Analytische ultracentrifugatie (AUC) is een biofysische methode waarbij de sedimentatie van macromoleculen tijdens het draaien zelf optisch wordt gevolgd. Waar een preparatieve ultracentrifuge is bedoeld om fracties te pelleteren voor verdere verwerking, meet een analytische ultracentrifuge de concentratieverdeling in de meetcel als functie van de radiële positie en de tijd. Uit die meting worden absolute grootheden bepaald: de sedimentatiecoëfficiënt (S, Svedberg), de diffusiecoëfficiënt (D), de molmassa (M) en de stoichiometrie van reversibele associaties. Dit artikel behandelt het meetprincipe, de twee hoofdexperimenten (sedimentation velocity en sedimentation equilibrium), de detectiesystemen, de monstervoorbereiding en de plaats van AUC ten opzichte van SEC, DLS, MALS en native MS.
Bij analytische ultracentrifugatie wordt een oplossing van macromoleculen in een dubbele sectorcel geplaatst in een rotor die onder vacuüm draait bij 3.000 tot 60.000 rpm, met centrifugale versnellingen tot circa 250.000 ×g. Terwijl de rotor draait, tast een optisch systeem de cel radieel af en registreert het concentratieprofiel c(r, t). Uit de vorm en de verplaatsing van dit profiel worden fysische parameters berekend die direct verband houden met de grootte, de vorm en de interacties van de opgeloste deeltjes.
De methode is ontwikkeld door Theodor Svedberg vanaf 1923 (Nobelprijs Chemie 1926). De eenheid van de sedimentatiecoëfficiënt is naar hem vernoemd: 1 svedberg (S) = 10−13 seconde. De Svedberg-vergelijking legt het verband tussen sedimentatiecoëfficiënt, diffusiecoëfficiënt en molmassa: M = (S · R · T) / (D · (1 − v̄ρ)), waarbij v̄ het partiële specifieke volume van het macromolecuul en ρ de dichtheid van het oplosmiddel is.
Beide technieken gebruiken vergelijkbare rotorsnelheden, maar het doel verschilt. Bij preparatieve ultracentrifugatie is de scheiding zelf het eindproduct: fracties worden gepelleteerd, gebandeerd in een dichtheidsgradiënt (sucrose, CsCl, Percoll) of geïsoleerd voor verdere analyse. De samenstelling wordt achteraf gemeten, buiten de centrifuge. Bij analytische ultracentrifugatie is de meting zelf het eindproduct: de sedimentatie wordt in situ optisch gevolgd en het monster hoeft na afloop niet te worden bewerkt. De cellen zijn transparant (kwartsvensters), de rotor is voorzien van referentie- en monsterposities en het detectiesysteem meet door de roterende rotor heen.
Een moderne analytische ultracentrifuge bevat vier hoofdcomponenten:
Figuur 1 — Boven: sectorcel met meniscus, sedimentatieboundary en plateau. Onder: verplaatsing van de boundary bij t1 < t2 < t3. De radiële positie van het midden van de boundary levert de sedimentatiecoëfficiënt; de verbreding levert de diffusiecoëfficiënt.
Bij een sedimentation-velocity-experiment (SV) wordt de rotor op hoge snelheid gebracht (typisch 40.000–60.000 rpm voor eiwitten van 10–500 kDa) en wordt de cel elke 30–90 seconden radieel gescand. In elk scan verschijnt een moving boundary: de overgangszone tussen de door macromoleculen verlaten regio nabij de meniscus en het onveranderde plateau. Het midden van deze boundary verplaatst zich met een snelheid dr/dt die evenredig is met het lokale centrifugaalveld ω²r. Daaruit volgt:
S = (dr/dt) / (ω² · r)
De sedimentatiecoëfficiënt S wordt gecorrigeerd voor bufferviscositeit en -dichtheid ten opzichte van water bij 20 °C, waarna de gestandaardiseerde waarde s20,w wordt gerapporteerd. Voor een typisch bolvormig eiwit ligt s20,w tussen 1 en 20 S; ribosomale subunits bereiken 30–70 S; virionen 100–1000 S.
De verbreding van de boundary tijdens de run levert de translationele diffusiecoëfficiënt D. Software zoals SEDFIT (c(s)-analyse, Peter Schuck) modelleert het volledige radiële profiel over de tijd met een numerieke oplossing van de Lamm-vergelijking en genereert een sedimentatiecoëfficiëntverdeling c(s) die opgeloste componenten scheidt met een resolutie die vergelijkbaar is met een chromatografische scheiding — echter zonder kolom en zonder verdunning.
Bij een sedimentation-equilibrium-experiment (SE) draait de rotor bij een lagere snelheid (5.000–20.000 rpm) totdat sedimentatie en terug-diffusie elkaar in evenwicht houden. Er ontstaat een tijdsonafhankelijk exponentieel concentratieprofiel, waarbij de logaritme van de concentratie lineair oploopt met r². De helling levert direct de gewichtsgemiddelde molmassa Mw:
ln c(r) = ln c(r0) + [M(1 − v̄ρ)ω²/(2RT)] · (r² − r0²)
Omdat de bepaling uitsluitend berust op fundamentele fysische grootheden (rotatiesnelheid, temperatuur, dichtheid) is de resulterende molmassa absoluut: er zijn geen kalibratiestandaarden of vormaannames nodig. SE is daarmee de gouden standaard voor de bepaling van de stoichiometrie van reversibele eiwit-eiwit- of eiwit-DNA-complexen. Global-fitting van meerdere meetcellen bij verschillende concentraties en rotorsnelheden levert bovendien de bindingsconstanten (Kd) van monomeer-dimeer-, monomeer-tetrameer- of hogere associaties.
Een monochromator selecteert een golflengte in het bereik 190–800 nm; typisch 280 nm voor aromatische aminozuren, 260 nm voor nucleïnezuren en 220 nm voor peptidebindingen. Het systeem is selectief: een gelabeld component (bijvoorbeeld heemgroep bij 405 nm) kan zichtbaar worden gemaakt in een complexe achtergrond. Zie het achtergrondartikel UV/Vis-spectrofotometrie voor het onderliggende principe (Lambert-Beer).
Twee laserstralen door respectievelijk het monster- en referentiecompartiment worden gecombineerd tot een interferentiepatroon dat de brekingsindexverschillen registreert. De methode is niet chromofoorafhankelijk en is bijzonder geschikt voor eiwitten zonder aromatische aminozuren, koolhydraten en polymeren die niet in de UV absorberen. Signaal ~ dn/dc · c; typische gevoeligheid 0,1 mg/ml.
Een fluorescentiedetector (AU-FDS, aangeboden door Aviv Biomedical) meet zeer verdunde monsters (tot enkele nanomolair) via intrinsieke tryptofaanfluorescentie of via een gekoppeld fluorofoor. Zie het artikel fluorescentie-spectroscopie voor het meetprincipe. Fluorescentiedetectie maakt AUC toepasbaar op fluorescent gelabelde eiwitten in celextracten en serum, waar UV-absorptie door achtergrondeiwitten onbruikbaar zou zijn.
AUC is een van de weinige methoden die oplosbare eiwitaggregaten kwantificeren zonder kolommatrixinteractie of verdunning van het monster. De sedimentatiecoëfficiëntverdeling c(s) scheidt monomeer, dimeer, hogere oligomeren en subzichtbare aggregaten simultaan in één run. AUC wordt daarom door regulatoire instanties (FDA, EMA) geaccepteerd als orthogonale methode naast grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC) bij de karakterisering van monoklonale antilichamen (mAbs), fusie-eiwitten en antibody-drug conjugates (ADC's).
Voor monomeer-dimeer- of hogere associatie-evenwichten is SE de referentietechniek. Global-fitting van meerdere concentraties levert de dissociatieconstante Kd in het bereik 10−9 tot 10−3 M. In tegenstelling tot Surface Plasmon Resonance (SPR) is er geen immobilisatie of label vereist en verloopt de meting in vrije oplossing bij fysiologisch relevante buffers.
De sedimentatiecoëfficiënt is de historische en nog steeds de gangbare identificator voor ribosomale subunits (30S, 50S, 70S; 40S, 60S, 80S). AUC karakteriseert virusdeeltjes (leeg vs vol capside bij AAV-gentherapie), extracellulaire vesikels en membraaneiwit-detergentcomplexen zonder dat de complexen worden verstoord door drukverschillen of verdunning op een kolom.
Voor plasmiden, mRNA en siRNA-formuleringen levert AUC bij 260 nm de conformatieverdeling (superhelicaal, circulair, lineair) en de aggregatiestatus. Bij lipide-nanopartikels voor mRNA-vaccins wordt AUC ingezet naast dynamische lichtverstrooiing (DLS) en DSC voor biomoleculen om de deeltjesheterogeniteit en de encapsulatie-efficiëntie te karakteriseren.
De monster- en referentiebuffer moeten identiek zijn in samenstelling, pH en zoutsterkte. Bufferuitwisseling via dialyse of ontzoutingskolom vóór de meting voorkomt basislijnartefacten in de interferentiemodus. Verwijder deeltjes en luchtbellen door filtratie over een 0,2 µm spuitfilter of door zachte centrifugering. Bepaal het partiële specifieke volume v̄ uit de aminozuursamenstelling (SEDNTERP-software) of experimenteel via densitometrie. De dichtheid en viscositeit van de buffer worden eveneens berekend of gemeten voor correctie naar s20,w.
In de praktijk worden deze methoden orthogonaal ingezet: AUC bevestigt onafhankelijk wat SEC-MALS suggereert, en detecteert reversibele associaties die op een kolom in monomeer terugvallen.
Ultracentrifugatie is centrifugatie bij zeer hoge rotatiesnelheden (60.000 tot 150.000 rpm) en centrifugale versnellingen tot circa 1.000.000 ×g, doorgaans onder vacuüm om luchtwrijving en warmteontwikkeling te elimineren. De techniek maakt scheiding en analyse mogelijk van deeltjes die bij lagere g-krachten niet sedimenteren: ribosomen, virussen, lipoproteïnen, membraanfracties en macromoleculen in oplossing. In de preparatieve variant is het doel om fracties te isoleren; in de analytische variant wordt de sedimentatie tijdens het draaien optisch gemeten om sedimentatiecoëfficiënt, molmassa en associatiegedrag te bepalen.
AUC is de aangewezen methode wanneer een matrixvrije meting nodig is, wanneer reversibele associaties onder fysiologische bufferomstandigheden moeten worden gekarakteriseerd, of wanneer een absolute molmassa zonder kalibratiestandaard vereist is. Concreet: bij eiwitten die op een SEC-kolom adsorberen of verdunnen, bij monomeer-dimeer-evenwichten met Kd in het micromolaire bereik, bij regulatoire dossiers die een orthogonale methode naast SEC eisen, en bij de karakterisering van AAV-capsiden (leeg versus vol) of virus- en vesikelpreparaten. Voor routinematige zuiverheids- en aggregaatscreening met hoge doorvoer blijft SEC-MALS de eerste keuze.
Bij preparatieve ultracentrifugatie worden drie werkwijzen onderscheiden. Differentiële centrifugatie scheidt sequentieel op sedimentatiesnelheid door de rotorsnelheid stapsgewijs te verhogen; grote deeltjes pelleteren eerst, kleinere in latere stappen. Rate-zonal centrifugatie plaatst het monster als smalle band bovenop een voorgevormde dichtheidsgradiënt (bijvoorbeeld 5–20% sucrose); componenten migreren als afzonderlijke zones op basis van hun sedimentatiecoëfficiënt en de run wordt gestopt vóórdat de zones de bodem bereiken. Isopycnische centrifugatie gebruikt een steilere gradiënt (CsCl, Nycodenz) waarin deeltjes migreren tot hun zwevende dichtheid; scheiding gebeurt uitsluitend op basis van zwevende dichtheid en is onafhankelijk van de looptijd. Zie voor achtergrond het artikel Over laboratorium centrifuges.
In de biologie en biochemie is ultracentrifugatie een kerntechniek voor het isoleren en karakteriseren van subcellulaire structuren en macromoleculen: ribosomale subunits (30S, 50S, 70S bij prokaryoten; 40S, 60S, 80S bij eukaryoten), mitochondriën en microsomen, plasmamembraanfracties, exosomen en extracellulaire vesikels, virale kapsiden, plasmide-DNA en eiwitcomplexen. De sedimentatiecoëfficiënt in svedberg-eenheden is historisch de identificator van deze deeltjes en wordt vandaag de dag met analytische ultracentrifugatie snel en absoluut bepaald.
Nee. Een gascentrifuge voor uraniumverrijking scheidt de gasvormige isotopen 235UF6 en 238UF6 op basis van massa-verschil in een langgerekte, zeer snel draaiende rotor. Het is een preparatieve techniek in de gasfase voor de nucleaire industrie. Analytische ultracentrifugatie meet daarentegen opgeloste macromoleculen — eiwitten, nucleïnezuren, virussen, nanodeeltjes — in vloeibare oplossing, met optische detectie tijdens de run. Instrumentatie, doel en toepassingsdomein zijn volledig verschillend; alleen de naam “centrifuge” is gedeeld.
Bij preparatieve ultracentrifugatie is het doel om fracties (pellets of banden) uit een monster te isoleren voor verdere verwerking; de analyse gebeurt achteraf, buiten de centrifuge. Bij analytische ultracentrifugatie wordt de sedimentatie tijdens het draaien optisch gevolgd en worden sedimentatiecoëfficiënten, molmassa's en associatie-evenwichten direct berekend uit het radiële concentratieprofiel. De rotor draait onder vacuüm, de cellen zijn transparant en het monster hoeft na afloop niet te worden bewerkt.
Een svedberg is de eenheid van de sedimentatiecoëfficiënt en is gedefinieerd als 10−13 seconde. Hij is genoemd naar Theodor Svedberg, de ontwikkelaar van de ultracentrifuge. De sedimentatiecoëfficiënt S wordt bepaald uit de verplaatsing van het midden van de sedimentatieboundary in de tijd, gedeeld door het lokale centrifugaalveld ω²r. Correctie naar standaardomstandigheden (water, 20 °C) levert de gerapporteerde waarde s20,w. Typische waarden: bolvormige eiwitten 1–20 S, ribosomale subunits 30–70 S, virussen 100–1000 S.
De Svedberg-vergelijking legt het verband tussen de sedimentatiecoëfficiënt S, de translationele diffusiecoëfficiënt D en de molmassa M: M = (S · R · T) / (D · (1 − v̄ρ)), waarbij R de gasconstante, T de absolute temperatuur, v̄ het partiële specifieke volume en ρ de dichtheid van het oplosmiddel is. Uit één SV-experiment worden S en D bepaald; combinatie via de Svedberg-vergelijking geeft M zonder externe kalibratiestandaard.
SEC-MALS is sneller en heeft een hogere doorvoer en is daarom de eerste keuze voor routinekarakterisering. AUC geeft de doorslag wanneer een matrixvrije methode nodig is: bij reversibele associaties die op een kolom in monomeer dissociëren, bij eiwitten die op de kolom adsorberen, bij verdunning die aggregaten uiteenvalt of bij regulatoire onderbouwing waarbij een tweede, orthogonale methode wordt geëist naast SEC.
Standaard sectorcellen hebben een monstervolume van 400–450 µl per cel. Bij absorptiedetectie op 280 nm ligt de werkbare concentratie tussen 0,05 en 2 mg/ml (afhankelijk van de extinctiecoëfficiënt); interferentie werkt bij 0,2 tot 10 mg/ml; fluorescentiedetectie bereikt lagere concentraties tot enkele nanomolair. Voor een sedimentation-equilibrium-experiment met global fitting worden meestal 3–6 concentraties parallel gemeten.
Bij sedimentation velocity draait de rotor op hoge snelheid en wordt de verplaatsing van de sedimentatieboundary in de tijd gevolgd. De methode levert de sedimentatiecoëfficiëntverdeling c(s), waarmee componenten worden onderscheiden en gekwantificeerd. Bij sedimentation equilibrium draait de rotor op een lagere snelheid tot sedimentatie en diffusie in evenwicht zijn. Het resulterende tijdsonafhankelijke exponentiële profiel levert een absolute molmassa en de bindingsconstante van reversibele associaties.
Ja, mits gebruik wordt gemaakt van detergent-matched buffers waarin de dichtheid van de vrije detergentmicellen exact overeenkomt met die van de detergentschil rond het eiwit (zogeheten "density matching" met H2O/D2O of sucrose). Daarmee wordt de bijdrage van het detergent aan v̄ effectief nul en meet AUC de eiwitmassa zonder detergent. Nanodisc- of amphipol-preparaten kunnen op vergelijkbare wijze worden gekarakteriseerd.
SEDFIT en SEDPHAT (ontwikkeld door Peter Schuck, NIH) zijn de meest gebruikte pakketten voor c(s)-analyse en global fitting van SE-data. ULTRASCAN en HeteroAnalysis zijn alternatieven. SEDNTERP wordt gebruikt om v̄, bufferdichtheid en -viscositeit uit de samenstelling te berekenen. Deze programma's zijn academisch en in de meeste gevallen kosteloos beschikbaar.
De sedimentatiecoëfficiënt is via de Svedberg-vergelijking en de Stokes-Einstein-relatie gekoppeld aan de hydrodynamische straal Rh: hoe groter en langgerekter het molecuul, hoe lager de S bij een gegeven massa. De f/f0-ratio (frictieverhouding) leidt uit S en D af hoezeer het molecuul afwijkt van een compacte bol. Waarden dicht bij 1,2 wijzen op een compacte globulaire structuur; waarden boven 1,5 op een uitgerekte of intrinsiek ongestructureerde vorm. Een onafhankelijke bepaling van Rh via dynamische lichtverstrooiing is een gebruikelijke orthogonale controle.
SEC gebruikt een gepakte kolom met een molecuulgewichtsafkap; grote aggregaten kunnen in het voorfilter of aan de kolomtop achterblijven en dan buiten de kwantificering vallen. AUC meet in vrije oplossing zonder matrix: elk sedimenterend deeltje draagt bij aan de c(s)-verdeling. Bovendien wordt bij SEC het monster verdund tijdens de scheiding, wat reversibele aggregaten kan doen dissociëren; bij AUC blijft de startconcentratie behouden in de plateauzone van de cel.
Nee. De methode is niet-destructief: na afloop van de meting kan het monster uit de cel worden gehaald en hergebruikt. Bij eiwitten kan de langdurige blootstelling aan hoge g-krachten en Peltier-koeling wel aanleiding geven tot lichte denaturatie of aggregatie, wat door kortere runs of gebruik van stabilisatoren (glycerol, arginine) wordt geminimaliseerd.
Analytische ultracentrifugatie maakt deel uit van het biofysische karakteriseringspakket voor macromoleculen. Voor de bepaling van de absolute molmassa in flow wordt SEC/GPC met MALS-detectie ingezet. Voor de hydrodynamische straal en polydispersiteit in kleine volumes is DLS en zeta-potentiaal de complementaire techniek. Voor de intacte massa en stoichiometrie in de gasfase levert native mass spectrometry Da-precisie op complexen. Voor subzichtbare aggregaten en virusachtige deeltjes boven 50 nm biedt veld-vloeistoffractionering (FFF/AF4) een kolomloze scheiding. Conformationele informatie op secundaire-structuurniveau wordt verkregen via circulair dichroïsme (CD), en thermodynamische stabiliteit via DSC voor biomoleculen. Voor kinetische parameters van biomoleculaire interacties is Surface Plasmon Resonance (SPR) een label-vrije alternatieve techniek. Voor het algemene principe van sedimentatie in het lab en de rotorindeling zie het artikel Over laboratorium centrifuges.
Bent u op zoek naar geschikte centrifugebuizen of verbruiksartikelen voor uw preparatieve of analytische scheiding? Bekijk het assortiment centrifugebuizen en laboratorium centrifuges, of neem contact op voor advies over de juiste opstelling voor uw toepassing.
Disclaimer: dit artikel is opgesteld op basis van gangbare wetenschappelijke kennis over analytische ultracentrifugatie. De genoemde snelheden, celvolumes en parameterbereiken zijn indicatief en kunnen afwijken afhankelijk van instrument, cel-type, monster en toepassing. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor beslissingen genomen op basis van deze informatie. Raadpleeg voor regulatoire toepassingen altijd de actuele richtlijnen van EMA, FDA of ICH en de documentatie van instrument- en softwareleverancier.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
