Fluorescentie-in-situ-hybridisatie (FISH) is een moleculaire cytogenetische techniek waarbij fluorescent gelabelde DNA-probes specifieke nucleotidesequenties in intacte cellen of weefsels zichtbaar maken. In tegenstelling tot technieken waarbij DNA eerst uit de cel wordt geïsoleerd, hybridiseert de probe rechtstreeks aan het chromosomale DNA in het preparaat — vandaar de toevoeging "in situ", Latijn voor "op de oorspronkelijke plaats". Het resultaat is een punt van licht (een signaalspot) dat met een fluorescentiemicroscoop kan worden gezien en geteld. FISH wordt ingezet voor de detectie van chromosomale afwijkingen in de prenatale diagnostiek, oncologie, hematologie en fundamenteel genetisch onderzoek.
Hybridisatie is de vorming van een dubbelstrengs nucleïnezuurmolecuul door twee complementaire enkelvoudige strengen die via waterstofbruggen aan elkaar binden. Bij in-situ-hybridisatie (ISH) vindt dit proces niet in een reageerbuis maar rechtstreeks in het biologische preparaat plaats — in de chromosomen van een cel op een objectglas of in een weefselcoupe. De celstructuur blijft behouden, zodat de ligging van een sequentie op een specifiek chromosoom of in een specifiek weefselcompartiment direct zichtbaar is.
FISH is de fluorescente variant van klassieke ISH. Vroegere ISH-protocollen gebruikten radioactief gelabelde probes (autoradiografie) of enzymatische kleuringsreacties (chromogeen ISH, CISH). FISH verving deze methoden voor het merendeel van de diagnostische toepassingen omdat fluorescentie geen radioactief afval produceert, meerdere kleuren tegelijk mogelijk maakt (multiplex FISH) en resultaten sneller beschikbaar zijn.
Een FISH-probe is een enkelvoudig DNA-fragment — typisch 100 bp tot enkele honderden kilobasenparen lang — waaraan fluoroforen zijn gekoppeld. De probe is complementair aan de doelsequentie in het celpreparaat. Er bestaan vier hoofdtypen:
Probes worden gefabriceerd via nick-translatie of willekeurige primerverlenging waarbij fluorescent gemodificeerde nucleotiden (direct labeling: FITC, Cy3, Cy5) of haptenen (indirect labeling: biotine, digoxigenine — detectie via fluorescent anti-biotine of anti-digoxigenine antilichamen) worden ingebouwd.
Het FISH-protocol verloopt in vijf opeenvolgende stappen die in het schema hierboven zijn samengevat.
Cellen worden gefixeerd in methanol:azijnzuur (3:1) en als dunne laag op een objectglas uitgestreken (cytologisch preparaat). Voor chromosoomanalyse worden cellen eerst in metafase-arrest gebracht via colchicine of colcemide, die de spindelvorming remmen en de chromosomen condenseren. Weefselcoupes (FFPE of vriessecties) worden op silaangecoate objectglasjes gebracht en ontparaffineerd. De preparaten worden gedroogd en kort behandeld met pepsin of proteinase K om chromatine-eiwitten te verwijderen die de hybridisatie kunnen belemmeren.
Dubbelstrengs DNA wordt thermisch gedenatureerd tot enkelvoudige strengen. Gebruikelijke omstandigheden zijn 70—80 °C in een formamide/2×SSC-buffer gedurende 2—5 minuten. Formamide verlaagt de smelttemperatuur (Tm) van DNA, waardoor denaturatie bij een lagere temperatuur mogelijk is en het preparaat minder schade oploopt. Probe en preparaat kunnen gelijktijdig (co-denaturatie) of apart worden gedenatureerd.
De gedenatureerde probe in hybridisatiebuffer (formamide, dextransulfaat, SSC) wordt op het preparaat aangebracht en met een dekglaasje afgedicht. Dextransulfaat verhoogt de effectieve probeconcentratie door water-activiteit te verlagen. Hybridisatie vindt plaats bij 37 °C gedurende 12—16 uur in een vochtige hybridisatieoven. Tijdens hybridisatie zoekt de probe via Watson-Crick-basenparing de complementaire chromosomale sequentie.
Niet-specifiek gebonden probe wordt verwijderd door wassen in SSC-oplossingen van oplopende stringentie (lagere SSC-concentratie en/of hogere temperatuur vergroot de specificiteit). Een typisch schema is 2×SSC bij kamertemperatuur gevolgd door 0,4×SSC bij 72 °C, 2 minuten. De stringentie is de kritieke parameter: te laag geeft achtergrond van aspecifieke binding; te hoog verwijdert ook specifieke signalen bij niet-perfecte complementariteit (gebruikt bij repetitieve sequenties).
Na wassen wordt DAPI aangebracht als tegenkleuring van de celkern. DAPI bindt aan AT-rijke sequenties en geeft een blauw chromosomaal patroon dat de celkern zichtbaar maakt en als referentiekader dient voor de gekleurde signaalspots. Het preparaat wordt ingebed in anti-fade montagemedium (DABCO, ProLong Gold). Analyse vindt plaats met een fluorescentiemicroscoop met geschikte filtersets. Per cel worden de signaalspots geteld; minstens 200 cellen worden geanalyseerd voor statistische betrouwbaarheid bij diagnostiek.
FISH is de snelste methode voor de detectie van trisomie 21 (Down-syndroom), trisomie 18, trisomie 13, en geslachtschromosoomafwijkingen in cellen uit vruchtwater (amniocentese) of chorionvlokken. Met de aneuploïdieprobe (Vysis AneuVysion) voor de chromosomen 13, 18, 21, X en Y is een resultaat beschikbaar in 24—48 uur — aanzienlijk sneller dan de klassieke karyotypering (10—14 dagen). FISH is ook de methode voor de detectie van microdeleties die met conventionele karyotypering niet zichtbaar zijn, zoals deletie 22q11 (DiGeorge-syndroom), deletie 5p (cri-du-chat) en deletie 15q11 (Prader-Willi/Angelman).
FISH is onmisbaar in de moleculaire pathologie voor behandelkeuze bij verschillende kankertypen:
Bij hematologische maligniteiten biedt FISH een voordeel boven conventionele karyotypering doordat ook interfasecellen (niet-delende cellen) kunnen worden geanalyseerd. Conventionele karyotypering vereist delende cellen in metafase. In klinische hematologie wordt FISH gecombineerd met flowcytometrie voor een volledig immunofenotypisch en cytogenetisch profiel.
In de basiswetenschap is FISH een essentieel instrument voor genoomcartografie, de studie van chromosoomorganisatie in de celkern (chromosoomterritoria), analyse van genduplicaties en -deleties bij evolutionaire studies, en de validatie van genomische herrangschikkingen ontdekt via next-generation sequencing. Voor de detectie van individuele RNA-moleculen in cellen wordt smFISH (single-molecule FISH) ingezet; deze techniek wordt verderop in dit artikel behandeld.
ISH (in-situ-hybridisatie) is de overkoepelende term voor alle technieken waarbij een gelabelde probe in intacte preparaten aan doelsequenties bindt. FISH is de specifieke variant waarbij de probe fluorescent is gelabeld en detectie via fluorescentiemicroscopie plaatsvindt. Andere ISH-varianten zijn CISH (chromogeen ISH, met enzymatische kleuring — detecteerbaar met een gewone lichtmicroscoop, geschikt voor routinepathologie), SISH (zilver-versterkte ISH), en radioactieve ISH (nu grotendeels verlaten). CISH heeft als voordeel dat een fluorescentiemicroscoop niet nodig is en preparaten duurzaam zijn; als nadeel is gelijktijdige meerkleuren-analyse moeilijker dan bij FISH.
Zowel FISH als PCR kunnen specifieke DNA-sequenties aantonen, maar ze geven andere informatie. PCR (waaronder qPCR en RT-PCR) detecteert en kwantificeert DNA- of RNA-sequenties in een celextract en geeft geen informatie over de chromosomale ligging of het ruimtelijke patroon in de cel. FISH behoudt de ruimtelijke context en toont de exacte chromosomale lokalisatie. In de oncologie zijn PCR en FISH complementair: FISH wordt gebruikt voor visuele bevestiging van kopieaantallen of fusiegenen op chromosoomniveau; qPCR (BCR-ABL International Scale) is gevoeliger voor kwantitatieve monitoring van minimale residuale ziekte in het bloed.
Standaard-FISH gebruikt 1—3 probekleuren per analyse. Geavanceerde multiplex-FISH-varianten kleuren alle 24 menselijke chromosomen gelijktijdig elk in een unieke kleur:
M-FISH (Multiplex FISH) en SKY (Spectral Karyotyping) gebruiken 5 fluoroforen in combinaties die via spectraalmeting worden onderscheiden. Elk chromosoom krijgt een unieke kleurcode. Beide technieken zijn bijzonder nuttig voor de identificatie van complexe chromosomale herrangschikkingen en markerchromosomen die met conventionele karyotypering of standaard FISH niet te karakteriseren zijn. Ze worden ingezet in onderzoekslaboratoria en gespecialiseerde cytogenetische centra voor tumorgenetica en de studie van chromosomale instabiliteit.
RNA-FISH, smFISH en MERFISH richten zich op mRNA-moleculen in plaats van genomisch DNA. smFISH (single-molecule FISH) telt individuele mRNA-moleculen via tientallen overlappende probes per doelmolecuul; MERFISH (Multiplexed Error-Robust FISH) maakt het mogelijk honderden genen gelijktijdig op mRNA-niveau in individuele cellen te detecteren, wat een revolutionaire bijdrage levert aan de single-cell transcriptomics.
De monstervoorbereiding hangt af van het type uitgangsmateriaal:
Perifeer bloed en beenmerg: erytrocyten worden gelyseerd met hypotoon KCl-behandeling; leukocyten worden gecentrifugeerd en in methanol:azijnzuur gefixeerd. Eventueel na kortstondige kweek (24—48 uur) voor een hogere mitose-index.
Vruchtwater (amniocentese): cellen worden na centrifugatie direct gefixeerd. Voor snelle aneuploïdie-detectie (FISH) is geen kweek vereist. Voor volledig karyotype is 10—14 dagen kweek noodzakelijk. Bewaring van restmateriaal — inclusief cryogene opslag — is standaard.
FFPE-weefsel: coupes (4—5 μm) worden ontparaffineerd in xyleen, gerehydrateerd en behandeld met citraatbuffer (warmte-antigeen-terugwinning) en pepsin. FFPE-weefsel geeft vaak meer signaaloverloop (signal overlap) dan verse cellen door kerncompressie in de coupe.
Urine: cellen worden geconcentreerd via centrifugatie en gefixeerd. Voor de UroVysion-blaaskankertest worden minimaal 25 epitheelcellen geanalyseerd per monster.
Zowel Southern blot als FISH detecteren specifieke DNA-sequenties via hybridisatie met een probe, maar de methode en de toepassing verschillen fundamenteel. Southern blot isoleert genomisch DNA, splitst het met restrictie-enzymen, scheidt de fragmenten via gelelectroforese, draagt ze over naar een membraan en laat de probe hybridiseren aan de gefixeerde DNA-banden. Het resultaat is een bandenpatroon op een membraan dat informatie geeft over fragmentgrootte en restrictieprofiel — maar geen chromosomale lokalisatie. FISH behoudt het DNA in de cel en laat de probe hybridiseren in de chromosomale context; het resultaat is een beeld van een cel met gekleurde spots op de juiste chromosomale posities. Southern blot is vrijwel verlaten voor diagnostiek en wordt vervangen door NGS en PCR; FISH blijft standaard in cytogenetische diagnostiek.
FISH is onlosmakelijk verbonden met twee andere fluorescente technieken. De fluoroforen op de probe gehoorzamen aan de basisprincipes van fluorescentie-spectroscopie: absorptie van licht op de excitatiegolflengte, Stokes-verschuiving, emissie op een langere golflengte. De keuze van fluorofoor bepaalt welke excitatie- en emissiefilters op de microscoop nodig zijn. FISH-analyse vindt altijd plaats via fluorescentie-microscopie of geautomatiseerde beeldanalyse. De DAPI-tegenkleuring — standaard bij FISH — is dezelfde kleurstof die breed wordt ingezet in fluorescentiemicroscopie voor kernvisualisatie. Fotobleking van de FISH-signalen is een praktische valkuil: montagemedium met anti-fade (DABCO, ProLong Gold) verlengt de levensduur van de signalen significant.
FISH wordt gebruikt als validatiemethode voor CRISPR-Cas9-bewerkingen. Na CRISPR-gemedieerde deletie of insertie op een specifieke chromosomale locatie laat FISH zien of de verwachte kopieaantalverandering heeft plaatsgevonden en of de herrangschikking op de juiste chromosomale positie zit. Omgekeerd kan FISH grote chromosomale off-target events detecteren die door sequencing alleen moeilijk te vinden zijn. De combinatie van CRISPR/NGS (kleine varianten) en FISH (grootschalige chromosomale effecten) geeft een completere veiligheidsevaluatie bij therapeutische toepassingen.
Moderne diagnostische laboratoria maken gebruik van geautomatiseerde FISH-analysesystemen (bijv. MetaSystems Metafer, Applied Spectral Imaging) die honderden cellen per uur scannen en signaalspots automatisch tellen. Digitale pathologen analyseren FISH-preparaten op gedigitaliseerde whole-slide images. Kunstmatige intelligentie-algoritmen worden getraind op FISH-signaalpatronen voor HER2, ALK en BCR-ABL, wat de interobserver-variabiliteit vermindert en de doorvoer verhoogt in grote diagnostische centra.
FISH is een van de drie klassieke hybridisatietechnieken naast Southern blot (DNA) en Northern blot (RNA). Voor de detectie van RNA-expressie op celniveau is RNA-FISH de in-situ-variant; voor kwantitatieve expressie-analyse in oplossing wordt qPCR en RT-PCR gebruikt. Chromosomale kopieaantalvariaties in het gehele genoom worden tegenwoordig ook bepaald via array-CGH (comparative genomic hybridization) en whole genome sequencing. Voor eiwitlokalisatie in de cel is immunofluorescentie de equivalent van FISH. Co-immunoprecipitatie (co-IP) en Western blot analyseren eiwitinteracties en -expressie als aanvulling op de genetische informatie van FISH. Voor de analyse van de binding van eiwitten aan specifieke genomische loci — histonmodificaties en transcriptiefactoren — is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende epigenomische methode. Celscheiding voor aanvullende analyse van FISH-positieve cellen is mogelijk via flowcytometrie en FACS-sortering.
Voor een FISH-procedure zijn onder meer de volgende materialen nodig: hybridisatieoven of vochtige kamer met externe verwarming (voor co-denaturatie en hybridisatie op objectglas), waterbad op 72 °C (stringent wassen), fluorescentiemicroscoop met DAPI-, FITC- en Cy3/Cy5-filtersets, objectglasjes (silaangecoat of polylysine-gecoat voor goede adhesie), dekglaasjes (No. 1 dikte voor optimale optiek), pincetten voor objectglashantering, montagemedium met DAPI (VECTASHIELD met DAPI of equivalente producten) en commercieel verkrijgbare FISH-probes (LSI, CEP, WCP). Labvakhandel levert diverse materialen die in het moleculair-biologisch laboratorium worden gebruikt, waaronder pipetpunten, centrifugebuizen en koel- en vriesapparatuur voor probeopslagbeheer.
In situ is Latijn voor "op de oorspronkelijke plaats". In-situ-hybridisatie betekent dat de hybridisatie — de binding van een probe aan de doelsequentie — plaatsvindt in het intacte biologische preparaat (cel op objectglas, weefselcoupe) in plaats van in een buis na DNA-isolatie. De celstructuur en chromosomale context blijven behouden, waardoor de exacte lokalisatie van de doelsequentie zichtbaar is.
FISH combineert twee unieke eigenschappen: het behoudt de ruimtelijke context van het DNA in de cel en maakt de doelsequentie fluorescent zichtbaar onder de microscoop. Dit maakt directe telling van chromosomale kopieaantallen per cel mogelijk, detectie van chromosomale translocaties en deleties die niet zichtbaar zijn met conventionele karyotypering, en snelle diagnostiek (24—48 uur) zonder celkweek. In de oncologie is FISH onmisbaar voor behandelkeuze bij HER2-positieve borstkanker, CML, NSCLC en lymfomen.
ISH is de verzamelnaam voor alle in-situ-hybridisatiemethoden. FISH is de variant met fluorescent gelabelde probes; CISH (chromogeen ISH) gebruikt enzymatische kleuring detecteerbaar met een gewone lichtmicroscoop; radioactieve ISH is verouderd. FISH biedt multikleurenanalyse en is gevoeliger; CISH heeft als voordeel dat geen fluorescentiemicroscoop nodig is en preparaten permanent zijn.
FISH verloopt in vijf stappen: (1) fixatie en preparaatvoorbereiding, (2) denaturatie van dubbelstrengs DNA in het preparaat, (3) hybridisatie van de fluorescent gelabelde probe aan de doelsequentie (12—16 uur, 37 °C), (4) stringent wassen om ongebonden probe te verwijderen, en (5) DAPI-tegenkleuring en analyse via fluorescentiemicroscopie waarbij signaalspots per cel worden geteld. Het volledige protocol neemt 24—48 uur in beslag.
Ja, FISH en CISH worden gebruikt voor de detectie van humaan papillomavirus (HPV) DNA in biopten van het baarmoederhalskanaal en orofaryngeale tumoren. Een probe gericht op het HPV-genoom hybridiseert aan viraal DNA dat geïntegreerd is in het gastheerchromosoom of aanwezig is als episomaal DNA in de cel. De test onderscheidt geïntegreerd HPV (geassocieerd met maligne transformatie, diffuus puntpatroon) van episomaal HPV (actieve virusreplicatie, clusters van signalen). Voor de klinische HPV-test in baarmoederhalsscreening worden echter doorgaans PCR-gebaseerde methoden gebruikt vanwege de hogere gevoeligheid en betere doorvoer.
De voornaamste beperkingen zijn: (1) FISH detecteert alleen sequenties waarvoor een specifieke probe beschikbaar is — onbekende afwijkingen worden gemist; (2) balanceerde translocaties zonder kopieaantalverandering zijn niet detecteerbaar; (3) de techniek is arbeidsintensief en vereist geoefend personeel; (4) fluorescentiesignalen vervagen bij langdurige bewaring en belichting; (5) interpretatie bij complexe karyotypen of laag percentage afwijkende cellen is moeilijk.
Immunohistochemie (IHC) bepaalt de hoeveelheid HER2-eiwit op de celmembraan via antilichaamkleuring (score 0, 1+, 2+, 3+). FISH bepaalt het aantal kopieën van het HER2-gen op chromosoom 17q12. IHC wordt als eerste stap uitgevoerd vanwege lagere kosten en eenvoudigere uitvoering; bij een equivocale IHC-score 2+ is FISH verplicht conform ASCO/CAP-richtlijnen om te bevestigen of er werkelijk HER2-genamplificatie aanwezig is. IHC-score 3+ en FISH-amplificatie zijn beide indicaties voor HER2-gerichte therapie.
Een arts vraagt FISH aan bij: (1) verdenking op chromosomale afwijkingen in de prenatale diagnostiek (amniocentese, chorionvlokkentest), (2) diagnose of subclassificatie van leukemie en lymfoom waarbij chromosomale translocaties behandelrelevant zijn, (3) equivocale HER2-IHC bij borstkanker, (4) NSCLC voor detectie van ALK, ROS1 of MET-afwijkingen als indicatie voor targeted therapie, (5) verdenking op microdeleties (DiGeorge, Prader-Willi), en (6) monitoring van cytogenetische respons bij CML-patiënten in behandeling met tyrosinekinaseremmers.
Disclaimer: de informatie op deze pagina is bedoeld voor educatieve doeleinden en is niet bedoeld als medisch of diagnostisch advies. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke klinische of analytische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
