Fluorescentie-spectroscopie is een optische analysetechniek waarbij een monster met monochromatisch licht wordt aangeslagen en de uitgezonden fluorescentiestraling wordt gemeten. De techniek is selectief, snel en buitengewoon gevoelig — tot in het picomolaire bereik — en wordt toegepast voor de kwantificering van fluorescente verbindingen in biologische, farmaceutische, milieu- en industriële monsters. Anders dan absorptiespectroscopie meet fluorescentie-spectroscopie het lichtsignaal tegen een donkere achtergrond, wat een aanzienlijk lagere detectielimiet oplevert dan UV/Vis-absorptie bij vergelijkbare monsters.
Dit artikel behandelt het werkingsprincipe, de bouw van een fluorescentiespectrometer, het verschil tussen fluorescentie en fosforescentie, de twee soorten fluorescentiespectra (excitatie- en emissiespectrum), en de toepassingen in de praktijk — van eiwitkwantificering tot drinkwateranalyse. Voor verwante technieken zie de artikelen over fluorescentiemicroscopie en flowcytometrie.
Fluorescentie is een vorm van fotoluminescentie: het uitzenden van licht door een molecuul nadat het energie heeft geabsorbeerd. Het proces verloopt in drie opeenvolgende elektronische stappen, beschreven in het Jablonski-diagram.
De levensduur van de aangeslagen toestand bij fluorescentie ligt tussen 10−9 en 10−7 s (nanoseconden). Dit is een fundamenteel onderscheid met fosforescentie, waarbij de levensduur veel langer is.
Fluorescentie en fosforescentie zijn beide vormen van fotoluminescentie, maar verschillen in het elektronische pad dat het molecuul aflegt na excitatie:
Het kwantummechanische verschil zit in de spinmultipliciteit: bij fluorescentie behouden de twee elektronen hun gepaarde spin (singletstaat), bij fosforescentie keert één elektron zijn spin om naar een triplettoestand. Omdat een terugkeer van triplet naar singlet kwantummechanisch "verboden" is, duurt deze veel langer — vandaar het nagloeien.
Een fluorescentiespectrometer — ook wel fluorimeter of spectrofluorimeter genoemd — meet de intensiteit van fluorescentiestraling als functie van de excitatie- en/of emissiegolflengte. De opbouw verschilt fundamenteel van een UV/Vis-spectrofotometer doordat de detector niet in lijn staat met de lichtbron, maar onder een hoek van 90° — zo wordt vermeden dat het sterke excitatielicht direct in de detector valt.
De 90°-geometrie is de hoeksteen van de hoge gevoeligheid van fluorescentie-spectroscopie. Bij absorptiespectroscopie (UV/Vis) staat de detector recht achter het monster in lijn met de lichtbron. De detector meet daardoor een groot achtergrondssignaal — het doorgaande excitatielicht — en bepaalt de absorptie als het kleine verschil tussen het inkomende en het doorgaande signaal. Kleine veranderingen in absorptie zijn moeilijk te onderscheiden van ruis op een groot achtergrondsignaal.
Bij fluorescentie-spectroscopie staat de detector onder 90° ten opzichte van de excitatiestraal. Op die hoek bereikt vrijwel geen direct excitatielicht de detector: het monster zendt fluorescentielicht in alle richtingen uit, maar het parallelle excitatielicht gaat in een rechte lijn verder en mist de detector volledig. De detector meet daarmee uitsluitend het door het monster uitgezonden fluorescentielicht tegen een vrijwel donkere achtergrond. Omdat er geen groot achtergrondssignaal hoeft te worden afgetrokken, is de detectielimiet bepaald door de ruiskenmerken van de detector zelf — niet door de fluctuaties in de lichtbronintensiteit. Dit verklaart waarom fluorescentie-detectielimieten doorgaans 10 tot 1000 maal lager liggen dan bij UV/Vis-absorptie voor dezelfde fluorescente verbinding. De 90°-geometrie is daarmee niet een willekeurige ontwerpkeuze, maar de fysische vereiste die de methode zijn uitzonderlijke gevoeligheid geeft.
Een fluorescentiespectrometer kan twee fundamenteel verschillende spectra opnemen:
Voor de meeste kwantitatieve toepassingen wordt eerst het excitatiespectrum opgenomen om het excitatiemaximum vast te stellen, vervolgens het emissiespectrum bij dat optimale excitatiemaximum, en daarna wordt routinematig gemeten bij de twee maxima. Een driedimensionale excitatie-emissiematrix (EEM) combineert beide assen in één meting en is bruikbaar voor de identificatie van onbekende fluorescente verbindingen in complexe matrices.
De interpretatie van fluorescentiespectra verloopt stapsgewijs en begint altijd met het beoordelen van de signaalkwaliteit, daarna de spectrumeigenschappen en tot slot de kwantitatieve of kwalitatieve conclusie:
De spiegelbeeldregel (Engels: mirror image rule) stelt dat het emissiespectrum van een fluorofoor spiegelbeeldsymmetrisch is aan het absorptie- (of excitatie-)spectrum, gespiegeld rond de golflengte van de 0–0-overgang. Deze overgang correspondeert met de absorptie vanuit het laagste vibrationele niveau van de grondtoestand (S0, v=0) naar het laagste vibrationele niveau van de aangeslagen toestand (S1, v=0). De spiegelsymmetrie ontstaat doordat de Franck-Condon-factoren die de relatieve intensiteit van de vibronische overgangen bepalen bij absorptie en emissie vrijwel identiek zijn, mits de geometrie van het molecuul in S0 en S1 weinig verschilt.
In de praktijk betekent dit:
Bij de praktische interpretatie van spectra is de spiegelbeeldregel een nuttige controlemaatstaf: een emissiespectrum dat sterk afwijkt van de verwachte spiegelbeeldvorm is een aanwijzing voor verontreinigingen, chemische reacties in de aangeslagen toestand (protonering, isomerisatie) of aggregatieverschijnselen.
De term "fluorescentie" werd in 1852 geïntroduceerd door de Britse natuurkundige George Stokes, naar het mineraal fluoriet (calciumfluoride, CaF2), dat bij belichting met ultraviolet licht een opvallend blauwe gloed uitzendt. Stokes ontdekte dat het uitgezonden licht altijd een langere golflengte heeft dan het inkomende licht — een fenomeen dat nu zijn naam draagt (Stokes-shift).
In bredere zin wordt "fluorescentie" gebruikt voor elke vorm van lichtemissie die direct stopt zodra de excitatiebron wordt uitgeschakeld — in tegenstelling tot fosforescentie of chemiluminescentie. De fluorescerende eigenschap van een molecuul wordt bepaald door zijn elektronenstructuur: doorgaans zijn aromatische verbindingen met gedelokaliseerde π-elektronen (zoals fluoresceïne, kinine, tryptofaan) sterk fluorescent.
Bij lage concentraties (absorptie A < 0,05 bij de excitatiegolflengte) is de fluorescentie-intensiteit recht evenredig met de concentratie van de fluorofoor:
If = I0 × Φf × ε × c × l
Hierin is I0 de intensiteit van het excitatielicht, Φf de kwantumopbrengst (fractie van geabsorbeerde fotonen die als fluorescentie wordt uitgezonden), ε de molaire absorptiecoëfficiënt, c de concentratie en l de optische weglengte. Boven die grens treedt het inner filter effect op: de fluorescentie groeit minder snel dan lineair doordat het excitatielicht al gedeeltelijk wordt geabsorbeerd in het voorste deel van de cuvette en de uitgezonden fluorescentie aan de achterkant wordt gereabsorbeerd. Voor reproduceerbare kwantificering wordt het monster doorgaans verdund tot een absorptie van 0,05 of lager bij de excitatiegolflengte.
De kwantumopbrengst Φf is de verhouding tussen het aantal uitgezonden fotonen en het aantal geabsorbeerde fotonen. Voor fluoresceïne in basisch water bedraagt Φf ongeveer 0,95 (95% van de geabsorbeerde fotonen wordt als fluorescentie uitgezonden). De waarde wordt sterk beïnvloed door de oplosmiddelpolariteit, pH, temperatuur, en de aanwezigheid van quenchers (moleculen die de aangeslagen toestand stralingsloos deactiveren). Voor reproduceerbare metingen worden al deze parameters constant gehouden.
Veelgebruikte fluoroforen en hun typische excitatie- en emissiemaxima:
Fluorescentie-spectroscopie is onmisbaar voor de kwantitatieve analyse van eiwitten en nucleïnezuren. Tryptofaan-fluorescentie (intrinsieke eiwitfluorescentie) wordt gebruikt voor het volgen van eiwitvouwing en ligandbinding zonder externe labels. Intrinsieke tryptofaanfluorescentie is ook een gevoelige indicator voor eiwitaggregatie: blootstelling van hydrofobe residuen bij ontvouwing verschuift het emissiemaximum merkbaar. Voor DNA- en RNA-kwantificering zijn fluorimetrische assays met dsDNA- of ssDNA-selectieve kleurstoffen aanzienlijk specifieker dan UV-absorptie bij 260 nm, omdat ze niet meten op nucleotideaanwezigheid in vrije vorm of op eiwitverontreiniging.
Met geavanceerdere fluorescentiemethoden zoals FRET (Förster Resonance Energy Transfer) wordt de afstand tussen twee gelabelde sites in een eiwit of nucleïnezuur gemeten op nanometerschaal. Fluorescence polarization meet de rotatiesnelheid van fluorescent gelabelde moleculen en wordt gebruikt voor bindingaffiniteitstudies in high-throughput screening.
Fluorescentiemicroscopie past het principe van fluorescentie-spectroscopie toe op de beeldvorming van biologische preparaten. Een lichtbron — traditioneel een kwikdamp- of xenon-booglamp, in moderne systemen een LED of laser — verlicht het preparaat via een excitatiefilter dat de gewenste excitatiegolflengte doorlaat. Het fluorescentielicht dat door het preparaat wordt uitgezonden, passeert een emissiefilterset (dichroïsche spiegel + emissiefilterkubus) die het excitatielicht blokkeert en uitsluitend het langere-golflengte-emissielicht doorlaat naar de camera of het oculair. Doordat alleen de fluorescente structuren — specifiek gelabeld met fluoroforen als DAPI, FITC, GFP of Cy-kleurstoffen — zichtbaar zijn tegen een donkere achtergrond, is het contrast fundamenteel beter dan bij conventionele doorlichtmicroscopie. Het onderscheid met fluorescentie-spectroscopie zit in de ruimtelijke dimensie: een spectrofluorimeter geeft een gemiddeld signaal van het hele monstervolume in de cuvette; een fluorescentiemicroscoop beeldt individuele cellen, organellen of moleculen af. Voor een volledige bespreking van confocale microscopie, TIRF en superresolutie-technieken, zie het kennisbankartikel over fluorescentiemicroscopie.
Voor de analyse van de secundaire eiwitstructuur via differentiële absorptie van circulair gepolariseerd licht is circulair dichroïsme (CD)-spectroscopie de complementaire techniek naast tryptofaan-fluorescentie.
De HPLC-fluorescentiedetector (FLD) is een veelgebruikte detector voor de selectieve kwantificering van fluorescente of derivatiseerbare verbindingen. De gevoeligheid is een factor 10 tot 1000 hoger dan UV/Vis bij verbindingen met fluorescente chromoforen. Standaardtoepassingen zijn de bepaling van polycyclische aromatische koolwaterstoffen (PAK's) in milieumonsters, aflatoxinen in voedsel en aminozuren na pre- of post-column derivatisering met OPA of ninhydrine.
Een fluorescentiedetector (FLD) voor HPLC werkt op hetzelfde principe als een laboratoriumspectrofluorimeter, maar is geoptimaliseerd voor on-line detectie van kleine volumes eluent die continu uit de chromatografische kolom stromen. De detector bevat een excitatiebron (xenon-booglamp of LED), een excitatiemonochromator of -filter die de gewenste excitatiegolflengte selecteert, een doorstroomcel van kwartsglas (typisch volume 1–8 µl) waardoorheen het eluent stroomt, en een emissiemonochromator of -filter onder 90° ten opzichte van de excitatieas, gevolgd door een fotomultiplicatorbuis (PMT). Omdat de detector uitsluitend licht meet dat door de fluorescente analyt wordt uitgezonden tegen een donkere achtergrond, is de ruis inherent laag en is de detectielimiet 10–1000 maal lager dan bij een UV/Vis-absorptiedetector voor dezelfde fluorescente verbinding. Moderne HPLC-FLD's zijn programmeerbaar: excitatie- en emissiegolflengte kunnen tijdens een run worden veranderd op vooraf ingestelde tijdpunten (tijdprogramma), waardoor meerdere analuten met verschillende optimale golflengten in één run selectief kunnen worden gedetecteerd. Niet-fluorescente verbindingen zijn met een FLD niet detecteerbaar zonder voorafgaande derivatisering tot een fluorescent product.
Fluorescente verbindingen in drinkwater — PAK's, kinine, sommige pesticiden, opgeloste organische stof — worden routinematig gevolgd via fluorescentie-spectroscopie. Het opgenomen excitatie-emissiematrixspectrum (EEM) van natuurlijke wateren wordt gebruikt voor bronidentificatie (riviereninbreng, afvalwaterimpact, humine- en fulvozuren). Olie-in-wateremulsies in industriële effluenten zijn detecteerbaar tot in het µg/l-bereik via oliespecifieke fluorescentie bij 360–380 nm.
Vele actieve farmaceutische ingrediënten (API's) zijn van nature fluorescent of worden via een derivatiseringsstap fluorescent gemaakt. Voorbeelden zijn kinine, salicylzuur, vitamine B2 (riboflavine), bepaalde tetracyclines en chinolonen. Fluorimetrische methoden worden ingezet in zowel de eindproductanalyse als de bepaling van afbraakproducten in stabiliteitsstudies. De methoden zijn vaak goedkoper dan HPLC en geschikt voor routinematige doorvoer.
Fluorescentie-spectroscopie wordt ingezet voor de bepaling van porfyrines in urine (diagnose van porfyrie), catecholaminen in plasma (feochromocytoomdiagnostiek), en vitamine A/D-spiegels. In de hematologie wordt fluorescent gelabelde reticulocyttelling uitgevoerd op moderne hematologische analyzers.
UV-spectroscopie (UV/Vis-absorptie) en fluorescentie-spectroscopie meten beide de interactie van licht met moleculen, maar via fundamenteel verschillende fysische processen en met sterk verschillende gevoeligheid en selectiviteit.
Bij UV-absorptiespectroscopie wordt gemeten hoeveel licht een monster tegenhoudt: de detector staat in lijn met de lichtbron en registreert het verzwakte doorgaande licht. Elk molecuul dat licht absorbeert in het UV-gebied is in principe meetbaar, ongeacht of het fluoresceert. Het signaal is het verschil tussen een groot inkomend signaal en een iets kleiner doorgaand signaal, wat de detectiegevoeligheid beperkt tot typisch nanomol- tot micromolbereik.
Bij fluorescentie-spectroscopie wordt gemeten hoeveel licht een monster uitzendt na excitatie: de detector staat onder 90° en registreert uitsluitend het door de fluorofoor uitgezonden licht tegen een donkere achtergrond. Alleen moleculen met een fluorescente chromofoor zijn meetbaar, maar die meetbaarheid gaat gepaard met detectielimieten in het picomolbereik — een factor 10 tot 1000 lager dan UV-absorptie. Fluorescentie biedt bovendien een extra dimensie van selectiviteit: zowel de excitatiegolflengte als de emissiegolflengte zijn karakteristiek voor de fluorofoor, terwijl UV-absorptie slechts één golflengtedimensie heeft. Voor niet-fluorescente verbindingen is UV-absorptie de aangewezen techniek; voor fluorescente verbindingen waarbij lage detectielimieten of hoge selectiviteit zijn vereist, heeft fluorescentie-spectroscopie de voorkeur.
Fluorescentie-spectroscopie biedt de beste combinatie van gevoeligheid en selectiviteit voor moleculen met een fluorescente chromofoor — en blijft de techniek van keuze wanneer een UV/Vis-meting niet de vereiste detectiegrenzen haalt. Voor de bepaling van anorganische elementen als natrium, kalium en calcium via thermische excitatie is atomaire emissie (vlamfotometrie) de complementaire techniek — niet gebaseerd op moleculaire fluorescentie, maar op atomaire lichtemissie in een vlam.
Standaard glascuvetten absorberen UV-licht onder 320 nm en zijn ongeschikt voor fluorescentiemetingen waarbij excitatie in het UV plaatsvindt (zoals tryptofaan-fluorescentie bij 280 nm). Gebruik altijd kwartscuvetten met vier optisch heldere zijden. Voor oplosmiddelen geldt dat ze fluorescentievrij moeten zijn in het meetbereik — spectroscopiekwaliteit ethanol, methanol, acetonitril en chloroform zijn doorgaans geschikt; technische kwaliteit niet.
Quenching is de vermindering van fluorescentie-intensiteit door interactie met andere moleculen. Veelvoorkomende quenchers zijn opgeloste zuurstof (vooral voor PAK's en aromatische verbindingen), zware metaalionen (Hg2+, Pb2+, Cu2+), halogenide-ionen (I−, Br−) en collisionele interactie met andere fluoroforen bij hoge concentratie. Voor kwantitatief werk moet de quencherconcentratie constant worden gehouden of moeten interne standaarden worden gebruikt.
Langdurige blootstelling aan intense excitatiestraling kan een fluorofoor irreversibel veranderen of vernietigen — fotobleking. Voor langdurige metingen wordt het excitatielicht zo kort en zo zwak mogelijk gehouden, of een chopper gebruikt die het licht intermitterend opent.
Fluorescentiemeters zijn relatieve instrumenten: de gemeten intensiteit hangt af van lampintensiteit, monochromatoreigenschappen en detectorgevoeligheid die over tijd veranderen. Voor reproduceerbare metingen tussen instrumenten en sessies worden referentiestandaarden gebruikt — veelgebruikt zijn kininesulfaat in 0,5 mol/L H2SO4 (NIST SRM 936) en fluoresceïne in 0,1 mol/L NaOH. Voor kwantitatieve analyse altijd een meerpuntskalibratie met de doelfluorofoor in een vergelijkbare matrix uitvoeren.
Het toxiciteitsprofiel van fluoroforen varieert sterk per stofklasse en kan niet met een algemeen ja of nee worden beantwoord. De meest gebruikte fluoroforen in het laboratorium vallen in drie categorieën:
Kwantumdots — anorganische fluorescente nanodeeltjes op basis van cadmium, lood of andere zware metalen — zijn potentieel toxisch door vrijkomen van zware-metaalionen bij degradatie van de coatinglaag, en vereisen specifieke voorzorgsmaatregelen bij bereiding en verwerking. Raadpleeg voor elk fluorescerend reagens altijd het veiligheidsinformatieblad (VIB/SDS) en volg de richtlijnen van uw instelling voor omgang met en afvoer van fluorescente kleurstoffen.
Fluorescentiespectrometrie is een analysetechniek waarbij een monster wordt aangeslagen met monochromatisch licht en de uitgezonden fluorescentiestraling wordt gemeten. De techniek levert twee soorten spectra op: een excitatiespectrum (welke golflengten absorbeert de fluorofoor effectief) en een emissiespectrum (welk licht wordt uitgezonden bij optimale excitatie). De intensiteit van de emissie is bij lage concentraties recht evenredig met de concentratie van de fluorofoor, wat kwantitatieve bepaling mogelijk maakt tot in het picomolaire bereik.
Fluorescerende stoffen — ook wel fluoroforen of fluorescentiekleurstoffen genoemd — zijn moleculen die licht van een bepaalde golflengte absorberen en vervolgens licht van een langere golflengte uitzenden. Ze bezitten doorgaans een uitgebreid systeem van gedelokaliseerde π-elektronen, zoals aromatische ringen of geconjugeerde dubbele bindingen, dat de aangeslagen toestand lang genoeg stabiel houdt voor emissie. Bekende voorbeelden zijn organische kleurstoffen (fluoresceïne, rhodamine, cyaninekleurstoffen), natuurlijke biomoleculen (tryptofaan, NADH, riboflavine, porfyrines), fluorescente eiwitten (GFP en varianten) en anorganische luminescente materialen zoals kwantumdots. Niet-fluorescerende verbindingen kunnen via chemische derivatisering fluorescent worden gemaakt, zoals aminozuren na reactie met OPA of ninhydrine.
Ja, maar uitsluitend binnen een beperkt concentratiebereik. Bij lage concentraties (absorptie A < 0,05 bij de excitatiegolflengte) is de fluorescentie-intensiteit rechtstreeks evenredig met de concentratie van de fluorofoor, wat betrouwbare kalibratielijnen oplevert. Boven die drempel treedt het inner filter effect op: het excitatielicht wordt al geabsorbeerd voordat het het midden van de cuvette bereikt, en het uitgezonden licht wordt deels gereabsorbeerd vóór detectie. De relatie tussen concentratie en signaal wordt daardoor niet-lineair en de kalibratie verliest zijn geldigheid. Voor kwantitatief werk wordt het monster altijd verdund tot binnen het lineaire bereik, en wordt de lineariteit experimenteel vastgesteld als onderdeel van methodevalidatie.
De voornaamste beperkingen zijn: (1) Selectiviteit voor fluorescente stoffen — niet-fluorescente verbindingen zijn niet direct meetbaar zonder voorafgaande derivatisering. (2) Quenching — opgeloste zuurstof, zware metaalionen en halogenide-ionen kunnen de fluorescentie sterk verminderen en de gevoeligheid reduceren. (3) Inner filter effect — bij te hoge concentraties is het signaal niet meer lineair met de concentratie. (4) Fotobleking — intense belichting kan de fluorofoor irreversibel afbreken, wat tot signaalverlies leidt bij langdurige metingen. (5) Matrixinterferenties — andere fluorescente componenten in het monster (achtergrondsfluorescentie van oplosmiddelen, Raman-verstrooiing van water) kunnen het signaal verstoren. (6) Instrumentafhankelijkheid — fluorescentie-intensiteiten zijn relatieve grootheden die afhangen van lampintensiteit en detectorgevoeligheid; vergelijking tussen instrumenten vereist gecertificeerde referentiestandaarden.
Emissie is de algemene term voor het uitzenden van licht door een stof, ongeacht het onderliggende mechanisme. Fluorescentie is één specifieke vorm van emissie: lichtuitzending vanuit een elektronisch aangeslagen singlettoestand, met een levensduur van nanoseconden. Andere emissievormen zijn fosforescentie (emissie vanuit een triplettoestand, levensduur milliseconden tot seconden), chemiluminescentie (emissie door een chemische reactie), bioluminescentie (emissie door levende organismen) en atoomemissie (emissie door thermisch of elektrisch aangeslagen atomen, zoals bij vlamfotometrie). In de spectroscopische praktijk verwijst "emissiespectrum" bij fluorescentie-spectroscopie altijd naar het spectrum van de fluorescentie-emissie, gemeten bij een vaste excitatiegolflengte.
DNA is van nature niet of nauwelijks fluorescent, maar kan met behulp van intercalerende kleurstoffen of covalente labels zichtbaar worden gemaakt. Intercalerende kleurstoffen zoals SYBR Green en ethidiumbromide schuiven tussen de basenparen van dubbelstrengs-DNA en worden daardoor sterk fluorescent (verhoging van kwantumopbrengst met een factor 20 tot 1000). DAPI en Hoechst-kleurstoffen binden in de kleine groef van A-T-rijke gebieden en geven een blauw fluorescentiesignaal dat celkernen zichtbaar maakt. Voor sequentiespecifieke detectie worden DNA-probes covalent gelabeld met fluoroforen zoals Cy3, Cy5 of fluoresceïne, zoals toegepast bij FISH en DNA-microarrays. In qPCR wordt de toename van dubbelstrengs-PCR-product in real time gevolgd via de SYBR Green-fluorescentie of via sequentiespecifieke TaqMan-probes.
Een monochromator is een optisch element dat uit een breed spectrum één smalle band van golflengten selecteert. In een spectrofluorimeter zijn twee monochromators aanwezig: de excitatiemonochromator selecteert de gewenste excitatiegolflengte uit het brede spectrum van de xenon-booglamp, en de emissiemonochromator selecteert de te meten emissiegolflengte uit het door het monster uitgezonden licht. Beide monochromators bevatten een diffractierooster dat licht in zijn samenstellende golflengten uiteenspreid; een spleet regelt de bandbreedte (typisch 1–20 nm). Hoe smaller de spleet, hoe hogere spectrale resolutie maar hoe minder licht de detector bereikt. In eenvoudige fluorimeters worden monochromators vervangen door optische bandbreedtefilters, wat de apparatuur goedkoper maar minder flexibel maakt.
Fluorescentie-spectroscopie wordt breed ingezet in biochemie (kwantificering van eiwitten, DNA en RNA, enzymkinetiek), farmaceutische kwaliteitscontrole (API-bepaling, stabiliteitsstudies), milieu- en drinkwateranalyse (PAK's, pesticiden, opgeloste organische stof), klinische diagnostiek (porfyrines, catecholaminen, vitamines) en chromatografische detectie via de HPLC-fluorescentiedetector. De combinatie van hoge gevoeligheid (pmol/L-bereik) en hoge selectiviteit maakt de techniek bijzonder geschikt wanneer UV/Vis-absorptie niet de vereiste detectielimieten haalt.
Bij absorptiespectroscopie (UV/Vis) wordt gemeten hoeveel licht door een monster wordt tegengehouden: de detector staat in lijn met de lichtbron en meet het verzwakte doorgaande licht. Bij fluorescentie-spectroscopie staat de detector onder 90° ten opzichte van de lichtbron en meet uitsluitend het door het monster uitgezonden licht tegen een donkere achtergrond. Omdat er geen groot achtergrondssignaal hoeft te worden afgetrokken, zijn detectielimieten bij fluorescentie doorgaans 10 tot 1000 maal lager dan bij UV/Vis voor dezelfde fluorescente verbinding. Niet alle stoffen zijn echter fluorescent; voor niet-fluorescente analyten blijft UV/Vis of een andere techniek vereist.
Bij fluorescentie absorbeert een molecuul een foton, raakt elektronisch aangeslagen, verliest een deel van die energie als warmte (vibrationele relaxatie), en zendt vervolgens een foton met lagere energie (langere golflengte) uit bij terugkeer naar de grondtoestand. Het hele proces duurt nanoseconden. Het verschil in golflengte tussen geabsorbeerd en uitgezonden licht heet de Stokes-shift en is karakteristiek voor de fluorofoor.
De Stokes-shift is het verschil in golflengte (of golftalgetal) tussen het excitatiemaximum en het emissiemaximum van een fluorofoor. Doordat een molecuul na absorptie eerst vibrationele energie als warmte verliest voordat het een foton uitzendt, heeft het emissiefoton altijd minder energie — en dus een langere golflengte — dan het geabsorbeerde foton. De Stokes-shift is karakteristiek voor elke fluorofoor en maakt het mogelijk excitatie- en emissiespectrum spectroscopisch van elkaar te scheiden. Een grote Stokes-shift (bijv. 100 nm of meer) vermindert de kans dat excitatielicht als achtergrondsignaal in de detector terechtkomt en vergemakkelijkt daarmee kwantitatieve metingen.
Het inner filter effect treedt op wanneer de concentratie van een fluorescente verbinding zo hoog is dat het excitatielicht al grotendeels wordt geabsorbeerd vóórdat het de kern van de cuvette bereikt, of dat het uitgezonden fluorescentielicht wordt gereabsorbeerd door het monster zelf vóór detectie. Het gevolg is dat de gemeten intensiteit minder dan evenredig stijgt met de concentratie, waardoor de kalibratie niet meer lineair is. De oplossing is het verdunnen van het monster tot een absorptie van 0,05 of lager bij de excitatiegolflengte, of het gebruik van een correctieformule.
Bij conventionele fluorescentie-spectroscopie wordt de steady-state intensiteit gemeten: een tijdgemiddeld signaal bij continue belichting. Time-resolved fluorescentie (TRF) meet in plaats daarvan het verval van het fluorescentiesignaal in de tijd na een korte lichtpuls. Omdat verschillende fluoroforen karakteristieke levensduren hebben (van enkele nanoseconden voor organische kleurstoffen tot microseconden voor lanthanidecomplexen), kan TRF onderscheid maken tussen componenten die bij dezelfde golflengte emitteren maar een verschillende levensduur hebben. In de praktijk wordt TRF ingezet voor HTRF-assays (Homogeneous Time-Resolved Fluorescence) in de farmaceutische screening, waarbij lanthanide-labels als Eu3+ of Tb3+ een lang-levende emissie geven die gemeten wordt nadat kortlevende achtergrondsfluorescentie al is uitgedoofd.
De term is in 1852 geïntroduceerd door George Stokes, naar het mineraal fluoriet (CaF2) dat onder UV-licht blauw oplicht. In moderne context betekent fluorescentie de directe emissie van licht na excitatie door licht van kortere golflengte, met een levensduur van de aangeslagen toestand in het nanosecondebereik.
De twee soorten spectra die een fluorescentiespectrometer kan opnemen zijn het excitatiespectrum (emissie wordt vastgehouden bij het emissiemaximum, excitatie wordt gescand) en het emissiespectrum (excitatie wordt vastgehouden bij het excitatiemaximum, emissie wordt gescand). Het excitatiespectrum lijkt sterk op het absorptiespectrum en toont bij welke golflengten de fluorofoor het beste wordt aangeslagen. Het emissiespectrum is uniek per fluorofoor en wordt gebruikt voor identificatie.
Fluorescentie is licht — maar het is geen gewoon gereflecteerd of doorgelaten licht. Het is licht dat opnieuw wordt gegenereerd door een molecuul nadat het energie heeft geabsorbeerd. Het uitgezonden licht heeft altijd een langere golflengte (en dus lagere energie) dan het geabsorbeerde licht, door het energieverlies als warmte in de vibrationele relaxatiestap. Dit onderscheidt fluorescentie fundamenteel van reflectie (zelfde golflengte, geen energieoverdracht) en van verstrooiing (Rayleigh: zelfde golflengte; Raman: kleine golflengteverschuiving door moleculaire trillingen).
UV-licht veroorzaakt inderdaad fluorescentie in veel organische verbindingen, maar is daarvoor niet noodzakelijk. Wat vereist is, is dat het excitatielicht een golflengte heeft die overeenkomt met een absorptieovergang van de fluorofoor. Voor tryptofaan in eiwitten is dat 280 nm (nabij UV); voor DAPI 358 nm (nabij UV); voor fluoresceïne 494 nm (blauw zichtbaar licht); voor chlorofyl circa 430 en 680 nm (blauw en rood). UV-licht (100–400 nm) is effectief voor vele aromatische fluoroforen omdat hun π→π*-overgangen in dit bereik vallen, maar fluorescentie kan ook worden opgewekt door zichtbaar licht of nabij-infrarood, afhankelijk van de fluorofoor.
De wetenschap achter fluorescentie is kwantummechanisch van aard. Elektronen in moleculen kunnen zich alleen in discrete energieniveaus bevinden. Wanneer een foton met precies de juiste energie wordt geabsorbeerd, springt een elektron naar een hoger niveau (aangeslagen singulettoestand S1). Via vibrationele relaxatie — botsingen met oplosmiddelmoleculen die energie als warmte overdragen — daalt het elektron naar het laagste vibrationele niveau van S1. Bij terugkeer naar de grondtoestand S0 wordt een foton uitgezonden. De energiedifferentie tussen S1 en S0 na relaxatie is kleiner dan de oorspronkelijk geabsorbeerde energie, dus het uitgezonden foton heeft een langere golflengte. Dit is de Stokes-shift, en de beschrijving van alle overgangen samen — absorptie, relaxatie, emissie — wordt samengevat in het Jablonski-diagram.
Fluorescentie verloopt via een singlet–singleovergang met een korte levensduur (nanoseconden) en stopt direct als de excitatiebron uitgaat. Fosforescentie verloopt via een triplettoestand, heeft een veel langere levensduur (milliseconden tot seconden) en is zichtbaar als nagloeien. Glow-in-the-dark materialen zijn fosforescerend; tonic met kinine onder UV-licht is fluorescerend en stopt direct met lichten als de lamp uitgaat.
Luminescentie is de overkoepelende term voor lichtuitzending zonder dat het materiaal hoeft te worden verhit (koud licht). Fluorescentie is een specifieke vorm van fotoluminescentie: lichtemissie veroorzaakt door eerder geabsorbeerd licht. Andere luminescentievormen zijn chemiluminescentie (licht uit een chemische reactie, zoals een breeklichtstaaf), bioluminescentie (licht uit levende organismen, zoals vuurvliegjes), elektroluminescentie (licht uit elektrische stroom, zoals OLED's) en thermoluminescentie. Fosforescentie is, net als fluorescentie, een vorm van fotoluminescentie maar met een veel langere levensduur.
Eenvoudige voorbeelden uit de praktijk: kinine in tonic licht blauw op onder UV-licht; fluoresceïne kleurt groengeel onder zonlicht of UV; vitamine B2 (riboflavine) in water geeft een gele fluorescentie; bankbiljetten bevatten fluorescerende inkten als echtheidskenmerk; en in de natuur fluoresceren bepaalde mineralen, koralen en schorpioenen onder UV. In het laboratorium zijn DAPI-gekleurde celkernen, GFP-gemerkte eiwitten en SYBR Green-gekleurd DNA in qPCR dagelijkse voorbeelden.
Een fluorimeter meet bij vaste excitatie- en emissiegolflengten, doorgaans gefilterd door optische bandbreedtefilters in plaats van monochromators. Fluorimeters zijn compact, robuust en geschikt voor routinematige kwantificering van één bekende fluorofoor (bijv. Qubit voor DNA-kwantificering). Spectrofluorimeters gebruiken twee monochromators (excitatie en emissie) en kunnen volledige spectra opnemen; ze zijn flexibeler maar duurder en groter. Voor methode-ontwikkeling en onderzoek is een spectrofluorimeter standaard; voor routinematige bepalingen volstaat een fluorimeter.
Fluorimetrie is de kwantitatieve toepassing van fluorescentie-meting: een monster wordt aangeslagen met licht van een vaste excitatiegolflengte en de emissie-intensiteit bij een vaste emissiegolflengte wordt gemeten als functie van de concentratie van de fluorescente verbinding. Het werkingsprincipe berust op de lineaire relatie tussen fluorescentie-intensiteit en concentratie bij lage concentraties (absorptie A < 0,05): If = I0 × Φf × ε × c × l. Fluorimetrie onderscheidt zich van spectrofluorimetrie doordat golflengten worden geselecteerd met optische bandbreedtefilters in plaats van monochromators, wat het instrument eenvoudiger en goedkoper maakt maar minder spectrale flexibiliteit biedt. Het principe is fundamenteel gelijk: lichtbron, excitatiefilter, monstercel, emissiefilter onder 90°, en detector. Fluorimeters worden ingezet voor routinematige kwantificering van één bekende fluorofoor in een gecontroleerde matrix — voorbeelden zijn de Qubit-fluorimeter voor DNA-kwantificering en eenvoudige veldapparaten voor waterkwaliteitsbewaking. Voor methode-ontwikkeling, onbekende monsters of meerdere analuten naast elkaar is een spectrofluorimeter met instelbare monochromators vereist.
Voor fluorescentie-spectroscopie zijn een fluorimeter of spectrofluorimeter het kerninstrument, aangevuld met kwartscuvetten (vier optisch heldere zijden), spectroscopiekwaliteit oplosmiddelen, kalibratiestandaarden (kininesulfaat, fluoresceïne), pipetten voor verdunningsreeksen en eventueel een verduisterde ruimte of donkere kast voor metingen bij omgevingslicht. Voor monstervoorbereiding zijn filtreermembranen van 0,2–0,45 µm nuttig om deeltjes te verwijderen die verstrooiing veroorzaken. Bekijk het assortiment cuvetten of neem contact op voor advies over de juiste opstelling voor uw fluorescentietoepassing.
Voor lichtverstrooiing door gesuspendeerde deeltjes — te onderscheiden van moleculaire fluorescentie — zie het kennisbankartikel over turbidimetrie en nephelometrie: nephelometrie meet elastisch verstrooid licht (90°) zonder energieoverdracht, terwijl fluorescentie inelastische emissie op een langere golflengte betreft.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting op fluorescentie-spectroscopie. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische situaties. Raadpleeg de geldende vakliteratuur en de handleiding van uw instrument voor protocollen die kritisch zijn voor de kwaliteitsborging van uw analyses.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
