SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate — PolyAcrylamide Gel Electrophoresis) is de standaardmethode om eiwitten te scheiden op basis van molecuulmassa. De techniek combineert twee ingrediënten die eiwitten tot bijna uniforme "staafjes" met een uniforme lading-massa-verhouding maken: het detergens SDS en een reducerende agens (DTT of β-mercaptoethanol). Daardoor wordt de migratiesnelheid in een polyacrylamidegel vrijwel uitsluitend een functie van de molecuulmassa — precies wat nodig is voor een betrouwbare massabepaling en zuiverheidscontrole.
Het bredere gelelektroforese-principe — DNA-scheiding in agarose én eiwitten in polyacrylamide — is beschreven in over gelelektroforese. Dit artikel richt zich specifiek op de discontinue Laemmli-variant voor eiwitten: gelbereiding, buffersystemen, run-condities, kleuring en de veelvoorkomende problemen die zich in de praktijk voordoen.
Een native eiwit heeft een eigen lading (afhankelijk van pI), een eigen vouwing en een eigen hydrodynamische straal. Directe scheiding in een gel geeft dan een mengsel van drie effecten dat niet eenvoudig tot molecuulmassa te herleiden is. SDS lost dit op. Het amphifiele detergens bindt aan de polypeptide-hoofdketen in een verhouding van ongeveer 1,4 g SDS per gram eiwit en overheerst daarmee de intrinsieke lading. Het resultaat: sterk negatief geladen SDS-eiwit-complexen met een uniforme lading-massa-verhouding.
Het Laemmli-systeem (Laemmli, 1970) is de klassieke uitwerking. Het combineert twee gels met verschillende pH en poriegrootte in één blok: een stacking gel bovenaan (4 % acrylamide, pH 6,8) en een resolving gel daaronder (typisch 8–15 % acrylamide, pH 8,8). Door dit discontinue buffersysteem worden alle eiwitten uit een well eerst geconcentreerd in een uiterst dunne startlijn — vaak micrometers dik — voordat de eigenlijke scheiding op massa begint. Dat verklaart de scherpe, goed gescheiden banden die het systeem oplevert.
SDS staat voor sodium dodecyl sulfate, het detergens dat de eiwitten denatureert en uniform negatief laadt. PAGE staat voor polyacrylamide gel electrophoresis, de gelmatrix van gepolymeriseerd acrylamide met bisacrylamide als cross-linker. De combinatie geeft scheiding op molecuulmassa, ongeacht native structuur of oorspronkelijke lading van het eiwit.
Een volledige SDS-PAGE-analyse bestaat uit zeven opeenvolgende stappen:
Polyacrylamidegels worden gemaakt door radicaal-gepolymeriseerde acrylamide-monomeren met een klein percentage bisacrylamide als kruisverbinder. De verhouding acrylamide/bisacrylamide (standaard 37,5 : 1) bepaalt de poriegrootte samen met de totale monomeerconcentratie (T-%). Polymerisatie wordt gestart door ammoniumpersulfaat (APS) als radicaalinitiator en versneld door TEMED (N,N,N',N'-tetramethylethyleendiamine).
Voor eiwitten kleiner dan 10 kDa is een Tricine-SDS-PAGE (Schägger & von Jagow) betrouwbaarder dan Laemmli: het vervangt glycine door tricine in de kathode-buffer en levert scheiding tot circa 1 kDa.
Voorgegoten commerciële gels elimineren de blootstelling aan het carcinogene acrylamide-monomeer en geven zeer consistente resultaten. Zelf gieten is goedkoper per gel, geeft flexibiliteit in geldikte en gradiënten, en is essentieel voor niet-standaardformaten. Werk met vloeibare acrylamideoplossingen altijd in de zuurkast en draag nitril handschoenen; zie ook CMR-stoffen in het laboratorium: indeling, risico's en veilige alternatieven.
Het Laemmli-systeem gebruikt drie buffers met verschillende pH die samen het "stacking"-effect veroorzaken:
In de stacking gel is glycine grotendeels ongeladen (pH 6,8 < pKa 9,6) en migreert langzaam. Cl− uit het geloppervlak migreert snel. De eiwitten belanden ingeklemd tussen "leading" chloride en "trailing" glycine — een fenomeen dat isotachoforese wordt genoemd — en concentreren zich in een uiterst dunne band. Zodra de bandering de resolving gel binnengaat (pH 8,8), wordt glycine volledig geladen, versnelt en haalt de eiwitten in. Vanaf dat moment zijn er geen concentrerende krachten meer en gaat scheiding puur op molecuulmassa via het sieveffect van de gelporiën.
De stacking gel heeft een lage acrylamideconcentratie (4 %) en pH 6,8 en heeft één doel: alle eiwitten uit een well concentreren in een scherpe startlijn. De resolving gel heeft een hogere concentratie (8–15 %) en pH 8,8 en verzorgt de scheiding op molecuulmassa. Zonder stacking gel wordt de bandbreedte bepaald door de laadhoogte in de well; met stacking gel worden banden micrometer-scherp.
De Laemmli-buffer — ook aangeduid als Laemmli sample buffer of SDS-laadkleurstof — is de oplossing waarmee een eiwitmonster wordt voorbereid vóór het laden op een SDS-PAGE-gel. De buffer bevat SDS om eiwitten te denatureren en uniform negatief te laden, een reducerend reagens (DTT of β-mercaptoethanol) om disulfidebruggen te verbreken, glycerol om het monster in de well te laten zinken, en broomfenolblauw als loopfront-indicator. De meest gebruikte formulering is de 2× variant, die 1:1 met het monster wordt gemengd; geconcentreerdere varianten (4× of 5×) worden navenant verder verdund. De exacte samenstelling van de 2× buffer staat hieronder.
De verdunning hangt af van de concentratie van de kant-en-klare of zelfgemaakte buffer. De 2× Laemmli sample buffer wordt 1:1 gemengd met het eiwitmonster in water of een compatibele bufferoplossing: gelijke volumes buffer en monster. De 4× variant wordt gemengd in een verhouding van 1 deel buffer op 3 delen monster (1:3), zodat de eindconcentratie van SDS en glycerol gelijk blijft. De 5× variant wordt 1:4 verdund. Verdun altijd met het eiwitmonster zelf, niet met extra water, tenzij het monster al in de juiste concentratie is. Na verdunnen wordt het mengsel 5 minuten verhit tot 95 °C vóór het laden; bij membraaneiwitten geldt een lagere temperatuur (37–60 °C) om aggregatie te voorkomen.
Een standaard 2× Laemmli sample buffer bevat:
Het monster wordt 1:1 gemengd met sample buffer en 5 minuten verhit tot 95 °C. Bij membraaneiwitten geeft koken echter vaak aggregatie; verhit dan zachter (bijvoorbeeld 10 min bij 37 °C of 60 °C) of laad zonder verwarming.
Een gangbare 5× Laemmli sample buffer (ook aangeduid als 5× SDS-laadkleurstof of 5× loading dye) bevat per 10 ml: Tris-HCl 0,3 M (pH 6,8), SDS 10 % (m/v), glycerol 50 % (v/v), broomfenolblauw 0,05 % (m/v) en — voor reducerende condities — DTT 500 mM of β-mercaptoethanol 25 % (v/v). De 5× buffer wordt 1:4 verdund met het eiwitmonster; de eindconcentratie van SDS in het geladen monster is dan circa 2 %. Bewaar de 5× buffer zonder reducerend reagens bij kamertemperatuur of 4 °C en voeg DTT of β-mercaptoethanol vers toe vlak voor gebruik, omdat deze reagentia instabiel zijn bij langdurige opslag.
De standaarddosering voor reducerende 4× Laemmli sample buffer is 50 µl β-mercaptoethanol (BME) per 950 µl buffer, wat neerkomt op 5 % (v/v) in de 4× stock. Na 1:3 verdunning met het monster is de uiteindelijke BME-concentratie in het geladen mengsel circa 1,25 % (v/v). Voeg BME altijd toe vlak voor gebruik en werk in een zuurkast of goed geventileerde ruimte vanwege de sterke geur en lichte toxiciteit. Als alternatief voor BME geeft DTT (eindconcentratie 100 mM in de 1× sample buffer) een gelijkwaardig reducerend effect met een minder uitgesproken geur en is stabieler in oplossing.
LDS-monsterbuffer (lithiumdodecylsulfaat) en Laemmli-monsterbuffer (SDS, natriumdodecylsulfaat) dienen hetzelfde doel — eiwitten denatureren en uniform negatief laden — maar worden ingezet bij verschillende gelsystemen. De Laemmli-monsterbuffer is onderdeel van het klassieke Tris-glycine-SDS-systeem en vereist verhitting tot 95 °C voor volledige denaturatie. LDS-monsterbuffer is ontwikkeld voor het Bis-Tris-gelsysteem (onder andere NuPAGE van Thermo Fisher) en werkt al effectief bij 70 °C, wat aggregatie van gevoelige eiwitten en membraaneiwitten vermindert. Beide bevatten een spoordye (broomfenolblauw of vergelijkbaar), glycerol en een reducerend reagens. Laemmli-buffer en LDS-buffer zijn niet onderling uitwisselbaar: gebruik altijd de buffer die bij het bijbehorende gelsysteem en loopbuffer past.
Reducerende condities (DTT of β-mercaptoethanol) breken intra- en intermoleculaire disulfidebruggen. Voor eiwitten met belangrijke S-S-bruggen (zoals IgG) geeft niet-reducerende SDS-PAGE de intacte massa (~150 kDa voor IgG), terwijl reducerende SDS-PAGE de zware (~50 kDa) en lichte ketens (~25 kDa) apart toont. Beide condities kunnen op één blot naast elkaar staan voor karakterisering.
Voor Coomassie-kleuring: 5–25 µg totaal eiwit per baan (of 0,5–5 µg per verwachte band). Voor zilverkleuring: 5–50 ng per band. Voor western blot zijn 10–30 µg cellysaat gebruikelijk, maar de belastbaarheid hangt sterk af van de expressie van het doelwit. Bepaal de totale eiwitconcentratie vooraf via Bradford, BCA of A280 om reproducerbaarheid te borgen.
Voor een western blot wordt de SDS-PAGE-gel gekozen op basis van de verwachte molecuulmassa van het doelwit, net als bij een reguliere SDS-PAGE-analyse. Als vuistregel geldt: voor doelwitten van 10–40 kDa een 12–15 %-gel; voor 40–100 kDa een 10 %-gel; voor 100–200 kDa een 8 %-gel. Gradiëntgelen (4–20 %) zijn geschikt wanneer meerdere doelwitten in één blot worden gedetecteerd met sterk uiteenlopende massa's. Een te hoog percentage belemmert de overdracht van grote eiwitten naar het membraan; een te laag percentage laat kleine eiwitten te ver migreren en kan leiden tot verlies van resolutie in het laagmoleculaire bereik.
Hogere spanning verkort de scheidingsduur, maar genereert meer Joule-warmte die banden kan doen "smiling" (concave banden door temperatuurgradiënt tussen midden en rand van de gel). Bij lange runs of hoge voltages is een gekoeld run-apparaat aan te bevelen.
Een MW-ladder bevat een mengsel eiwitten met bekende massa en dient als kalibratielijn voor massabepaling van onbekende banden. Pre-stained ladders zijn covalent gekleurd en direct zichtbaar tijdens de run — handig om het front visueel te volgen en om succes van western blot-transfer te bevestigen. Ongekleurde ladders vereisen kleuring na afloop maar geven een strakkere bandpositie.
Voor massabepaling wordt de log(MW) uitgezet tegen de relatieve mobiliteit Rf (afstand band tot loopfront gedeeld door totale looplengte). Binnen het lineaire bereik van de gel (grofweg 15–200 kDa in een 10 % gel) geeft deze plot een rechte lijn waaruit de massa van een onbekende band wordt afgelezen.
De klassieke keuze. Coomassie R-250 (of het gevoeliger G-250 in colloïdale formulering) bindt niet-covalent aan eiwitten via ionaire en hydrofobe interacties. Standaardprotocol:
Coomassie detecteert typisch vanaf 100–500 ng eiwit per band en is lineair kwantificeerbaar over een bereik van ongeveer 0,5–20 µg per band. Colloïdaal Coomassie G-250 (Blue Silver / Neuhoff-methode) is gevoeliger (10–50 ng) en compatibel met massaspectrometrie omdat het geen methanol en azijnzuur voor fixatie nodig heeft.
Zilverkleuring is 30–100× gevoeliger dan klassieke Coomassie (detectie vanaf 0,05–0,1 ng per band) maar heeft nadelen: het bereik van de kalibratielijn is smaller, sommige eiwitten kleuren zwak of niet ("negatieve" banden), en veel protocollen zijn onverenigbaar met vervolg-massaspectrometrie door glutaaraldehyde in de fixatie. MS-compatibele zilverkleuringen bestaan wel, maar met iets minder gevoeligheid.
SYPRO Ruby, Krypton en analoge fluorescente labels binden aan de SDS-eiwit-mantel en detecteren vanaf 1–2 ng per band met een dynamisch bereik dat 1000× groter is dan Coomassie. Voordelen: geen fixatie of ontkleuring, lineaire kwantificering over vier decaden, MS-compatibel. Nadeel: er is een fluorescentiescanner nodig.
Na kleuring wordt de gel gedocumenteerd via een gel documentation system (gel doc), een scanner of een fluorescentie-imager. Voor kwantitatieve densitometrie is een lineair detectiebereik cruciaal: verzadigde banden vertekenen de meting. Software (ImageJ, GelAnalyzer, of gel-doc-eigen packages) berekent piekoppervlakken per band en corrigeert voor achtergrond en laadvariatie via een controle-eiwit (housekeeping band) of via een referentie-eiwit in elke baan.
De Rf (relative mobility) is de afgelegde afstand van een band vanaf de bovenkant van de resolving gel, gedeeld door de afstand van de loopfront (broomfenolblauw). Rf-waarden liggen tussen 0 (niet gemigreerd) en 1 (met de loopfront meegelopen). Log(MW) tegen Rf geeft binnen het lineaire bereik een rechte lijn, waaruit onbekende massa's worden geïnterpoleerd.
De term kDa-score of kDa-waarde die in zoekopdrachten voorkomt, verwijst naar ditzelfde principe: de geschatte molecuulmassa in kilodalton (kDa) die via de Rf-kalibratielijn wordt afgelezen. Een band met Rf 0,6 op een 10 %-gel komt bijvoorbeeld overeen met circa 35 kDa als dat punt op de log(MW)–Rf-rechte ligt. De kDa-waarde is een schatting met een nauwkeurigheid van circa 5–10 %; voor exacte massabepaling is massaspectrometrie vereist.
Het kDa-bereik van SDS-PAGE hangt af van de acrylamideconcentratie van de resolving gel. Een standaard 10 %-gel scheidt eiwitten betrouwbaar tussen circa 20 en 80 kDa; een 8 %-gel is geschikt voor 36–94 kDa; een 15 %-gel voor 10–43 kDa. Gradiëntgelen (4–20 %) dekken in één run een breed bereik van 10 tot meer dan 200 kDa. De MW-ladder bepaalt de kalibratielijn: log(MW in kDa) wordt uitgezet tegen de Rf-waarde van elke ladderband. Eiwitten kleiner dan 10 kDa worden beter gescheiden met Tricine-SDS-PAGE; voor exacte massabepaling in kDa blijft massaspectrometrie de referentiemethode.
Ja. In SDS-PAGE migreren kleinere eiwitten sneller dan grotere. Dit is een direct gevolg van het zeefeffect van de polyacrylamidegel: de poriën van de gelmatrix laten kleinere moleculen gemakkelijker passeren, terwijl grotere moleculen meer weerstand ondervinden en langzamer bewegen. Omdat SDS alle eiwitten een uniforme lading-massa-verhouding geeft, is de enige variabele die de migratiesnelheid bepaalt de grootte van het molecuul.
Het omgekeerde geldt voor agarose-gelelektroforese van DNA: ook daar migreren kleinere fragmenten sneller. Het principe is hetzelfde: moleculaire zeef + uniforme lading = scheiding op grootte. De Rf-waarde (relatieve mobiliteit) is hoger voor kleine eiwitten en lager voor grote, wat de basis vormt van de log(MW)–Rf-kalibratielijn waaruit molecuulmassa's worden afgelezen.
Een SDS-PAGE-gel lees je van boven (hoog molecuulgewicht) naar beneden (laag molecuulgewicht). De MW-ladder in de eerste of laatste baan geeft de referentielijn. Per baan let u op vier dingen:
Positie van de banden. Vergelijk de hoogte van elke band met de ladder om de molecuulmassa te schatten. Meet de Rf-waarde (afstand band ÷ afstand loopfront) en lees de massa af van de log(MW)–Rf-kalibratielijn. Banden op de verwachte hoogte bevestigen de identiteit of het zuiveringsresultaat.
Aantal banden. Eén scherpe band bij het verwachte molecuulgewicht duidt op een puur preparaat. Meerdere banden wijzen op verontreinigingen, degradatieproducten of multimere complexen die niet volledig zijn gereduceerd. Een ontbrekende band betekent dat het eiwit niet aanwezig is, niet is overgedragen (bij western blot) of beneden de detectiegrens van de kleuring ligt.
Intensiteit van de banden. Bandintensiteit is evenredig met de hoeveelheid eiwit (binnen het lineaire bereik van de kleuring). Vergelijk intensiteiten tussen banen alleen als de totale eiwitbelasting per baan gelijk is — kwantificeer vooraf via Bradford, BCA of A280. Densitometrisch meten via ImageJ of vergelijkbare software geeft een relatieve schatting van de fractie per component.
Bandvorm en scherpte. Scherpe banden duiden op goede scheiding en correcte monstervoorbereiding. Uitgesmeerde banden kunnen wijzen op te veel eiwit, proteolyse of incomplete denaturatie. "Smiling"- of "frowning"-patronen duiden op temperatuurverschillen of bufferfouten — zie de troubleshooting-tabel voor oorzaken en oplossingen.
Wat betekent het aantal banden in gelelektroforese? Elke band vertegenwoordigt één of meer eiwitten met dezelfde of nagenoeg gelijke molecuulmassa. Bij een celruwe extract zijn tientallen banden normaal; bij een gezuiverd preparaat verwacht u één dominante band. Extra banden bij hogere massa kunnen aggregaten zijn; extra banden bij lagere massa zijn vaak afbraakproducten of verontreinigingen.
Zonder SDS behouden eiwitten hun native lading, structuur en oligomere status. Native PAGE scheidt daarom op een combinatie van lading, grootte en vorm — geschikt voor het bestuderen van intacte eiwitcomplexen. Blue Native PAGE (BN-PAGE) gebruikt Coomassie G-250 als milde ladingsdrager en is bijzonder geschikt voor membraancomplexen.
SDS-PAGE als tweede dimensie na iso-elektrische focusing (IEF) staat centraal in proteomics en 2D-PAGE. De combinatie scheidt duizenden eiwitten tegelijk op pI en molecuulmassa.
Een moderne variant zonder gel: eiwit-SDS-complexen migreren door een capillair gevuld met een polymere zeefmatrix. CE-SDS is snel (10–30 min per monster), volledig geautomatiseerd en levert kwantitatieve resultaten met zeer hoge reproduceerbaarheid. In biofarmaceutische kwaliteitscontrole vervangt CE-SDS steeds vaker klassieke SDS-PAGE. Meer over de bredere techniek in capillaire elektroforese.
SDS-PAGE is de standaard kwaliteitscontrole op zuiverheid en integriteit tijdens elke stap van een eiwitzuivering: na lysis, na de capture-stap (bijvoorbeeld affiniteitschromatografie), na ionenwisselchromatografie en na polishing via SEC / GPC. Voor bevestiging van de identiteit volgt vaak transfer naar western blot of uitsnijden voor MS-analyse.
Onthardacrylamide (het monomeer) is carcinogeen categorie 1B en mutageen 1B. Draag altijd handschoenen en werk in een zuurkast bij het aanmaken van gel-oplossingen. Gepolymeriseerd polyacrylamide (de gel zelf) is niet-toxisch. Zie het veiligheidsinformatieblad (SDS) van uw acrylamide-reagens voor stof-specifieke maatregelen; algemene kaders staan in CMR-stoffen in het laboratorium en over persoonlijke bescherming in het laboratorium.
Kleuroplossingen met Coomassie of zilver bevatten methanol en/of azijnzuur en horen bij het chemisch afval. Zilveroplossingen zijn na gebruik laboratoriumafval vanwege zwaarmetaalgehalte.
Voor biofarmaceutische producten is SDS-PAGE (of het capillaire equivalent CE-SDS) een van de standaardmethoden voor zuiverheid en identiteit. De ICH-richtlijn Q6B beschrijft welke analytische parameters minimaal getoetst moeten worden — zie de ICH Quality Guidelines. De onderliggende methodevalidatie volgt validatie van analytische methoden (ICH Q2).
SDS-PAGE is een elektroforetische scheiding van eiwitten in een polyacrylamidegel, waarbij SDS de eiwitten denatureert en uniform negatief laadt. Het resultaat is scheiding puur op molecuulmassa. Het klassieke Laemmli-systeem gebruikt een stacking gel (pH 6,8) boven een resolving gel (pH 8,8) om scherpe banden te verkrijgen.
Een Laemmli-gel is een polyacrylamidegel ingericht volgens het discontinue buffersysteem dat Ulrich Laemmli in 1970 beschreef. De gel bestaat uit twee lagen: een bovenste stacking gel (4 % acrylamide, pH 6,8) en een onderste resolving gel (8–15 % acrylamide, pH 8,8). De stacking gel concentreert alle eiwitten uit de well tot een scherpe startlijn via isotachoforese; de resolving gel scheidt ze daarna op molecuulmassa. De term "Laemmli-gel" wordt in de praktijk gebruikt als synoniem voor een SDS-PAGE-gel in het discontinue Tris-glycine-SDS-systeem, ter onderscheid van alternatieve systemen zoals Bis-Tris (NuPAGE) of Tricine-gelen voor kleine eiwitten.
SDS-PAGE staat voor Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis. Het is de standaardtechniek in de biochemie en moleculaire biologie om eiwitten te scheiden, te identificeren en te karakteriseren op basis van hun molecuulmassa. SDS (natriumdodecylsulfaat) is een ionisch detergens dat twee dingen doet: het denatureert eiwitten door hun tertiaire en secundaire structuur te verstoren, en het geeft elk eiwit een uniforme negatieve lading evenredig aan zijn massa (circa 1,4 g SDS per gram eiwit). Hierdoor worden alle eiwitten in het monster gereduceerd tot negatief geladen staafjes die alleen nog op massa van elkaar verschillen.
PAGE verwijst naar de gelmatrix: gepolymeriseerd acrylamide met bisacrylamide als kruisverbinder vormt een moleculaire zeef met instelbare poriegrootte. Kleine eiwitten migreren sneller door de kleine poriën; grote eiwitten worden sterker vertraagd. Het resultaat is een bandpatroon waarin elke band overeenkomt met één of meer eiwitten van dezelfde molecuulmassa. Door vergelijking met een MW-ladder met eiwitten van bekende massa kan de molecuulmassa van onbekende eiwitten worden geschat.
SDS-PAGE is een anionische techniek. SDS is een negatief geladen detergens (het dodecylsulfaat-anion, DS⁻) dat zich bindt aan de polypeptideketen en de eiwitten een sterk negatieve nettolading geeft. Alle eiwitten migreren daardoor van de negatieve kathode naar de positieve anode — vandaar dat de anode altijd aan de onderkant van een verticale SDS-PAGE-opstelling zit. De intrinsieke positieve of negatieve lading die een eiwit in zijn native toestand zou hebben, wordt volledig overstemd door het SDS.
Kationische gelelektroforese bestaat ook (bijvoorbeeld met CTAB als detergens) maar wordt zelden toegepast en is niet gestandaardiseerd voor routinegebruik. In vrijwel alle laboratoria is "SDS-PAGE" synoniem met de anionische variant.
SDS-PAGE wordt uitgevoerd in een verticale opstelling. De polyacrylamidegel hangt rechtop tussen twee glasplaten; de wells zitten bovenaan en de eiwitten migreren van boven naar beneden, van kathode (−) naar anode (+). De loopbuffer vult de bovenste en onderste reservoirs van het apparaat.
Dit is het omgekeerde van klassieke DNA-agarosegelelektroforese, die doorgaans horizontaal wordt uitgevoerd: de agarosegel ligt plat in een onderdompelingstank en DNA migreert horizontaal. Het verschil is praktisch: polyacrylamidegelen zijn mechanisch steviger dan agarosegelen en kunnen rechtop staan; bovendien maakt de verticale opstelling gebruik van de zwaartekracht bij het laden van de wells. Agarosegelen zijn te slap voor een verticale positie en worden horizontaal gegoten en gelopen.
Agarose-gelelektroforese en SDS-PAGE zijn beide vormen van gelelektroforese, maar ze scheiden verschillende biomoleculen via verschillende principes:
De fundamentele overeenkomst is het principe: geladen moleculen bewegen door een poreuze matrix onder invloed van een elektrisch veld. De poriën van de gel fungeren als moleculaire zeef die kleinere moleculen sneller doorlaat dan grotere.
Gelelektroforese is de overkoepelende term voor alle technieken waarbij geladen moleculen door een gelmatrix migreren onder invloed van een elektrisch veld. SDS-PAGE is één specifieke uitvoering van gelelektroforese, namelijk die voor eiwitten in polyacrylamide met SDS als denaturerend detergens.
De verwarring ontstaat doordat "gelelektroforese" in de volksmond vaak verwijst naar DNA-elektroforese in agarose, terwijl "PAGE" of "SDS-PAGE" de eiwitvariant aanduidt. In strikte zin zijn beide gelelektroforese, net zoals zowel een racefiets als een stadsfiets een fiets zijn. De belangrijkste praktische verschillen staan samengevat in de vergelijkingstabel bij de vraag over agarose versus SDS-PAGE hierboven. Voor een volledig overzicht van alle gelelektroforese-varianten — inclusief agarose, native PAGE, 2D-PAGE en capillaire elektroforese — verwijzen wij naar het overzichtsartikel over gelelektroforese.
SDS-PAGE is niet voor DNA — het is specifiek ontworpen voor eiwitten. DNA heeft al van nature een sterke negatieve lading door zijn fosfaatgroepen en heeft geen SDS nodig om te migreren. DNA wordt gescheiden via agarose-gelelektroforese, niet via polyacrylamide met SDS. Het gebruik van SDS zou DNA niet zinvol scheiden en de gelmatrix beschadigen bij de vereiste concentraties.
RNA kan in principe ook in SDS-PAGE worden gescheiden, maar wordt in de praktijk gescheiden via denaturerende agarosegelelektroforese (met formaldehyde of glyoxal) of via niet-denaturerende polyacrylamidegelen zonder SDS, afhankelijk van de vraagstelling. Voor kleine RNA-moleculen (siRNA, miRNA, tRNA) worden hoge-percentage polyacrylamidegelen gebruikt zonder SDS maar met ureum als denaturans.
Samengevat: SDS-PAGE = eiwitten. Agarose-gelelektroforese = DNA en RNA. Urea-PAGE = kleine RNA-moleculen en oligonucleotiden.
SDS-PAGE kent twee indelingen die elk twee typen opleveren. De eerste indeling betreft het buffersysteem: het discontinue systeem (zoals het Laemmli-systeem beschreven in dit artikel) gebruikt gels met verschillende pH en geeft scherpe banden door het stacking-effect; het continue systeem gebruikt één pH door de hele gel en wordt zelden toegepast voor routinewerk. De tweede en praktisch belangrijkere indeling betreft de monstervoorbereiding: reducerende SDS-PAGE breekt disulfidebruggen met DTT of β-mercaptoethanol en toont individuele polypeptideketens; niet-reducerende SDS-PAGE laat disulfidebruggen intact en toont de massa van het intact gebonden complex. Voor de karakterisering van antilichamen worden beide typen naast elkaar uitgevoerd: reducerend geeft de zware (~50 kDa) en lichte (~25 kDa) ketens afzonderlijk; niet-reducerend geeft het intacte IgG (~150 kDa).
SDS-PAGE scheidt eiwitten op molecuulmassa in een gel. Western blot begint mét een SDS-PAGE-scheiding, maar zet de eiwitten daarna over op een membraan en detecteert een specifiek doelwit via antilichamen. SDS-PAGE toont dus alle eiwitten in het monster; western blot toont slechts het eiwit waartegen het gebruikte antilichaam gericht is.
Verhitting tot 95 °C denatureert de eiwitten volledig en zorgt dat SDS het polypeptide efficiënt bekleedt. Zonder verhitting blijven residuele secundaire en tertiaire structuur bestaan en migreren eiwitten anders dan hun massa voorspelt. Uitzondering: membraaneiwitten aggregeren vaak bij koken en worden bij voorkeur bij 37–60 °C behandeld.
De standaard Laemmli sample buffer heeft een pH van 6,8. Die waarde is afgestemd op de stacking gel, die eveneens op pH 6,8 is gebufferd met Tris-HCl. Op deze pH is glycine in de loopbuffer grotendeels ongeladen, wat het isotachoforese-effect in de stacking gel mogelijk maakt. De sample buffer wordt 1:1 met het monster gemengd, zodat de definitieve pH in de well ook dicht bij 6,8 ligt. De resolving gel (pH 8,8) en de loopbuffer (pH 8,3) hebben een hogere pH en zijn niet bedoeld voor contact met het ruwe monster.
SDS-PAGE geeft een schatting binnen ongeveer 5–10 % nauwkeurigheid, mits het doel-eiwit binnen het lineaire bereik van de gel valt. Voor exacte massabepaling is massaspectrometrie de referentiemethode; die geeft nauwkeurigheid beter dan 0,01 %.
SDS-PAGE heeft een aantal inherente beperkingen. Ten eerste is de massaschatting slechts indicatief (nauwkeurigheid circa 5–10 %); voor exacte waarden is massaspectrometrie vereist. Ten tweede verliezen eiwitten door SDS en verhitting hun native structuur en activiteit — functionele informatie gaat verloren. Ten derde schatten glycoproteïnen, sterk hydrofobe eiwitten en eiwitten met ongewone aminozuursamenstelling afwijkend af, omdat SDS niet uniform aan al deze typen bindt. Ten vierde is acrylamide-monomeer carcinogeen, wat extra veiligheidsmaatregelen vereist bij het gieten van zelfgemaakte gels. Ten slotte is SDS-PAGE kwalitatief of semi-kwantitatief; voor nauwkeurige kwantificering van eiwitconcentraties zijn methoden als Bradford, BCA of CE-SDS betrouwbaarder.
Zelfgegoten Laemmli-gels zijn maximaal 1–2 weken bewaarbaar bij 4 °C, verpakt in vochtige tissue om uitdrogen te voorkomen. Voorgegoten commerciële gels hebben een houdbaarheidsdatum die op de verpakking staat, meestal enkele maanden bij gekoelde opslag.
Het benodigde volume hangt af van het gelformaat en de dikte van de gietcassette. Voor een standaard mini-gel (8 × 10 cm, 1 mm dik) geldt als vuistregel: circa 5–8 ml resolving geloplossing en 1–2 ml stacking geloplossing. Grotere mid-size gelen (16 × 16 cm) vragen 30–50 ml resolving en 5–10 ml stacking. Bereken het exacte volume als lengte × breedte × dikte van de gietruimte en voeg circa 10 % extra toe voor verlies bij het gieten. Giet de resolving gel eerst, beleg het oppervlak direct met water of isopropanol om een vlak grensvlak te krijgen, verwijder dit vloeistoflaagje na polymerisatie en giet vervolgens de stacking gel met de kam.
Broomfenolblauw is een tracker-kleurstof in de sample buffer die met de loopfront meemigreert. Het is klein en negatief geladen bij pH 8,8 en migreert sneller dan vrijwel elk eiwit. Zodra de blauwe front de onderkant van de gel nadert, is de scheiding voltooid en wordt de run gestopt.
Een standaard mini-gel (8 × 10 cm) is bij 120–200 V doorgaans klaar in 45 tot 90 minuten. De exacte duur hangt af van het aangelegde voltage, de acrylamideconcentratie en het gewenste scheidingsbereik: een 15 %-gel bij laag voltage loopt langer dan een 8 %-gel bij hoog voltage. De run wordt gestopt zodra het broomfenolblauw-front de onderrand van de resolving gel nadert, maar er nog circa 0,5–1 cm gel onder zit. Te vroeg stoppen betekent dat kleine eiwitten de gel nog niet volledig hebben doorlopen; te laat stoppen kost u kleine eiwitten die van de gel af migreren. Bij gradiëntgelen (4–20 %) kunt u het front iets verder laten lopen omdat de hogere dichtheid aan de onderkant kleine eiwitten vasthoudt.
SDS bindt slecht aan sterk geglycosyleerde regio's, waardoor de lading-massa-verhouding voor glycoproteïnen niet zo uniform is als voor niet-gemodificeerde eiwitten. Glycoproteïnen migreren daardoor vaak trager dan hun werkelijke massa voorspelt en verschijnen als diffuse banden. Enzymatische deglycosylering (PNGase F) voor SDS-PAGE geeft scherpere banden en een correctere massa-schatting.
Ja. Coomassie- of colloïdaal-gekleurde banden kunnen uit de gel worden gesneden en via een in-gel-trypsinedigest worden voorbereid voor MS-identificatie. Voor preparatieve terugwinning van intact eiwit bestaan elektro-elutiemethoden, hoewel de opbrengst en zuiverheid dan lager liggen dan bij chromatografische zuivering.
Voor de complete SDS-PAGE-workflow levert Labvakhandel de benodigde chromatografie- en bio-verbruiksmaterialen, apparatuur voor moleculaire biologie, liquid-handling en handbescherming — snel leverbaar. Neem contact op voor advies bij de opzet of optimalisatie van uw gelsysteem.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
