRM verwijst traditioneel naar het monitoren van één precursor-fragmentpaar, terwijl MRM het gelijktijdig monitoren van meerdere dergelijke overgangen aanduidt. In de praktijk worden de termen door elkaar gebruikt. MRM biedt uitstekende selectiviteit en gevoeligheid en is dé kwantificeringsmethode voor klinische diagnostiek, voedselveiligheid en farmacokinetisch onderzoek.
Een quadrupool is een massa-analysator die bestaat uit vier parallelle, cilindrische staafelectroden. Door een combinatie van gelijkspanning en wisselspanning op de staven aan te leggen, wordt voor elke instelling slechts één specifieke m/z-waarde stabiel doorgelaten; alle andere ionen botsen op de staven en worden verwijderd. Dit maakt de quadrupool uitermate geschikt voor gerichte kwantificering: in MRM-modus schakelt het instrument razendsnel tussen tientallen m/z-instellingen, waardoor meerdere analyte in één run gemeten worden. Nadeel van de quadrupool is de beperkte massaresolutie (eenheidsresolutie); voor exacte massa-identificatie kiest men een Orbitrap of TOF-analysator.
LC-MS en gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS) zijn complementaire technieken. GC-MS is uitermate geschikt voor vluchtige en thermisch stabiele verbindingen, zoals aromatische koolwaterstoffen, oplosmiddelenresiduen en vluchtige smaakstoffen: de verbindingen moeten in gasfase worden gebracht, wat bij verhitting bereikt wordt. LC-MS analyseert niet-vluchtige en thermisch labiele moleculen — zoals geneesmiddelen, eiwitten, suikers en polaire milieucontaminanten — in vloeibare fase en zonder verhitting. GC-MS maakt gebruik van elektronenionisatie (EI) of chemische ionisatie; LC-MS gebruikt ESI of APCI. Een GC-MS-systeem is in aanschaf doorgaans goedkoper, maar de keuze wordt in de praktijk nooit op prijs gemaakt: de aard van de analyt bepaalt welke techniek toepasbaar is.
LC-MS is niet geschikt voor de directe analyse van zware metalen op elementair niveau; daarvoor wordt ICP-MS (Inductively Coupled Plasma – Mass Spectrometry) gebruikt. LC-MS kan wel metaalcomplexen of organometaalverbindingen analyseren wanneer deze als intact molecuul kunnen worden geïoniseerd.
Matrix-effecten treden op wanneer co-eluerende componenten in het monster — zoals zouten, fosfolipiden of eiwitten — de ionisatie-efficiëntie in de ESI-bron beïnvloeden. Dit kan ionisatieonderdrukking (ion suppression) veroorzaken, waarbij het signaal van de doelanalyt kunstmatig laag uitvalt, of in mindere mate ionisatieversterking. Matrix-effecten zijn een van de voornaamste oorzaken van onbetrouwbare kwantificering bij onvoldoende monstervoorbereiding. Tegenmaatregelen zijn onder meer degelijke eiwitprecipitatie, solid-phase-extractie (SPE), het gebruik van een stabiel-isotoop-gelabelde interne standaard en het valideren van de methode met matrix-matched kalibratoren conform de geldende richtlijnen.
Een LC-MS-analyse verloopt in vier fasen. De eerste fase is monstervoorbereiding: biologische of omgevingsmonsters bevatten meestal eiwitten, zouten of lipiden die de ionisatie verstoren. Gebruikelijke stappen zijn eiwitprecipitatie, verdunning, vaste-fase-extractie of filtratie via een spuitfilter. De tweede fase is de LC-scheiding: het behandelde monster wordt via de autosampler geïnjecteerd en de componenten worden door de kolom gescheiden; looptijden variëren typisch van vijf tot dertig minuten. De derde fase is MS-detectie: de gescheiden componenten ioniseren via ESI of APCI en passeren de massa-analysator. In de vierde fase vindt data-interpretatie plaats: de software stelt massaspectra samen, identificeert componenten via bibliotheekvergelijking of exacte massa, en kwantificeert de doelanalyten op basis van piekoppervlakten ten opzichte van de interne standaard. Vóór routinegebruik doorloopt elke methode een validatietraject waarin parameters als lineariteit, aantoonbaarheidsgrens, herhaalbaarheid en matrix-effecten worden vastgesteld.
LC-MS-interferentie is een verzamelbegrip voor verstoringen die het gemeten signaal beïnvloeden zonder dat ze afkomstig zijn van de doelanalyt. De meest voorkomende vorm is ion suppression (ionisatieonderdrukking), waarbij co-eluerende matrixcomponenten de ESI-ionisatie verminderen en het analayt-signaal kunstmatig verlagen. Andere vormen zijn isobare interferentie — waarbij een andere verbinding vrijwel dezelfde m/z-waarde heeft — en chemische ruis door niet-volledig gescheiden matrixcomponenten. LC-MS/MS in MRM-modus reduceert isobare interferentie sterk, omdat een tweede massaselectie (fragmention) een extra discriminatielaag toevoegt. Hoge-resolutie-systemen zoals Orbitrap elimineren veel interferenties verder door exacte massa-discriminatie op minder dan 5 ppm. Adequate monstervoorbereiding en het gebruik van een stabiel-isotoop-gelabelde interne standaard zijn de praktische eerste verdediging tegen interferentie.
LC-MS en stand-alone HPLC zijn niet direct vergelijkbaar: ze beantwoorden een andere analytische vraag. HPLC met UV- of fluorescentiedetectie is sneller in te stellen, kostenefficiënter voor routinebepaling van bekende stoffen in schone matrices, en vereist minder complexe methodevalidatie. LC-MS voegt massa-identificatie toe, waarmee u onbekende verbindingen kunt identificeren, isobaren kunt onderscheiden en veel lagere detectielimieten kunt bereiken in complexe matrices. De "kwaliteit" van een analyse is daarmee niet een kwestie van welke techniek beter is, maar van welke informatiedichtheid uw toepassing vereist. In regulatoire context (farmacokinetiek, klinische diagnostiek, dopingcontrole) is LC-MS/MS de gouden standaard omdat specificiteit en gevoeligheid beide essentieel zijn. Voor routinematige HPLC-zuiverheidscontroles van farma-intermediaten volstaat stand-alone HPLC vaak prima.
De prijs van een LC-MS-systeem varieert sterk met de complexiteit. Een single-quadrupool LC-MS ligt typisch in de orde van enkele tienduizenden euro tot ongeveer honderdduizend euro; een triple-quadrupool LC-MS/MS kost meestal twee- tot driemaal zoveel. Hoge-resolutie systemen (Orbitrap, Q-TOF) liggen daar nog ruim boven. Daarnaast zijn er jaarlijkse kosten voor onderhoudscontracten, gas en verbruiksmaterialen.
HPLC-MS is een andere benaming voor LC-MS waarin expliciet wordt aangegeven dat de LC-stap een HPLC-systeem is. In het dagelijks gebruik worden de termen door elkaar gebruikt.
LC-MS staat niet op zichzelf, maar maakt deel uit van een reeks gekoppelde analytische technieken in de kennisbank. De onderliggende scheidingstechnieken en monstervoorbereidingen zijn allemaal bouwstenen voor een succesvolle LC-MS-analyse:
Labvakhandel levert verbruiksmaterialen voor LC-MS-laboratoria, waaronder oplosmiddelen van HPLC-gradiëntkwaliteit, vluchtige buffer-additieven, vials en doppen, spuitfilters en SPE-cartridges voor monstervoorbereiding. Neem contact op voor advies over de juiste benodigdheden voor uw LC-MS- of LC-MS/MS-toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
