Surface plasmon resonance (SPR) is een optische biosensortechniek waarmee moleculaire interacties in real time en zonder labels worden gevolgd aan het oppervlak van een dun goudlaagje. De methode levert niet alleen informatie over de vraag óf twee moleculen aan elkaar binden, maar ook hoe snel die binding tot stand komt, hoe snel ze weer uiteenvalt en hoe sterk de uiteindelijke affiniteit is. Daarmee maakt SPR het mogelijk om associatie- en dissociatiesnelheidsconstanten (ka en kd) en de evenwichtsaffiniteitsconstante (KD) in één experiment te bepalen. SPR is onmisbaar in geneesmiddelonderzoek, biofarmaceutische kwaliteitscontrole en fundamenteel biochemisch onderzoek naar eiwitinteracties, receptorbinding en antilichaamkarakterisering.
SPR berust op het verschijnsel van oppervlakplasmonresonantie. Wanneer gepolariseerd licht onder een specifieke invalshoek (de resonantiehoek) een dun goudlaagje raakt via een prisma, worden vrije elektronen in het goud collectief in trilling gebracht. Er ontstaat een zogenaamd evanescent veld dat enkele honderden nanometer boven het goudoppervlak uitsteekt. De resonantiehoek is gevoelig voor veranderingen in de brekingsindex direct aan het oppervlak. Wanneer een molecuul bindt aan het oppervlak, neemt de lokale massa toe, verandert de brekingsindex en verschuift de resonantiehoek meetbaar. Deze verschuiving wordt uitgedrukt in resonantie-eenheden RU (response units); 1 RU correspondeert met een massaverandering van circa 1 pg/mm².
In een typisch SPR-experiment wordt een ligand — het zogeheten immobilisatiecomponent — covalent of niet-covalent gekoppeld aan het oppervlak van een sensorchip. Een analist (de te meten interactiepartner) wordt vervolgens in gedefinieerde concentraties over het oppervlak geleid. Het SPR-instrument registreert het signaal continu als functie van de tijd. De resulterende curve — het sensogram — bestaat uit een associatiefase (stijgend signaal), een evenwichtsfase en een dissociatiefase (dalend signaal na het wisselen naar bufferoplossing). Door sensogrammen bij meerdere analytconcentraties te meten en globaal te fitten met een bindingsmodel, worden ka, kd en KD berekend.
De sensorchip vormt het hart van de meting. De meest gebruikte chips zijn voorzien van een dextranmatrix waaraan carboxylgroepen zijn gekoppeld. Via NHS/EDC-koppelingschemie (N-hydroxysuccinimide/1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) worden aminogroepen van het ligandmolecuul covalent gebonden. Andere koppelingsstrategieën omvatten:
De keuze van de koppelingschemie beïnvloedt de oriëntatie van het ligand en daarmee de toegankelijkheid van het bindingsgebied voor de analist. Een verkeerde oriëntatie kan leiden tot schijnbaar lage bindingsresponsen of afwijkende kinetiekparameters.
De eerste commercieel beschikbare SPR-instrumenten werden in de vroege jaren negentig van de twintigste eeuw geïntroduceerd door Pharmacia Biosensor AB, later overgenomen door Cytiva. De Biacore-productlijn is sindsdien de meest gebruikte instrumentfamilie in farmaceutisch en biochemisch onderzoek. Moderne Biacore-systemen zijn in staat om meerdere kanalen parallel te meten, werken met microfluidische flowcellen en bereiken detectielimieten tot in het picomolaire bereik voor systemen met hoge affiniteit.
Naast Biacore zijn er inmiddels meerdere SPR-platforms op de markt van fabrikanten als Bruker (Sierra SPR), Carterra (LSA, voor hoge-throughputkarakterisering van antilichamen op arraychips) en Bio-Rad (ProteOn). Deze systemen verschillen in doorvoer, vloeistofbeheersing, detectiegevoeligheid en de aard van de sensorchip. Eenvoudigere benchtop-instrumenten zijn beschikbaar voor routinematige kwaliteitscontrole van antilichaamproducties.
Bij SPR-imaging (SPRi) wordt een CCD-camera gebruikt om het SPR-signaal over een groot oppervlak simultaan in kaart te brengen. Dit maakt het mogelijk om honderden ligandenspots parallel te bevragen met één analytinjectie. SPRi is geschikt voor high-throughput screening van antilichaambibliotheken, epitoopkartering en multiplexanalyse van kleine moleculen.
Uit de fitting van sensogrammen worden de volgende parameters afgeleid:
Het onderscheid tussen ka en kd is farmacologisch relevant: twee geneesmiddelkandidaten met dezelfde KD kunnen sterk verschillen in hun klinisch gedrag wanneer de ene snel dissocieert (hoge kd) en de andere langzaam (lage kd). De verblijftijd (1/kd) correleert in veel gevallen beter met de farmacodynamische werkingsduur dan KD alleen.
De eenvoudigste beschrijving van een SPR-experiment is het 1:1 Langmuir-bindingsmodel, waarbij één analist reversibel bindt aan één ligandsite. Dit model geldt wanneer aan een aantal voorwaarden is voldaan: de binding is omkeerbaar, er is geen rebinding tijdens de dissociatiefase, er is geen massetransportlimitatie en het systeem is homogeen. In de praktijk worden de volgende complicaties regelmatig aangetroffen:
Data-analyse vindt plaats met speciale software (bv. Biacore Insight Evaluation Software, Scrubber of Clamp). Globale fitting over meerdere analytconcentraties geeft betrouwbaardere parameters dan afzonderlijke fitting per concentratie. Residuenanalyse en de chi²-waarde geven aan hoe goed het model past bij de data.
SPR is de standaardmethode voor de karakterisering van kleine moleculen (small molecules) die binden aan therapeutische doelwitten zoals kinases, G-eiwit-gekoppelde receptoren en proteases. In de vroege fase van geneesmiddelinnovatie worden fragmentbibliotheken gescreend op binding (fragment-based drug discovery, FBDD). Vervolgens worden veelbelovende fragmenten geoptimaliseerd tot geneesmiddelkandidaten waarbij kd, KD en selectiviteit simultaan worden bewaakt. SPR levert onderbouwde structure-activity relationship (SAR)-data die richting geven aan de medicinale chemie.
Bij de ontwikkeling van therapeutische monoklonale antilichamen is SPR onmisbaar voor epitoopbepaling (epitope binning), isotypering, affiniteitsrangschikking (affinity ranking) en kwaliteitscontrole van batchconsistentie. De combinatie van hoge doorvoer (Carterra LSA of ProteOn) en nauwkeurige kinetische analyse (Biacore) maakt het mogelijk om honderden antilichaamkandidaten te prioriteren vóór doorgang / selectie naar cel- en dierproeven. SPR wordt ook toegepast voor de karakterisering van Fc-receptorbinding, die de in-vivo-activiteitverdeling en halfwaardetijd van antilichamen mede bepaalt.
In fundamenteel biochemisch onderzoek wordt SPR gebruikt om eiwitcomplexen in kaart te brengen, signaaltransductieroutes te ontrafelen en de binding van transcriptiefactoren aan promotorsequenties te kwantificeren. SPR meet snelle en zwakke interacties (KD in het µmol/L-bereik) die met technieken als co-immunoprecipitatie (co-IP) moeilijk aantoonbaar zijn, omdat die laatste sterk verdunde condities en spoelstappen vereisen die complexen van lage affiniteit kunnen dissociëren.
SPR is toepasbaar voor de bestudering van DNA-eiwit- en RNA-eiwitinteracties, de binding van antisense-oligonucleotiden aan hun doelsequenties en de interactie van transcriptiefactoren met promotorelementen. Hierbij worden gestreptavidineerde chips gebruikt waarop biotingelabelde oligonucleotiden worden gecaptured. Het is ook mogelijk om small molecule-DNA-intercalatie te meten, wat relevant is voor de karakterisering van DNA-intercalerende antibiotica of antitumormiddelen.
Virusdeeltjes, bacterieel oppervlakteproteïnen en vaccinkomponenten kunnen met SPR worden gekarakteriseerd op hun binding aan cellulaire receptoren of antilichamen. Geheel virusdeeltjes kunnen op sensorchips worden gebonden voor bindingsstudies met antilichamen of neutraliserende stoffen.
Draagbare SPR-biosensorsystemen worden ingezet voor snelle detectie van pathogenen, toxinen (aflatoxinen, domoïnezuur) en residuen van antibiotica in voedingsproducten. De label-vrije aanpak maakt complexe signaalversterkingsstappen overbodig, wat de robuustheid in buitenlaboratoriumomstandigheden ten goede komt.
SPR heeft een karakteristiek niche in het arsenaal van technieken voor de studie van moleculaire interacties. De tabel vergelijkt SPR met de meest gebruikte alternatieve methoden.
Na de dissociatiefase kan een regeneratiestap nodig zijn om gebonden analist te verwijderen zodat het ligandoppervlak opnieuw gebruikt kan worden. Regeneratiecondities variëren per systeem: hoge zoutconcentraties (1–2 mol/L NaCl), lage pH (glycinebuffer pH 1,5–2,5), hoge pH (NaOH) of milde detergentia worden ingezet. Onjuiste regeneratie leidt tot cumulatief signaalverlies (drift) of partiële liganddenaturatie. Wanneer regeneratie niet mogelijk is, kan gebruik worden gemaakt van een capture-format waarbij het ligand per cyclus opnieuw wordt gecaptured en vervolgens geregenereerd samen met de sensorchip.
Double referencing is een essentieel onderdeel van de data-analyse: het SPR-signaal van een referentiekanaal (zonder ligand of met irrelevant ligand) wordt afgetrokken van het meetkanaal. Vervolgens wordt een blanco-injectie (buffer zonder analist) afgetrokken om instrumentdrift en bulkbrekingsindexverschillen te elimineren.
In biofarmaceutische ontwikkeling is SPR-data nodig voor de onderbouwing van de werkzaamheid en specificiteit van therapeutische antilichamen in dossiers voor EMA en FDA. De Internationale Raad voor Harmonisatie van technische vereisten voor geneesmiddelen voor menselijk gebruik (ICH) verwijst in richtlijnen zoals Q6B naar bindingsassays voor biofarmaceutica. Voor methoden die worden gebruikt in kwaliteitscontrole, is methodevalidatie conform de geldende ICH Q2(R1)-richtlijn voor analytische methoden aangewezen, in het bijzonder wanneer SPR wordt ingezet voor specificatietestdoeleinden.
Bij gebruik in het kader van goede laboratoriumpraktijken (GLP) gelden aanvullende vereisten ten aanzien van instrumentkalibratie, apparatuurkwalificatie en gegevensbeheer conform 21 CFR Part 11 of equivalente Europese regelgeving. Biacore-systemen beschikken over optionele compliance-pakketten die aan deze vereisten tegemoetkomen.
Een succesvolle SPR-meting begint met zorgvuldige optimalisatie van de proefopzet. De volgende stappen zijn bepalend:
SPR maakt deel uit van een bredere familie van biosensortechnieken op basis van oppervlaktegebonden detectie. Biolayer interferometry (BLI, commercieel: Octet van Sartorius) is een alternatieve label-vrije methode waarbij lichtinterferentie aan het uiteinde van een vezelsensor wordt gemeten in een 96-putplaat of 384-putplaat-format. BLI heeft een lagere gevoeligheid dan SPR maar een hogere doorvoer en is eenvoudiger in gebruik. Quartz crystal microbalance (QCM) meet massaveranderingen via frequentieverandering van een trillende kwartskristal; QCM-D voegt dissipatiemeting toe en geeft tevens informatie over de visco-elastische eigenschappen van het gebonden materiaal.
Voor de studie van moleculaire interacties op atomaire schaal is atomaire-krachtsmicroscopie (AFM) een complementaire techniek waarmee bindingskrachten tussen individuele moleculen direct gemeten kunnen worden (force spectroscopy). Voor de karakterisering van de hydrodynamische eigenschappen van eiwitcomplexen in oplossing biedt dynamische lichtverstrooiing (DLS) aanvullende informatie.
Wanneer niet alleen kinetiek maar ook de volledige thermodynamische karakterisering van een interactie nodig is — enthalpie (ΔH), entropie (ΔS) en vrije energie (ΔG) — dan is isothermische titratiecalorimetrie (ITC) de complementaire keuze. ITC vereist geen immobilisatie en meet in oplossing, maar geeft geen informatie over de snelheidsconstanten van de binding.
Voor de detectie van eiwitinteracties in het cellulair milieu in situ zijn chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) voor eiwit-DNA-interacties en co-immunoprecipitatie (co-IP) voor eiwit-eiwitinteracties de gangbare technieken, hoewel die geen directe kinetische informatie leveren.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
