Kernmagnetische resonantiespectroscopie (Nuclear Magnetic Resonance, NMR) is de krachtigste techniek voor structuuropheldering van organische moleculen. De methode maakt gebruik van de magnetische eigenschappen van atoomkernen met een spin (¹H, ¹³C, ²¹P, ¹³F, ¹·N) om informatie te verkrijgen over de chemische omgeving, bindingen en driedimensionale rangschikking van atomen in een molecuul. NMR is onmisbaar in de farmaceutische industrie (structuurbevestiging, metabolietenonderzoek), organische synthese, materiaalwetenschap en biochemisch onderzoek.
Atoomkernen met een oneven massa- of atoomgetal bezitten een magnetisch dipoolmoment (spin). In een sterk extern magneetveld (B₀) richten de kernen zich parallel of antiparallel aan het veld op, met een energieverschil dat overeenkomt met een radiofrequentie (RF). Wanneer een korte RF-puls wordt aangelegd die overeenkomt met de Larmor-frequentie van de kern, worden de kernen in een hogere energietoestand gebracht. Bij relaxatie zenden zij een zwak RF-signaal uit dat wordt geregistreerd als het Free Induction Decay (FID). Een Fourier-transformatie van het FID geeft het NMR-spectrum.
De exacte resonantiefrequentie van een kern is afhankelijk van de elektronendichtheid in zijn directe omgeving: elektronenrijke omgevingen (afgeschermd) resoneren bij lagere frequentie; elektronenarme omgevingen (deshielded) bij hogere frequentie. Dit verschil wordt uitgedrukt als de chemische verschuiving δ in ppm ten opzichte van een referentiestof (TMS voor ¹H en ¹³C, 85 % fosforzuur voor ²¹P). De chemische verschuiving is onafhankelijk van de veldsterkte van de magneet en daarmee universeel vergelijkbaar tussen instrumenten.
Typische ¹H-verschuivingen: methylgroepen (0,9 ppm), methyleengroepen (1,2–1,5 ppm), aromatische H (7–8 ppm), aldehyde-H (9–10 ppm), carbonzuur-OH (10–12 ppm).
Naburige magnetisch actieve kernen beïnvloeden elkaars resonantiefrequentie via scalaire koppeling (J-koppeling). Dit leidt tot splitsing van NMR-signalen in meervoudige componenten (doublet, triplet, multiplet). De koppelingsconstante J (in Hz) is onafhankelijk van de veldsterkte en geeft informatie over de ruimtelijke relatie tussen kernen. Via de Karplus-vergelijking kan de dihedrale hoek tussen protonen worden afgeleid uit ³J-kopplingsconstanten.
De veldsterkte van een NMR-spectrometer wordt uitgedrukt in MHz (resonantiefrequentie van ¹H). Gangbare instrumenten zijn 300 MHz (7,0 T), 400 MHz (9,4 T), 500 MHz (11,7 T) en 600 MHz (14,1 T). Hogere veldsterkte geeft betere dispersie van signalen (betere resolutie) en hogere gevoeligheid. Superconductende magneten worden gekoeld met vloeibaar helium (4 K) en vloeibaar stikstof (77 K). Benchtop-NMR-instrumenten (60–80 MHz, permanente magneet) zijn beschikbaar voor routinecontrole en onderwijs zonder cryogene koeling.
NMR-monsters worden opgelost in deuterium-gesubstitueerde oplosmiddelen om het proton-achtergrond-signaal te elimineren. Gangbare deuterium-oplosmiddelen zijn:
De twee meest gebruikte NMR-experimenten in de routinepraktijk verschillen sterk in gevoeligheid en informatiewaarde. ¹H-NMR maakt gebruik van de hoge natuurlijke abundantie van waterstof (vrijwel 100 %) en de grote gyromagnetische verhouding van het proton, waardoor een meting binnen enkele minuten een goede signaal-ruisverhouding oplevert. Het spectrum toont chemische verschuivingen, multipliciteit door J-koppeling en integralen die de relatieve aantallen protonen weergeven. ¹³C-NMR detecteert het koolstofskelet van een molecuul, maar ¹³C komt van nature slechts in 1,1 % van alle koolstofatomen voor en heeft bovendien een lagere gyromagnetische verhouding. Hierdoor is ¹³C-NMR ongeveer 6000 keer minder gevoelig dan ¹H-NMR en zijn aanzienlijk langere meettijden of grotere monsterhoeveelheden nodig. In de praktijk worden beide technieken complementair ingezet: ¹H-NMR voor snelle identificatie en kwantificering, ¹³C-NMR voor bevestiging van het koolstofskelet, vaak ondersteund door de 2D-technieken HSQC en HMBC die de twee kernen aan elkaar koppelen.
Eén-dimensionale ¹H- en ¹³C-NMR geven basisinformatie. Tweedimensionale technieken correleren twee frequentie-assen en geven connectiviteitsinformatie:
NMR is de primaire methode voor de bevestiging van de structuur van gesynthetiseerde verbindingen. In combinatie met massaspectrometrie (MS) en IR vormt NMR de complete analytische trilogie voor structuuridentificatie van onbekende verbindingen.
Structuurbevestiging van API’s conform Ph.Eur. en ICH-richtlijnen, zuiverheidscontrole via kwantitatieve NMR (qNMR, met interne standaard), metabolietenidentificatie in ADME-studies, en conformatieonderzoek van biologische macromoleculen (antilichamen, RNA-therapeutica).
Herkomstbepaling van honing, olijfolie en wijn via NMR-profilometry in combinatie met chemometrie is een erkende methode voor authenticiteitscontrole (EUREF NMR-database). Vochtgehalte, vetsamenstelling en additievenscreening in verwerkte levensmiddelen.
Tacticiteitsbepaling (isotactisch, syndiotactisch, atactisch) van polyolefinen en acrylaten via ¹H of ¹³C-NMR, copolymeersamenstelling, eindgroepbepaling bij laagmoleculaire oligomeren en blocklengtekarakterisering.
Voor functionele-groepsanalyse zonder uitgebreide voorbereiding is FTIR-spectroscopie een sneller alternatief. Concentratiebepaling van verbindingen in oplossing gaat eenvoudiger via UV/Vis-spectrofotometrie. Elementanalyse voor metalen in monsters wordt uitgevoerd via AAS of ICP-MS/ICP-OES.
Voor een standaard ¹H-NMR op een 300–400 MHz instrument is typisch 5–20 mg monster voldoende opgelost in 0,6 ml deuterium-oplosmiddel. Voor ¹³C-NMR is meer materiaal nodig (20–50 mg) of een langere meettijd vanwege de lage natuurlijke abundantie van ¹³C (1,1 %). Cryoprobes verlagen de detectiegrens aanzienlijk en zijn geschikt voor sub-milligram hoeveelheden.
Een routine ¹H-NMR-spectrum is doorgaans binnen 2 tot 10 minuten gemeten, afhankelijk van de gewenste signaal-ruisverhouding en het aantal scans. Een ¹³C-NMR-spectrum vraagt door de lage gevoeligheid van de kern vaak 20 minuten tot enkele uren, afhankelijk van de monsterconcentratie. 2D-experimenten zoals COSY, HSQC en HMBC nemen door de extra frequentie-as en het grotere aantal benodigde scans typisch 15 minuten tot enkele uren in beslag. Bij zeer verdunde monsters of bij gebruik van minder gevoelige kernen zoals ¹³C zonder cryoprobe kan de meettijd verder oplopen.
Nee, NMR-spectroscopie is een niet-destructieve techniek: het monster ondergaat geen chemische verandering tijdens de meting en kan na afloop worden teruggewonnen of opnieuw gemeten worden, bijvoorbeeld onder andere omstandigheden of met een ander 2D-experiment. Dit in tegenstelling tot massaspectrometrie, waarbij het monster wordt geïoniseerd en daardoor verloren gaat. Het enige verlies bij NMR is de verdunning van het monster in het deuterium-oplosmiddel; bij waardevolle of schaarse monsters kan dit oplosmiddel na de meting worden afgedampt om het monster terug te winnen.
NMR-spectroscopie is de analytische techniek zelf: de methode waarmee met behulp van een sterk magneetveld en radiofrequente pulsen informatie wordt verkregen over de chemische structuur van een molecuul. Een NMR-spectrometer is het fysieke instrument waarmee deze techniek wordt uitgevoerd, bestaande uit de supergeleidende magneet, de RF-zender en -ontvanger en de probe waarin het monster wordt geplaatst. De term "spectroscopie" verwijst dus naar de wetenschappelijke methode, terwijl "spectrometer" het apparaat aanduidt waarmee die methode in de praktijk wordt toegepast.
Bij qNMR wordt de integraalverhouding van NMR-pieken gebruikt voor absolute kwantificering zonder externe kalibratie, door toevoeging van een bekende hoeveelheid interne standaard (bijv. dimethylsulfon, maleïnezuur). qNMR geeft gehaltebepalingen met een onzekerheid van 0,5–1,0 % en is erkend door Ph.Eur. (hoofdstuk 2.2.64) als alternatief voor titratie en HPLC voor primaire standaardisatie.
Nee, ondanks de term "nucleair" in de naam komt bij NMR-spectroscopie geen radioactiviteit of ioniserende straling vrij. De techniek meet uitsluitend de magnetische eigenschappen van atoomkernen onder invloed van een sterk magneetveld en een radiofrequente puls, wat een fysisch en chemisch principe is en geen kernreactie. Het belangrijkste praktische aandachtspunt is het sterke statische magneetveld van de supergeleidende magneet: metalen voorwerpen, pacemakers en magnetische opslagmedia moeten op afstand van het instrument blijven, en de cryogene koelmiddelen (vloeibaar helium en vloeibaar stikstof) vereisen voorzichtigheid vanwege verstikkingsgevaar bij gasvorming in een afgesloten ruimte. Dit verklaart ook waarom in de geneeskunde bewust voor de term MRI is gekozen in plaats van NMR, om verwarring met kernenergie te voorkomen — zie de vergelijkingstabel verderop in dit artikel.
NMR (Nuclear Magnetic Resonance) en MRI (Magnetic Resonance Imaging) zijn gebaseerd op hetzelfde fysische principe — de resonantie van atoomkernen in een sterk magneetveld — maar dienen een fundamenteel ander doel:
De term MRI werd in de jaren tachtig ingevoerd als patiëntvriendelijker alternatief voor "NMR-beeldvorming". In medische context wordt nooit over NMR gesproken; in analytisch-chemische context nooit over MRI. De fysica is in beide gevallen identiek: uitlijning van ¹H-kernen in een magneetveld, excitatie met een RF-puls en meting van het relaxatiesignaal.
Voor NMR-buisjes en overig laboratoriumglaswerk, bekijk ons assortiment vials & flacons of neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw toepassing.
Voor een snelle, niet-destructieve screening van de secundaire eiwitstructuur in waterige oplossing is circulair dichroïsme (CD)-spectroscopie een complementaire methode naast NMR: CD vereist slechts microgrammen eiwit en geeft binnen minuten een indicatie van het alfa-helix- en bèta-sheetgehalte.
Onderdeel van: Farmaceutisch lab
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
