Chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) is een moleculaire techniek waarmee de binding van eiwitten aan specifieke DNA-sequenties in levende cellen in kaart wordt gebracht. De methode maakt gebruik van een antilichaam dat selectief een eiwit van interesse herkent — een transcriptiefactor, een histonmodificatie of een chromatine-bindend complex — en isoleert vervolgens het bijbehorende DNA-fragment uit het celextract. ChIP behoort tot de kernmethoden van de epigenetica en is onmisbaar voor het bestuderen van genregulatie, chromatinestructuur en epigenomische patronen bij gezondheid en ziekte.
Chromatine is de combinatie van DNA en bijbehorende eiwitten — voornamelijk histonen — die samen de compacte structuur van het celkerngenoom vormen. Histonen organiseren het DNA in nucleosomen: elke nucleosoom bestaat uit een octameer van vier histontypen (H2A, H2B, H3 en H4) waaromheen 147 basenparen DNA zijn gewikkeld. De staarten van histonen kunnen op talrijke posities chemisch worden gemodificeerd door methylatie, acetylering, fosforylering en ubiquitinering. Deze histonmodificaties beïnvloeden de toegankelijkheid van het DNA voor transcriptiefactoren en zijn daarmee bepalend voor de aan- of uitschakeling van genen. Naast histonen binden ook niet-histoneiwitten direct aan DNA: transcriptiefactoren, DNA-replicatie-eiwitten en insulatorfactoren zoals CTCF. ChIP maakt het mogelijk de precieze locaties te bepalen waar al deze eiwitten in het genoom binden.
Immunoprecipitatie verwijst naar het precipiteren (neerslaan) van een specifiek molecuul uit een oplossing via een antilichaam. Bij ChIP is het te precipiteren doelwit een eiwit-DNA-complex: het antilichaam trekt zowel het eiwit als het eraan gekoppelde DNA-fragment mee. Na het loslaten van het antilichaam-eiwit-DNA-complex wordt het DNA gezuiverd en geanalyseerd. Dit laatste onderscheidt ChIP van gewone co-immunoprecipitatie (co-IP), waarbij het doel een eiwit-eiwit-interactie is in plaats van een eiwit-DNA-interactie. Lees meer over co-IP en western blot als aanvullende technieken voor eiwitanalyse.
Het ChIP-protocol is in de afgelopen decennia gestandaardiseerd en verloopt in een vaste volgorde van stappen die hierboven schematisch zijn weergegeven.
De eerste stap is het covalent vastzetten (cross-linken) van eiwit-DNA-interacties in de levende cel. Hiervoor wordt formaldehyde (1% eindconcentratie) aan de cellen of het weefsel toegevoegd gedurende ongeveer tien minuten bij kamertemperatuur. Formaldehyde vormt methyleen-bruggen tussen de primaire aminen van naburige moleculen — typisch lysineresiduen van een eiwit en nabijgelegen DNA-basen. De reactie wordt gestopt door toevoeging van glycine, dat overmaat formaldehyde wegvangt. Na cross-linking worden de cellen op ijs gelyseerd in een SDS-houdende lysis-buffer met protease-remmers. Het resultaat is een celextract waarin alle eiwit-DNA-interacties covalent gefixeerd zijn. Bij zogenoemde native ChIP (nChIP) wordt deze cross-linkstap weggelaten: in dat geval worden uitsluitend sterke, endogene eiwit-DNA-interacties geanalyseerd (typisch histonen), maar de signaal-ruis-verhouding is lager en kortlevende transcriptiefactor-bindingen gaan verloren.
Het gecross-linkte chromatine moet worden gefragmenteerd tot stukken van 200 tot 500 basenparen, zodat de antilichaamherkenning plaatsspecifiek is en het DNA na immunoprecipitatie kan worden gesequenced of geamplificeerd. Fragmentatie vindt plaats via sonicatie: korte ultrageluidspulsen breken het DNA mechanisch. Een typisch schema is tien cycli van 30 seconden aan en 30 seconden uit, op ijs, met een microtip sonicator. Zie voor achtergrond over sonicatie in het laboratorium het betreffende kennisbankartikel. Alternatieven voor sonicatie zijn enzymatische fragmentatie met micrococcal nuclease (MNase-ChIP), waarbij MNase het DNA knipt in de linker-regio's tussen nucleosomen. Na sonicatie wordt de kwaliteit van de fragmentatie gecontroleerd via gelelektroforese of een Bioanalyzer: een smeer van 200 tot 500 bp is het streefresultaat.
Het geclarificeerde chromatinelysaat wordt geïncubeerd met het antilichaam dat het eiwit van interesse herkent. Het antilichaam bindt aan het doeleiwit, inclusief het eraan cross-gelinkte DNA-fragment. Vervolgens worden antilichaam-eiwit-DNA-complexen uit de oplossing verwijderd via magnetische beads of agarose-beads waaraan proteïne A of proteïne G is gekoppeld. Proteïne A en proteïne G binden de Fc-regio van antilichamen. Incubatie met antilichaam duurt doorgaans 12 tot 16 uur bij 4 °C met rotatie. Een fractie van het celextract (1 tot 5%) wordt vóór de immunoprecipitatie apart gehouden als input-controle: deze input bewijst dat het te bestuderen DNA-gebied aanwezig en amplificeerbaar is in het uitgangsmateriaal. Naast het specifieke antilichaam wordt altijd een isotype-controle antilichaam (IgG) gebruikt als negatieve controle, om niet-specifieke precipitatie in kaart te brengen.
Na immunoprecipitatie worden de beads extensief gewassen om niet-specifiek gebonden chromatine te verwijderen. Het wasprincipe is stringentieopbouw: achtereenvolgende wasbuffers met oplopende concentratie natriumchloride (low-salt wash, high-salt wash), gevolgd door een lithiumchloridewas en een TE-wassing. Elutie van de specifiek geprecipiteerde complexen van de beads vindt plaats met een SDS-houdende elutiebuffer. Daarna worden de covalente cross-links omgekeerd door incubatie bij 65 °C gedurende vier tot zestien uur. RNA wordt verwijderd door behandeling met RNase A; eiwitten worden verwijderd door behandeling met proteinase K. Het gezuiverde ChIP-DNA is het eindproduct dat voor analyse gereed is.
De eenvoudigste analysemethode is ChIP-qPCR: kwantitatieve PCR (qPCR) met primers die een specifiek genomisch locus amplificeren. De verrijking wordt uitgedrukt als percentage van de input (percent input methode): het Ct-verschil tussen ChIP-DNA en de input-fractie geeft de relatieve hoeveelheid precipiteerd DNA bij het doellocus. ChIP-qPCR is geschikt voor de validatie van hypothesen over bekende bindingslocaties en voor de kwantificering van histonmodificaties op specifieke genloci zoals promotors en enhancers. De methode is relatief goedkoop en snel, maar beperkt tot vooraf geselecteerde genomische regio's.
ChIP-seq koppelt de immunoprecipitatiestap aan next-generation sequencing (NGS). Na ChIP wordt het gezuiverde DNA omgezet in een sequencing-bibliotheek via eindrepair, A-tailing en ligatieadapters. Na PCR-amplificatie wordt de bibliotheek op een NGS-platform gesequenced, waarna bioinformatische analyse de reads uitlijnt op het referentiegenoom en bindingspieken identificeert met programma's als MACS2 of HOMER. ChIP-seq levert een genoombreed overzicht van alle bindingslocaties van het bestudeerde eiwit of alle genomische posities met een specifieke histonmodificatie. De technologie heeft de epigenetica getransformeerd: de ENCODE-projecten en Roadmap Epigenomics-initiatieven hebben genoomwijde histonmodificatie- en transcriptiefactor-bindingskaarten gegenereerd voor honderden celtypen en weefsels.
De kern van het nucleosoom bestaat uit een octameer met twee kopieën van elk van de vier kernhistonen: H2A, H2B, H3 en H4. Een vijfde histon, H1, fungeert als linker-histon dat het DNA vasthoudt bij de ingang en uitgang van het nucleosoom en bijdraagt aan hogere-orde chromatinecompactie. De staarten van kernhistonen — met name H3 en H4 — zijn de voornaamste dragers van epigenetische modificaties die via ChIP in kaart worden gebracht:
De hierboven genoemde modificaties worden bepaald door enzymen die histonen chemisch modificeren (schrijvers: methyltransferasen, acetyltransferasen) en enzymen die modificaties verwijderen (gummen: demetylasen, deacetylasen). ChIP maakt het mogelijk de genoomwijde distributie van elk van deze modificaties te bepalen door een antilichaam te gebruiken dat specifiek de betreffende chemische modificatie herkent.
Gewone immunoprecipitatie (IP) en co-immunoprecipitatie (co-IP) isoleren eiwitten of eiwitcomplexen uit een celextract. Het eindproduct van een IP- of co-IP-experiment is een eiwit of een eiwit-eiwit-complex, dat vervolgens via western blot of massaspectrometrie wordt geanalyseerd. ChIP richt zich specifiek op de DNA-component van een eiwit-DNA-complex. Het eindproduct van ChIP is DNA — een specifiek genomisch fragment — dat vervolgens via qPCR of sequencing wordt geanalyseerd. ChIP combineert de specificiteit van antilichaamherkenning (de IP-stap) met nucleïnezuuranalyse (qPCR of NGS). Een aanverwante techniek is RIP (RNA-immunoprecipitatie), waarbij het doelwit RNA is in plaats van DNA.
ELISA en immunoprecipitatie zijn beide antilichaam-gebaseerde technieken, maar ze dienen een ander doel. ELISA kwantificeert de hoeveelheid van een specifiek eiwit of antigeen in een oplossing via enzymgekoppelde antilichaamdetectie in een microtiterplaat. ELISA geeft geen informatie over de genomische lokalisatie van het eiwit of zijn DNA-interacties. Immunoprecipitatie isoleert een specifiek molecuul uit een complex mengsel voor verdere analyse. ChIP combineert het IP-principe met DNA-analyse en is daarmee een fundamenteel andere toepassing dan ELISA. Beide technieken zijn complementair in de moleculaire biologie: ELISA voor eiwitkwantificering, ChIP voor DNA-bindingsanalyse. Een directe vergelijking van ELISA versus IP-analyse is daarom niet zinvol — ze beantwoorden verschillende biologische vragen.
ChIP is de immunoprecipitatiestap die eiwit-gebonden DNA-fragmenten isoleert. ChIP-seq is de combinatie van ChIP met next-generation sequencing als analysemethode. Naast ChIP-seq bestaat ook ChIP-qPCR, waarbij het ChIP-DNA wordt geanalyseerd met qPCR op vooraf geselecteerde loci. De keuze tussen ChIP-qPCR en ChIP-seq hangt af van de onderzoeksvraag:
De fundamenten van ChIP werden gelegd in de jaren tachtig van de twintigste eeuw. John Lis en collega's aan Cornell University publiceerden in 1984 een van de vroegste beschrijvingen van immunoprecipitatie van chromatine om eiwitbinding aan specifieke genen te bestuderen. David Gilmour en John Lis beschreven in 1984 en 1985 protocollen waarbij antilichamen werden gebruikt om RNA-polymerase II op hitteshockgen-promotors van Drosophila te detecteren. Mark Groudine droeg bij aan de vroege ontwikkeling van chromatine-immunoprecipitatie-protocollen voor detectie van transcriptiefactoren. De moderne ChIP-protocollen, geoptimaliseerd voor sonicatie-gebaseerde fragmentatie en magnetische beads, zijn gebaseerd op werk van verschillende groepen in de jaren negentig, met belangrijke bijdragen van Peggy Farnham op het gebied van ChIP-protocollen voor transcriptiefactoren, en van C. David Allis voor de karakterisering van histonmodificaties. De doorbraak naar ChIP-seq werd in 2007 gepubliceerd in gelijktijdige artikelen door de groepen van Richard Young (MIT), Bradley Bernstein (Broad Institute) en Bing Ren (Salk Institute).
Voor het bepalen van de genomische lokalisatie van specifieke histonmodificaties is het ChIP-protocol grotendeels gelijk aan het standaardprotocol, maar met enkele specifieke aandachtspunten. Voor histonmodificaties wordt in sommige protocollen geen formaldehyde-cross-linking gebruikt (native ChIP of nChIP), omdat histonen al van nature sterk en stabiel aan DNA zijn gebonden. MNase-digestie is bij nChIP de voorkeurswijze voor fragmentatie, omdat het DNA knipt op de nucleosoomlinker en compacte mononucleosoomdomeinen vrijmaakt. Het antilichaam dat specifiek de gemodificeerde histonstaart herkent — bijvoorbeeld anti-H3K4me3 of anti-H3K27ac — moet worden gevalideerd op een western blot alvorens het voor ChIP wordt ingezet: het antilichaam moet de juiste band van de juiste grootte herkennen in een totale cel-histoonextractie. Na ChIP-seq met histonantilichamen worden de bindingspieken geclassificeerd naar type: scherpe smalle pieken typeren transcriptiefactorbinding of H3K4me3 op actieve promotors; brede domeinen typeren H3K27me3-repressiegebieden of H3K36me3 over hele genbodies.
ChIP-seq is de gouden standaard voor het bepalen van de genoomwijde bindingslocaties van transcriptiefactoren. Door ChIP-seq-data van een transcriptiefactor te combineren met RNA-seq-data van genexpressie, is het mogelijk regulatoire netwerken te reconstrueren: welke genen worden direct of indirect gereguleerd door een specifieke transcriptiefactor? Insulatoreiwitten zoals CTCF structureren het genoom in topologische domeinen (TADs) en hun ChIP-seq-kaarten zijn essentieel voor het begrijpen van chromatineorganisatie. ChIP-seq van RNA-polymerase II en zijn fosforyleerde varianten laat de transcriptioneel actieve genomische regio's zien.
Aberrante histonmodificatiepatronen zijn een kenmerk van kanker. Verlies van H3K27me3 bij tumoronderdrukkende genen, abnormale H3K4me3-verrijking bij oncogenen, en ectopische activering van enhancers via H3K27ac-verrijking worden gedocumenteerd via ChIP-seq. Bij acute myeloïde leukemie (AML) worden specifieke superenhancers — gebieden met uitzonderlijk hoge H3K27ac-verrijking — geassocieerd met oncogenactivering en zijn potentiële therapeutische targets voor BET-remmers (bromodomeinremmers die H3K27ac-lezers blokkeren). Vergelijkende ChIP-seq van tumorcellen versus normale cellen geeft inzicht in de epigenomische verschillen die bijdragen aan maligne transformatie.
Histonmodificatiepatronen veranderen dramatisch tijdens celdifferentiatie. ChIP-seq van embryonale stamcellen toonde dat poised enhancers — regio's met zowel H3K4me1 als H3K27me3 — bij activering tijdens differentiatie H3K27ac verwerven en transcriptieactivering initiëren. Bivalente promotors — met zowel H3K4me3 (activering) als H3K27me3 (repressie) — zijn kenmerkend voor ontwikkelingsgenen in pluripotente stamcellen die klaar staan voor activering of definitieve repressie bij differentiatie.
Epigenetische modificaties zijn reversibel en daarmee aantrekkelijke farmacologische targets. HDAC-remmers (histondeacetylase-remmers, zoals vorinostat en romidepsine, goedgekeurd voor T-cel-lymfoom) verhogen de globale H3K27ac-niveaus en herstellen genexpressie van tumoronderdrukkende genen. EZH2-remmers (zoals tazemetostat) blokkeren H3K27-trimethylering door het Polycomb-complex en worden ingezet bij EZH2-gemuteerde lymfomen. ChIP-seq wordt bij de ontwikkeling van al deze epigenetische geneesmiddelen gebruikt om het mechanisme te valideren en off-target-effecten in kaart te brengen.
Chromatine vervult in de celkern drie samenhangende functies. Ten eerste compactie: het menselijk genoom bevat circa 3,2 miljard basenparen DNA met een totale gestrekte lengte van ongeveer twee meter, die in een celkern van vijf tot tien micrometer diameter moet passen. Nucleosoomvorming en hogere-orde chromatinecompactie reduceren de effectieve lengte van het DNA meer dan tienduizendvoudig. Ten tweede genregulatie: de toegankelijkheid van het DNA voor de transcriptiemachinerie wordt bepaald door de chromatinestructuur. Open chromatine (euchromatine) is toegankelijk voor transcriptiefactoren; gesloten chromatine (heterochromatine) is gecompacteerd en transcriptioneel stil. De regionale chromatinetoegankelijkheid wordt gedefinieerd door histonmodificaties, nucleosoompositionering en chromatine-remodellering-complexen. Ten derde DNA-bescherming: chromatinecompactie beschermt het DNA tegen schade en regulatoire genregio's zijn specifiek toegankelijk via chromatineopening die wordt gedetecteerd door technieken als ATAC-seq en DNase-seq, aanvullend op ChIP.
De term chromatinekorrels (ook: chromatinedruppeltjes of condensaten) verwijst naar vloeibaar-vloeistof-phasescheiding van transcriptieactieve condensaten in de celkern. Transcriptiefactoren, coactivatoren en RNA-polymerase II kunnen in bepaalde condities vloeistofachtige, dynamische condensaten vormen op actieve superenhancers. Deze condensaten concentreren de transcriptiemachinerie op actieve genomische loci en worden wetenschappelijk bestudeerd met ChIP in combinatie met beeldvormende methoden. De term "chromatinekorrels" kan ook verwijzen naar de zichtbare condensaties van heterochromatine die zichtbaar zijn onder de lichtmicroscoop na kleuring, maar in de moleculaire biologie wordt de term vaker gebruikt in de context van chromatinecondensaten. Wat doet chromatine in bredere zin: het organiseert het genoom functioneel in transcriptioneel actieve en stille domeinen en reguleert daarmee alle celtype-specifieke genexpressiepatronen.
CUT&RUN (Cleavage Under Targets and Release Using Nuclease) en CUT&TAG (Cleavage Under Targets and Tagmentation) zijn technieken die de ChIP-procedure vereenvoudigen en de hoeveelheid benodigde cellen drastisch verlagen. Bij CUT&RUN wordt een antilichaam dat aan het doeleiwit bindt gekoppeld aan proteine A-MNase (pA-MNase). Het enzym knipt het DNA rondom het bindingseiwit in de intacte cel, en de vrijgekomen DNA-fragmenten worden gesequenced. Voordelen ten opzichte van ChIP-seq zijn: geen formaldehyde-cross-linking nodig, lagere achtergrond, minder startmateriaal (1.000 tot 100.000 cellen versus miljoenen voor standaard-ChIP), en snellere uitvoering. CUT&TAG vervangt de MNase door Tn5-transposase: het antilichaam-gebonden Tn5 knipt en tagt het DNA tegelijkertijd, wat library-bereiding sterk vereenvoudigt en de techniek geschikt maakt voor single-cell-toepassingen.
Standaard-ChIP-seq geeft een gemiddeld signaal van een populatie cellen en kan celtype-specifieke heterogeniteit maskeren. scChIP-seq maakt genoomwijde histonmodificatieprofilering per individuele cel mogelijk via microfluïdische cel-encapsulering of combinatorische indexering. De technologie is recent en heeft een lagere genomische dekking per cel vergeleken met bulk ChIP-seq, maar maakt het mogelijk zeldzame celpopulaties met een afwijkend epigenoom te identificeren in heterogene tumormonsters of ontwikkelende weefsels.
ChIP-MS koppelt de immunoprecipitatie van chromatinecomplexen aan proteoomanalyse via massaspectrometrie. In plaats van het DNA te analyseren, worden alle eiwitten geïdentificeerd die aan een specifieke genomische regio of histonmodificatie zijn gebonden. Deze benadering is bijzonder geschikt voor het ontdekken van nieuwe chromatine-interactoren en het in kaart brengen van de co-regulatoren van een transcriptiefactor op zijn targetloci.
Chromatine verwijst naar het complex van DNA, histonen en andere eiwitten dat het genoom in de interfasekern organiseert. Chromatide is een term die verwijst naar elk van de twee identieke halven van een gerepliceerd chromosoom tijdens celdeling. Vóór celdeling bestaat elk chromosoom uit twee zusterchromatiden die verbonden zijn via het centromeer. Chromatine is de biochemische compositie; chromatide is een morfologische eenheid zichtbaar tijdens mitose en meiose. ChIP bestudeert de biochemische eigenschappen van chromatine in de interfasekern — de toestand van het genoom buiten celdeling — en is daarmee fundamenteel gericht op chromatine, niet op chromatiden.
In de laboratoriumuitvoering zijn er drie kritieke technische verschillen. Ten eerste de cross-linkstap: standaard-IP voor eiwit-eiwitinteracties heeft deze fixatiestap niet altijd nodig; bij ChIP is formaldehyde-cross-linking bij de meeste protocollen verplicht om eiwit-DNA-interacties stabiel te fixeren. Ten tweede de fragmentatiestap: bij ChIP is sonicatie of MNase-digestie noodzakelijk om chromatine te fragmenteren; bij IP voor oplosbare eiwitten is celdisruptie voldoende. Ten derde de analyse: ChIP-DNA wordt geanalyseerd met qPCR of NGS; bij IP wordt het eluaat geanalyseerd via western blot of massaspectrometrie. Lees meer over IP-gecombineerd-met-western-blot in ons artikel over western blot.
FISH (fluorescentie-in-situ-hybridisatie) is een aanvullende techniek voor de visuele detectie van chromosomale afwijkingen op celkernniveau, maar geeft geen informatie over histonmodificaties of eiwitbindingslocaties. Vergelijkende epigenomische analyse combineert ChIP-seq doorgaans met RNA-seq voor genexpressie, ATAC-seq voor chromatinetoegankelijkheid en Hi-C voor ruimtelijke chromosoomorganisatie.
Een succesvolle ChIP-analyse vereist aandacht voor een aantal kritieke parameters. Antilichaamkwaliteit is de meest bepalende factor: niet elk commercieel antilichaam dat "ChIP-grade" wordt gelabeld, presteert daadwerkelijk goed in ChIP. Validatie via western blot op het totale celextract is de eerste kwaliteitscontrole. Sonicatie-optimalisatie is experimentspecifiek: de juiste sonicatietijd hangt af van het celtype, de celconcentratie en de sonicator. Te lichte sonicatie geeft te grote fragmenten en verminderde resolutie; te zware sonicatie fragmenteert het DNA te klein en vermindert de antilichaam-bindingsefficiëntie. De input-controle is altijd verplicht: zonder input is de kwantificering van ChIP-verrijking niet mogelijk. Het percentage input wordt berekend als de verrijking van het ChIP-monster ten opzichte van de input-fractie bij een referentielocus. Negatieve controles zijn essentieel: een IgG-controle (niet-specifiek antilichaam van dezelfde soort) en een negatieve genomische regio (locus waarvan geen binding verwacht wordt) zijn minimale vereisten voor een valide ChIP-experiment.
Voor een standaard-ChIP-protocol zijn de volgende laboratoriumapparaten en -materialen nodig: een sonicator met microtip (bijv. Branson of Qsonica) voor chromatinefragmentatie, een koelcentrifuge voor celverwerking en wasprocedures, een roterende mixer of orbitaalschudder voor incubatiestappen, een verwarmingsblok of waterbad voor elutie en cross-linkterugzetting, een real-time thermocycler voor ChIP-qPCR, en voor ChIP-seq een NGS-platform of uitbesteding aan een sequencing-dienst. Aan verbruiksartikelen zijn minimaal nodig: centrifugebuizen en reactievaatjes, pipetpunten (nucleasevrij, gefilterd), magnetische beads of agarose-beads met proteïne A/G-coating, antilichamen, protease-remmers, en DNA-zuiveringscolumns of magnetische bead-gebaseerde DNA-zuiveringskits. Bekijk ons assortiment voor biotechnologie en moleculaire biologie.
Immunoprecipitatie (IP) is een techniek waarbij een specifiek molecuul — eiwit, nucleïnezuur of moleculaire complex — uit een complex mengsel wordt geïsoleerd met behulp van een specifiek antilichaam. Het antilichaam bindt het doelmolecuul, en het antilichaam-molecuul-complex wordt vervolgens neergeslagen (geprecipiteerd) via binding aan beads. Na wassen en elutie is het doelmolecuul gezuiverd voor verdere analyse.
Het lysaat van cellen of weefsel wordt geïncubeerd met een specifiek antilichaam dat het doelmolecuul herkent. Het antilichaam-doelmolecuul-complex wordt vervolgens uit de oplossing gehaald via binding aan proteïne A- of proteïne G-gecoate beads (magnetisch of agarose). Na meerdere wasprocedures om niet-specifiek gebonden moleculen te verwijderen, wordt het doelmolecuul van de beads geelueerd. In het geval van ChIP wordt dit gecombineerd met omzetting van de cross-links om het gebonden DNA vrij te maken.
Chromatine wordt ingedeeld in euchromatine en heterochromatine. Euchromatine is losser gepakt, toegankelijk voor transcriptiefactoren en bevat doorgaans actief getranscribeerde genen. Heterochromatine is sterk gecompacteerd en transcriptioneel grotendeels inactief. Constitutief heterochromatine (rond centromeren en telomeren, gekenmerkt door H3K9me3 en H4K20me3) is permanent gesilenceerd. Facultatief heterochromatine (gekenmerkt door H3K27me3 via Polycomb) is celtype-specifiek gesilenceerd en kan bij differentiatie worden geactiveerd. ChIP-seq van H3K9me3 en H3K27me3 brengt de heterochromatine-domeinen genoombreed in kaart.
Chromatine (Engels: chromatin) is de verpakkingsvorm van het genetisch materiaal in de celkern van eukaryoten. De structuur van chromatine bepaalt welke genen worden afgelezen en welke worden uitgeschakeld, en is daarmee een centrale regulator van celdifferentiatie, ontwikkeling en de cellulaire respons op omgevingssignalen. Epigenetische veranderingen in chromatinestructuur — zonder verandering van de DNA-sequentie zelf — kunnen stabiel worden overgedragen bij celdeling en zijn betrokken bij kanker, veroudering en ontwikkelingsstoornissen.
ChIP-seq (Chromatin Immunoprecipitation followed by next-generation Sequencing) combineert chromatine-immunoprecipitatie met massief parallel sequencen. Na de ChIP-stap wordt het verrijkte DNA omgezet in een sequencing-bibliotheek door eindrepair, A-tailing en adapterligatie, gevolgd door PCR-amplificatie. De bibliotheek wordt gesequenced op een NGS-platform, en de ruwe reads worden bioinformatisch gealigneerd op het referentiegenoom. Regio's met een hogere sequencing-diepte dan de achtergrond worden geïdentificeerd als bindingspieken via programma's als MACS2 of HOMER. Het resultaat is een genoomwijde kaart van alle bindingslocaties van het bestudeerde eiwit of de bestudeerde histonmodificatie.
Chromatine en chromosomen zijn twee verschijningsvormen van hetzelfde genetische materiaal. Chromatine is de gedecondenseerde, draadachtige vorm van DNA met geassocieerde histonen en niet-histoneiwitten zoals die voorkomt in de interfasekern. Een chromosoom is de sterk gecompacteerde vorm die zichtbaar wordt tijdens mitose en meiose, wanneer het chromatine via condensineactiviteit wordt opgevouwen tot de karakteristieke X-vormige structuren met centromeer en zusterchromatiden. In een menselijke cel bevat de kern in interfase 46 chromatinevezels die onzichtbaar door elkaar lopen; in metafase zijn dit 46 zichtbare chromosomen. ChIP onderzoekt de chromatinetoestand — eiwitbinding en histonmodificaties — in de interfasekern, niet in de gecondenseerde mitotische chromosoomvorm.
Histonen zijn eiwitten — specifiek H2A, H2B, H3, H4 en linker-histon H1. Chromatine is het grotere complex van DNA en histonen (plus andere geassocieerde eiwitten). Histonen zijn de bouwstenen van het nucleosoom; chromatine is de structuur die ontstaat wanneer het DNA om nucleosomen is gewikkeld en verder is gecompacteerd. ChIP kan zowel de histonen zelf als de chemische modificaties op hun staarten bepalen als ook niet-histoneiwitten die aan chromatine binden.
ChIP sluit aan bij een brede reeks moleculaire en epigenomische technieken in de Labvakhandel-kennisbank. Voor de sequencinganalyse van ChIP-DNA, zie het artikel over next-generation sequencing (NGS). Voor het bestuderen van genexpressie op mRNA-niveau als aanvulling op ChIP, zie het artikel over qPCR / real-time PCR. Voor de detectie van chromosomale afwijkingen in intacte cellen als aanvullende cytogenetische methode, zie het artikel over FISH — fluorescentie-in-situ-hybridisatie. Voor eiwitdetectie en co-immunoprecipitatie als aanvullende methode, zie het artikel over western blot. Voor antilichaam-gebaseerde kwantificering van eiwitten in oplossing, zie het artikel over ELISA — enzyme-linked immunosorbent assay. Voor gelelektroforese als kwaliteitscontrole van sonicatiefragmenten en als aanvullende techniek, zie het artikel over gelelektroforese. Voor de thermodynamische karakterisering van eiwit-DNA-interacties in oplossing is isothermische titratiecalorimetrie (ITC) een aanvullende methode. Voor proteoomanalyse van chromatine-geassocieerde eiwitten zie het artikel over proteomics en 2D-PAGE. Voor DNA-isolatie als voorbereidende stap en vergelijkende techniek, zie het artikel over DNA-isolatie en DNA-extractie. Voor genoombewerking waarbij ChIP wordt ingezet als validatiemethode, zie het artikel over CRISPR-Cas9 en genoombewerking. Voor celkweekmethoden die als basis dienen voor ChIP-experimenten, zie het artikel over celkweektechnieken in het laboratorium. Voor massaspectrometrie als aanvullende analysemethode na ChIP (ChIP-MS), zie het artikel over massaspectrometrie (MS). Voor capillaire elektroforese als kwaliteitscontrolemethode voor ChIP-bibliotheken, zie het artikel over capillaire elektroforese.
Neem contact op voor advies over de juiste verbruiksartikelen en apparatuur voor uw ChIP-experiment. Bekijk ook ons assortiment voor biotechnologie en moleculaire biologie.
Disclaimer: de informatie op deze pagina is bedoeld voor educatieve en informatieve doeleinden en is niet bedoeld als vervanging van professioneel wetenschappelijk advies. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke onderzoeks- of diagnostische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
