Surface plasmon resonance (SPR) is een optische biosensortechniek waarmee moleculaire interacties in real time en zonder labels worden gevolgd aan het oppervlak van een dun goudlaagje. De methode levert niet alleen informatie over de vraag óf twee moleculen aan elkaar binden, maar ook hoe snel die binding tot stand komt, hoe snel ze weer uiteenvalt en hoe sterk de uiteindelijke affiniteit is. Daarmee maakt SPR het mogelijk om associatie- en dissociatiesnelheidsconstanten (ka en kd) en de evenwichtsaffiniteitsconstante (KD) in één experiment te bepalen. SPR is onmisbaar in geneesmiddelonderzoek, biofarmaceutische kwaliteitscontrole en fundamenteel biochemisch onderzoek naar eiwitinteracties, receptorbinding en antilichaamkarakterisering.
SPR is om twee samenhangende redenen een onmisbare techniek geworden in de levenswetenschappen. Ten eerste levert SPR kinetische informatie die met eindpuntsbepalingen zoals ELISA of radioligand-bindingsassays niet beschikbaar is: de associatie- en dissociatiesnelheidsconstanten worden direct uit het tijdverloop van de binding afgeleid, in plaats van te worden berekend uit evenwichtsmetingen bij vaste tijdpunten. Ten tweede gebeurt dit label-vrij en in real time, waardoor modificatie van de interactiepartner — en de daarmee gepaard gaande risico's van conformatieverandering of labelverlies — worden vermeden. Deze combinatie maakt SPR tot de standaard voor kinetische karakterisering van biologische interacties in de farmaceutische industrie, bij regulatoire indieningen voor nieuwe biofarmaceutica en in fundamenteel biochemisch onderzoek.
Concreet vertelt SPR u vier dingen uit één experiment: of twee moleculen aan elkaar binden, hoe snel die binding tot stand komt (ka), hoe snel het gevormde complex weer uiteenvalt (kd) en hoe sterk de binding in evenwicht is (KD). Geen andere label-vrije techniek levert deze combinatie in real time en uit één meting. Daarmee beantwoordt SPR niet alleen de vraag of een geneesmiddelkandidaat aan zijn doelwit bindt, maar ook of het lang genoeg gebonden blijft voor een farmacologisch effect — informatie die cruciaal is voor lead-optimalisatie en kandidaatselectie.
SPR berust op het verschijnsel van oppervlakplasmonresonantie. Een plasmon is een collectieve, golfvormige oscillatie van de vrije elektronen in een metaaloppervlak. In het geval van SPR worden deze elektronenoscillaties opgewekt aan het grensvlak tussen het goudlaagje en het omringende medium; men spreekt dan van oppervlakplasmon-polaritonen (SPP). Wanneer gepolariseerd licht onder een specifieke invalshoek (de resonantiehoek) een dun goudlaagje raakt via een prisma, koppelt de energie van het invallende licht resonant in met de SPP—de invalshoek waarbij dit gebeurt is de resonantiehoek. Op dit moment wordt het gereflecteerde licht sterk geabsorbeerd, wat meetbaar is als een minimum in de reflectie-intensiteit. Moderne SPR-instrumenten detecteren dit minimum ofwel via hoekscanning (waarbij de invalshoek continu wordt gevarieerd) ofwel via intensiteitsmeting bij een vaste hoek; in beide gevallen vertaalt een verschuiving van het reflectieminimum zich direct in een verandering van de brekingsindex aan het sensorchipoppervlak. Deze verschuiving wordt uitgedrukt in resonantie-eenheden RU (response units); 1 RU correspondeert met een massaverandering van circa 1 pg/mm². Er ontstaat bovendien een zogenaamd evanescent veld dat enkele honderden nanometer boven het goudoppervlak uitsteekt en uitsluitend gevoelig is voor massaveranderingen direct aan het oppervlak.
Het is nuttig onderscheid te maken tussen een surface plasmon en surface plasmon resonance. Een surface plasmon is de fysische entiteit: de collectieve elektronenoscillatie aan het metaaloppervlak die bestaat ongeacht hoe ze wordt opgewekt. Surface plasmon resonance is de specifieke toestand waarbij de golfvector van het invallende licht precies overeenkomt met de golfvector van het oppervlakplasmon, zodat energie-overdracht optreedt en het reflectiesignaal een minimum vertoont. In een biosensor wordt deze resonantietoestand actief opgezocht en bewaakt: elke massaverandering aan het oppervlak verschuift de resonantieconditie meetbaar. Het plasmon is dus het verschijnsel; de resonantie is de meetconditie die van dat verschijnsel gebruik maakt.
De eenheid RU (response unit) is specifiek voor SPR-instrumenten en representeert de hoeveelheid massa die aan het sensorchipoppervlak is gebonden. Een signaalverandering van 1000 RU komt overeen met een massadichtheid van circa 1 ng/mm². Voor eiwitten met een molecuulmassa van 50 kDa ligt een typische bindingsrespons bij 100–500 RU wanneer de immobilisatiedichtheid goed is afgesteld. RU-waarden zijn dimensieloos en instrumentafhankelijk; vergelijking van absolute RU-waarden tussen verschillende SPR-platforms vereist voorzichtigheid.
In een typisch SPR-experiment wordt een ligand — het zogeheten immobilisatiecomponent — covalent of niet-covalent gekoppeld aan het oppervlak van een sensorchip. Een analist (de te meten interactiepartner) wordt vervolgens in gedefinieerde concentraties over het oppervlak geleid. Het SPR-instrument registreert het signaal continu als functie van de tijd. De resulterende curve — het sensogram — bestaat uit een associatiefase (stijgend signaal), een evenwichtsfase en een dissociatiefase (dalend signaal na het wisselen naar bufferoplossing). Door sensogrammen bij meerdere analytconcentraties te meten en globaal te fitten met een bindingsmodel, worden ka, kd en KD berekend.
Het sensogram is de primaire datarepresentatie in SPR en bevat alle informatie over de bindingskinetiek. Een goed sensogram laat een vloeiende, concentratieafhankelijke associatiefase zien die naar een plateau nadert, gevolgd door een reproduceerbare dissociatiefase die terugkeert naar de basislijn. Afwijkingen van dit patroon — zoals een niet-nulbasislijn na dissociatie, biphasisch verloop of onregelmatige pieken — duiden op aviditeitseffecten, massetransportlimitatie of regeneratieproblemen die vóór data-analyse moeten worden opgelost.
De sensorchip vormt het hart van de meting. De meest gebruikte chips zijn voorzien van een dextranmatrix waaraan carboxylgroepen zijn gekoppeld. Via NHS/EDC-koppelingschemie (N-hydroxysuccinimide/1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide) worden aminogroepen van het ligandmolecuul covalent gebonden. Andere koppelingsstrategieën omvatten:
De keuze van de koppelingschemie beïnvloedt de oriëntatie van het ligand en daarmee de toegankelijkheid van het bindingsgebied voor de analist. Een verkeerde oriëntatie kan leiden tot schijnbaar lage bindingsresponsen of afwijkende kinetiekparameters.
De keuze van de sensorchip hangt af van de molecuulklasse en de gewenste koppelingschemie. De CM5-chip (carboxymethyldextran, hoge ligandcapaciteit) is de meest universele keuze voor eiwitten via NHS/EDC-koppeling. De CM3- en CM4-chips hebben een kortere dextranmatrix en zijn geschikt voor grote analisten zoals virusdeeltjes of cellen, waarbij diffusie door een dikke matrix een beperkende factor zou zijn. De SA-chip (streptavidine) is geoptimaliseerd voor biotingelabelde liganden en geeft een homogene oriëntatie. NTA-chips zijn bedoeld voor reversibele capture van his-getagde eiwitten. C1-chips hebben geen dextranmatrix maar een vlak carboxyloppervlak, wat de niet-specifieke binding van lipide- of membraanstructuren vermindert. Bij twijfel over de chiptyp is de CM5 de eerste keuze voor standaard eiwitinteracties.
De eerste commercieel beschikbare SPR-instrumenten werden in de vroege jaren negentig van de twintigste eeuw geïntroduceerd door Pharmacia Biosensor AB, later overgenomen door Cytiva. De Biacore-productlijn is sindsdien de meest gebruikte instrumentfamilie in farmaceutisch en biochemisch onderzoek. Moderne Biacore-systemen zijn in staat om meerdere kanalen parallel te meten, werken met microfluidische flowcellen en bereiken detectielimieten tot in het picomolaire bereik voor systemen met hoge affiniteit.
Naast Biacore zijn er inmiddels meerdere SPR-platforms op de markt van fabrikanten als Bruker (Sierra SPR), Carterra (LSA, voor hoge-throughputkarakterisering van antilichamen op arraychips) en Bio-Rad (ProteOn). Deze systemen verschillen in doorvoer, vloeistofbeheersing, detectiegevoeligheid en de aard van de sensorchip. Eenvoudigere benchtop-instrumenten zijn beschikbaar voor routinematige kwaliteitscontrole van antilichaamproducties.
Bij SPR-imaging (SPRi) wordt een CCD-camera gebruikt om het SPR-signaal over een groot oppervlak simultaan in kaart te brengen, in plaats van één enkel meetkanaal te bevragen. Omdat de camera het volledige chipoppervlak in één opname registreert, kunnen honderden ligandenspots parallel worden bevraagd met één analytinjectie. SPRi is geschikt voor high-throughput screening van antilichaambibliotheken, epitoopkartering en multiplexanalyse van kleine moleculen. De ruimtelijke resolutie is typisch 10–50 µm per pixel, wat voldoende is voor spots van honderden micrometer diameter zoals bij microarraytoepassingen.
Naast SPRi zijn er meerdere technische varianten van de SPR-biosensor in gebruik. Nanohole-arrays vervangen de vlakke goudfilm door een geperforeerde goudfilm; licht transmitteert door de nanogaten en koppelt in met SPP, waardoor meting in transmissie in plaats van reflectie mogelijk is — een voordeel voor integratie in doorstroommicrofluidica. Long-range SPR (LRSPR) maakt gebruik van dunne metaalfilms in een symmetrisch diëlektrisch omhulsel, waardoor het evanescente veld dieper in de oplossing reikt en grote objecten zoals cellen of virusdeeltjes beter detecteerbaar zijn. Coupled plasmon-waveguide resonance (CPWR) combineert een dunne metaalfilm met een diëlektrische golfgeleider en levert naast de brekingsindex ook informatie over de visco-elastische eigenschappen van dun geadsorbeerde lagen, vergelijkbaar met QCM-D.
Uit de fitting van sensogrammen worden de volgende parameters afgeleid:
De kinetische parameters worden afgeleid door de gemeten responsdata te fitten met een mathematisch bindingsmodel. Voor het eenvoudigste geval — het 1:1 Langmuir-model — gelden de volgende vergelijkingen. Tijdens de associatiefase neemt de respons R toe volgens:
dR/dt = ka · C · (Rmax − R) − kd · R
waarbij C de analytconcentratie is (mol/L) en Rmax de maximale bindingscapaciteit van het oppervlak (RU). Tijdens de dissociatiefase (C = 0) geldt:
dR/dt = −kd · R
De dissociatiefase levert daarmee direct kd op als de helling van de logaritmische afname van R in de tijd. Vervolgens wordt ka bepaald uit de associatiefase, waarbij kd al bekend is. De evenwichtsaffiniteitsconstante volgt dan rechtstreeks uit de verhouding:
KD = kd / ka
In de praktijk wordt de fitting niet per concentratie afzonderlijk uitgevoerd, maar globaal over alle sensogrammen tegelijk (globale fitting). Daardoor worden ka en kd simultaan geoptimaliseerd over de volledige concentratiereeks, wat de statistische betrouwbaarheid van de parameters aanzienlijk verhoogt. Speciale evaluatiesoftware — zoals Biacore Insight Evaluation Software, Scrubber of Clamp — lost de differentiaalvergelijkingen numeriek op en rapporteert de parameters met bijbehorende standaardfouten en de chi²-waarde als kwaliteitsindicator voor de fit.
De interpretatie van SPR-resultaten verloopt in drie stappen. Ten eerste wordt de kwaliteit van het sensogram beoordeeld: een betrouwbaar sensogram toont een vloeiende, concentratieafhankelijke associatiefase die naar een plateau nadert, een stabiele evenwichtsfase en een reproduceerbare dissociatiefase die terugkeert naar de basislijn. Een niet-nulbasislijn na dissociatie wijst op onvolledige regeneratie of irreversibele binding; een biphasisch verloop duidt op heterogeniteit of massetransportlimitatie. Ten tweede worden de gefitte kinetische parameters beoordeeld op plausibiliteit: ka-waarden boven circa 107 M−1s−1 wijzen mogelijk op massetransportlimitatie; kd-waarden die nauwelijks afwijken van nul wijzen op een te korte dissociatiefase of zeer hoge affiniteit. Ten derde wordt de biologische betekenis van KD in context geplaatst: voor therapeutische antilichamen worden KD-waarden in het nanomolaire tot picomolaire bereik als farmacologisch relevant beschouwd, terwijl zwakke eiwitinteracties in signaaltransductieroutes typisch in het micromolaire bereik liggen. Een lage chi²-waarde en vlakke residuenplot bevestigen dat het gekozen bindingsmodel de data adequaat beschrijft.
KD en kd worden regelmatig verward maar beschrijven fundamenteel verschillende aspecten van een binding. KD (de evenwichtsaffiniteitsconstante, uitgedrukt in mol/L) geeft aan hoe sterk twee moleculen aan elkaar binden in thermodynamisch evenwicht: een lagere KD betekent een hogere affiniteit. kd (de dissociatiesnelheidsconstante, uitgedrukt in s−1) geeft aan hoe snel een eenmaal gevormd complex uiteenvalt, ongeacht de concentratie van de bindingspartners. De verblijftijd — de gemiddelde tijd dat een complex intact blijft — is gelijk aan 1/kd. Twee geneesmiddelkandidaten met identieke KD-waarden kunnen sterk uiteenlopen in kd: de kandidaat met een lage kd blijft langer gebonden en heeft daardoor in veel gevallen een langduriger farmacodynamisch effect, ook al is de gemiddelde affiniteit gelijk.
Het onderscheid tussen ka en kd is farmacologisch relevant: twee geneesmiddelkandidaten met dezelfde KD kunnen sterk verschillen in hun klinisch gedrag wanneer de ene snel dissocieert (hoge kd) en de andere langzaam (lage kd). De verblijftijd (1/kd) correleert in veel gevallen beter met de farmacodynamische werkingsduur dan KD alleen.
SPR-data-analyse verloopt in een vaste volgorde die voorafgaat aan de eigenlijke kinetische fitting.
De eenvoudigste beschrijving van een SPR-experiment is het 1:1 Langmuir-bindingsmodel, waarbij één analist reversibel bindt aan één ligandsite. Dit model geldt wanneer aan een aantal voorwaarden is voldaan: de binding is omkeerbaar, er is geen rebinding tijdens de dissociatiefase, er is geen massetransportlimitatie en het systeem is homogeen. In de praktijk worden de volgende complicaties regelmatig aangetroffen:
Data-analyse vindt plaats met speciale software (bv. Biacore Insight Evaluation Software, Scrubber of Clamp). Globale fitting over meerdere analytconcentraties geeft betrouwbaardere parameters dan afzonderlijke fitting per concentratie. Residuenanalyse en de chi²-waarde geven aan hoe goed het model past bij de data.
SPR is de standaardmethode voor de karakterisering van kleine moleculen (small molecules) die binden aan therapeutische doelwitten zoals kinases, G-eiwit-gekoppelde receptoren en proteases. In de vroege fase van geneesmiddelinnovatie worden fragmentbibliotheken gescreend op binding (fragment-based drug discovery, FBDD). Vervolgens worden veelbelovende fragmenten geoptimaliseerd tot geneesmiddelkandidaten waarbij kd, KD en selectiviteit simultaan worden bewaakt. SPR levert onderbouwde structure-activity relationship (SAR)-data die richting geven aan de medicinale chemie.
SPR is inherent gebaseerd op massaverandering aan het sensorchipoppervlak; kleine moleculen met een molecuulmassa onder circa 500 Da genereren een beperkte RU-respons, wat de detectie uitdagender maakt dan bij grote eiwitten. Er zijn echter meerdere strategieën beschikbaar om de gevoeligheid te verhogen. Bij een competitief of displacement-format wordt de kleine molecuul niet direct gemeten maar via de verdrijving van een groter referentie-eiwit van het chipoppervlak. Signaalversterking met secundaire antilichamen of nanopartikels is een andere optie. Fragmentscreening (FBDD) slaagt in de praktijk goed met SPR, ook voor moleculen van 150–300 Da, mits de ligandimmobilisatiedichtheid hoog genoeg is en de meetopzet op de beperkte respons is afgestemd. Moderne SPR-platforms (zoals Biacore S200 en T200) zijn specifiek geoptimaliseerd voor de detectie van kleine moleculen.
Bij de ontwikkeling van therapeutische monoklonale antilichamen is SPR onmisbaar voor epitoopbepaling (epitope binning), isotypering, affiniteitsrangschikking (affinity ranking) en kwaliteitscontrole van batchconsistentie. De combinatie van hoge doorvoer (Carterra LSA of ProteOn) en nauwkeurige kinetische analyse (Biacore) maakt het mogelijk om honderden antilichaamkandidaten te prioriteren vóór doorgang / selectie naar cel- en dierproeven. SPR wordt ook toegepast voor de karakterisering van Fc-receptorbinding, die de in-vivo-activiteitverdeling en halfwaardetijd van antilichamen mede bepaalt.
In fundamenteel biochemisch onderzoek wordt SPR gebruikt om eiwitcomplexen in kaart te brengen, signaaltransductieroutes te ontrafelen en de binding van transcriptiefactoren aan promotorsequenties te kwantificeren. SPR meet snelle en zwakke interacties (KD in het µmol/L-bereik) die met technieken als co-immunoprecipitatie (co-IP) moeilijk aantoonbaar zijn, omdat die laatste sterk verdunde condities en spoelstappen vereisen die complexen van lage affiniteit kunnen dissociëren.
SPR is toepasbaar voor de bestudering van DNA-eiwit- en RNA-eiwitinteracties, de binding van antisense-oligonucleotiden aan hun doelsequenties en de interactie van transcriptiefactoren met promotorelementen. Hierbij worden gestreptavidineerde chips gebruikt waarop biotingelabelde oligonucleotiden worden gecaptured. Het is ook mogelijk om small molecule-DNA-intercalatie te meten, wat relevant is voor de karakterisering van DNA-intercalerende antibiotica of antitumormiddelen.
Virusdeeltjes, bacterieel oppervlakteproteïnen en vaccincomponenten kunnen met SPR worden gekarakteriseerd op hun binding aan cellulaire receptoren of antilichamen. Gehele virusdeeltjes kunnen op sensorchips worden gebonden voor bindingsstudies met antilichamen of neutraliserende stoffen.
SPR wordt ingezet voor omgevingsmonitoring en voedselanalyse. Draagbare SPR-biosensorsystemen worden ingezet voor snelle detectie van pathogenen, toxinen (aflatoxinen, domoïnezuur) en residuen van antibiotica in voedingsproducten en omgevingsmonsters zoals oppervlaktewater en bodemextracten. Toepassingen omvatten de detectie van pesticiden, hormoonverstorende stoffen en zware-metaalionen via specifiek geimmobiliseerde receptoren of aptameren op de sensorchip. De label-vrije aanpak maakt complexe signaalversterkingsstappen overbodig, wat de robuustheid in buitenlaboratoriumomstandigheden ten goede komt.
SPR heeft een karakteristiek niche in het arsenaal van technieken voor de studie van moleculaire interacties. De tabel vergelijkt SPR met de meest gebruikte alternatieve methoden.
De detectiegevoeligheid van SPR wordt bepaald door twee factoren: de massa van de analist en de kwaliteit van het optische systeem. In massatermen correspondeert 1 RU met een oppervlaktemassadichtheid van circa 1 pg/mm². Moderne SPR-platforms (zoals Biacore S200 en T200) bereiken een basislijnsruis van 0,1–0,3 RU RMS, wat in principe massa-addities van minder dan 1 pg/mm² detecteerbaar maakt. In praktische termen betekent dit:
In vergelijking met ELISA is de absolute massagevoeligheid van SPR lager, maar SPR vereist geen signaalversterking via enzym of fluorofoor en is daardoor directe, label-vrije gevoeligheid. In vergelijking met biolayer interferometrie (BLI) heeft SPR doorgaans een hogere gevoeligheid voor kleine moleculen doordat het microfluidische systeem beter gedefinieerde vloeistofstromen heeft en de basislijnruis lager is.
Na de dissociatiefase kan een regeneratiestap nodig zijn om gebonden analist te verwijderen zodat het ligandoppervlak opnieuw gebruikt kan worden. Regeneratiecondities variëren per systeem: hoge zoutconcentraties (1–2 mol/L NaCl), lage pH (glycinebuffer pH 1,5–2,5), hoge pH (NaOH) of milde detergentia worden ingezet. Onjuiste regeneratie leidt tot cumulatief signaalverlies (drift) of partiële liganddenaturatie. Wanneer regeneratie niet mogelijk is, kan gebruik worden gemaakt van een capture-format waarbij het ligand per cyclus opnieuw wordt gecaptured en vervolgens geregenereerd samen met de sensorchip.
Double referencing is een essentieel onderdeel van de data-analyse en bestaat uit twee afzonderlijke correctiestappen. In de eerste stap wordt het SPR-signaal van een referentiekanaal (een kanaal zonder geïmmobiliseerd ligand, of met een irrelevant controle-eiwit) afgetrokken van het signaal van het meetkanaal. Hiermee worden niet-specifieke binding, bulkverschillen in brekingsindex en instrumentdrift gecorrigeerd. In de tweede stap wordt een blanco-injectie (buffer zonder analist, ook wel nul-concentratie-injectie of solvent-correctie-injectie) afgetrokken. Hiermee worden resterende artefacten als gevolg van kleine DMSO-concentratieverschillen of instrumentruis geëlimineerd. Zonder double referencing zijn systematische fouten in ka, kd en KD onvermijdelijk.
In biofarmaceutische ontwikkeling is SPR-data nodig voor de onderbouwing van de werkzaamheid en specificiteit van therapeutische antilichamen in dossiers voor EMA en FDA. De Internationale Raad voor Harmonisatie van technische vereisten voor geneesmiddelen voor menselijk gebruik (ICH) verwijst in richtlijnen zoals Q6B naar bindingsassays voor biofarmaceutica. Voor methoden die worden gebruikt in kwaliteitscontrole, is methodevalidatie conform de geldende ICH Q2(R1)-richtlijn voor analytische methoden aangewezen, in het bijzonder wanneer SPR wordt ingezet voor specificatietestdoeleinden.
Bij gebruik in het kader van goede laboratoriumpraktijken (GLP) gelden aanvullende vereisten ten aanzien van instrumentkalibratie, apparatuurkwalificatie en gegevensbeheer conform 21 CFR Part 11 of equivalente Europese regelgeving. Biacore-systemen beschikken over optionele compliance-pakketten die aan deze vereisten tegemoetkomen.
Een succesvolle SPR-meting begint met zorgvuldige optimalisatie van de proefopzet. De volgende stappen zijn bepalend:
Monsterkwaliteit heeft een directe invloed op de betrouwbaarheid van de kinetische parameters. Aggregaten in het analytmonster leiden tot een initieel hoog maar niet-reproduceerbaar signaal en herschrijven het sensogram op een manier die massetransportlimitatie of heterogeniteit nabootst. Standaard aanbevelingen zijn: spinfiltreer het analystmonster vlak voor gebruik (0,22 µm), match de monsterbuffer zo nauwkeurig mogelijk aan de loopbuffer om bulkbrekingsindexverschillen te minimaliseren, en zorg dat het DMSO-percentage in oplossingen van kleine moleculen niet meer dan 1–2% bedraagt tenzij het instrument specifiek gecalibreerd is voor hogere DMSO-percentages. Eiwitmonsters worden bij voorkeur gedialyseerd of via omwisselkolom in loopbuffer gebracht in plaats van met behulp van stockoplossingen in storende buffers (glycerol, hoge zoutconcentraties).
De benodigde hoeveelheid eiwit hangt af van de rol van het eiwit in het experiment (ligand of analist) en van het aantal meetcycli dat gepland is.
Ligand (te immobiliseren component): voor een standaard NHS/EDC-koppeling op een CM5-chip wordt typisch 50–200 µg ligand gebruikt voor het scouten van immobilisatiecondities en de uiteindelijke koppeling op 2–4 flowcelkanalen. Wanneer een hoge immobilisatiedichtheid niet nodig is — zoals bij kinetische metingen waarbij Rmax van 50–200 RU wordt nagestreefd — kan de benodigde hoeveelheid lager uitvallen. Voor capture-methoden (biotin-streptavidine, his-tag/NTA) is de hoeveelheid per cyclus kleiner omdat het ligand per injectie opnieuw wordt geladen.
Analist (te injecteren component): per injectie wordt typisch 50–200 µL analytoplossing verbruikt bij een standaard flowcel. Bij een concentratiereeks van vijf punten in duplo bedraagt het totale analytverbruik per experiment circa 0,5–2 mL. Bij een molecuulmassa van 50 kDa en een analytconcentratie rond KD (bijvoorbeeld 10 nmol/L) is de benodigde hoeveelheid eiwit per injectie enkele tientallen nanogram — verwaarloosbaar vergeleken met andere biofysische technieken. Bij hogere KD-waarden (micromolaire affiniteit) zijn hogere analytconcentraties nodig, waardoor het totale verbruik toeneemt.
Praktische vuistregel: reken voor een volledig kinetisch experiment (immobilisatiescouting + koppeling + concentratiereeks + regeneratiescouting) op 100–500 µg ligand en 50–500 µg analist, afhankelijk van de molmassa en het aantal parallelle kanalen. Dit maakt SPR tot een van de zuinigste biofysische technieken voor kinetische karakterisering — isothermische titratiecalorimetrie (ITC) vereist doorgaans een factor 10–100 meer materiaal voor vergelijkbare informatie.
De term surface plasmon resonance verwijst in brede zin naar twee verwante maar fundamenteel verschillende fenomenen. Propagerende oppervlakplasmon-polaritonen (SPP) zijn golfvormige, langs het metaaloppervlak voortplantende koppelingen van elektronenoscillaties en licht. Ze ontstaan aan een uitgestrekt, vlak metaaloppervlak en bewegen zich voort over macroscopische afstanden. In een klassiek SPR-biosensor-instrument worden juist deze SPP opgewekt door lichtinkoppeling via een prisma; het biosensorprincipe maakt gebruik van het evanescente veld dat de zich voortplantende SPP vergezelt.
Gelokaliseerde oppervlakplasmonresonantie (LSPR, localized surface plasmon resonance) ontstaat bij metalen nanoparticels — doorgaans goud- of zilvernanoparticels met een diameter van 1–100 nm. Bij LSPR oscilleren de geleidingselektronen als geheel binnen de afgeperkte geometrie van het nanodeeltje, zonder voortplanting. De resonantiefrequentie en daarmee de kleur van de oplossing zijn sterk afhankelijk van de deeltjesgrootte, de deeltjesvorm en de brekingsindex van het omringende medium. Dit maakt LSPR toepasbaar als kleurometrische sensor voor bindingsgebeurtenissen in de directe omgeving van het nanoparticle, zonder dat een prisma of microfluidisch systeem nodig is. LSPR-biosensors worden onderzocht voor point-of-care diagnostiek vanwege hun eenvoudige optische opzet.
Het onderscheid in één oogopslag: bij klassieke SPR-biosensors (Biacore e.d.) worden SPP op een vlak goudlaagje gebruikt, en meting verloopt via resonantiehoek of reflectie-intensiteit. Bij LSPR-biosensors worden metalen nanoparticels gebruikt, en meting verloopt via extinctie-maximum in het zichtbare spectrum. Beide benaderingen zijn label-vrij en gevoelig voor massaveranderingen aan het sensoroppervlak, maar ze verschillen in gevoeligheid, instrumentcomplexiteit en toepassingsdomein.
SPR maakt deel uit van een bredere familie van biosensortechnieken op basis van oppervlaktegebonden detectie.
Biolayer interferometrie (BLI, commercieel bekend als Octet van Sartorius) is de meest gebruikte alternatieve label-vrije bindingstechniek naast SPR. Beide methoden meten massaveranderingen aan een oppervlak in real time en leveren ka, kd en KD op. Er zijn echter belangrijke praktische verschillen. BLI meet lichtinterferentie aan het uiteinde van een optische vezelsensor die in een putplatenformat werkt (96- of 384-putplaten), waarbij meerdere sensoren tegelijk kunnen meten zonder een microfluidisch systeem. Dit maakt BLI sneller en eenvoudiger in gebruik dan SPR voor het parallel screenen van grote aantallen monsters. SPR heeft een hogere detectiegevoeligheid, is beter geschikt voor kleine moleculen en geeft in het algemeen nauwkeurigere kinetische parameters doordat het systeem beter gedefinieerde vloeistofstromen heeft. Voor de selectie: BLI is aantrekkelijk voor hoge doorvoer en routinematige antilichaamkarakterisering; SPR heeft de voorkeur wanneer nauwkeurige kinetiek en detectie van kleine moleculen essentieel zijn.
Quartz crystal microbalance (QCM) meet massaveranderingen via frequentieverandering van een trillende kwartskristal; QCM-D voegt dissipatiemeting toe en geeft tevens informatie over de visco-elastische eigenschappen van het gebonden materiaal.
Voor de studie van moleculaire interacties op atomaire schaal is atomaire-krachtsmicroscopie (AFM) een complementaire techniek waarmee bindingskrachten tussen individuele moleculen direct gemeten kunnen worden (force spectroscopy). Voor de karakterisering van de hydrodynamische eigenschappen van eiwitcomplexen in oplossing biedt dynamische lichtverstrooiing (DLS) aanvullende informatie.
Wanneer niet alleen kinetiek maar ook de volledige thermodynamische karakterisering van een interactie nodig is — enthalpie (ΔH), entropie (ΔS) en vrije energie (ΔG) — dan is isothermische titratiecalorimetrie (ITC) de complementaire keuze. ITC vereist geen immobilisatie en meet in oplossing, maar geeft geen informatie over de snelheidsconstanten van de binding.
Voor de detectie van eiwitinteracties in het cellulair milieu in situ zijn chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) voor eiwit-DNA-interacties en co-immunoprecipitatie (co-IP) voor eiwit-eiwitinteracties de gangbare technieken, hoewel die geen directe kinetische informatie leveren.
Bekijk het assortiment laboratoriumapparatuur en verbruiksmaterialen van Labvakhandel, of neem contact op voor advies bij de keuze van de juiste materialen voor uw toepassing.
Onderdeel van: Klinisch laboratorium
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
