Fluorescentie-in-situ-hybridisatie (FISH) is een moleculaire cytogenetische techniek waarbij fluorescent gelabelde DNA-probes specifieke nucleotidesequenties in intacte cellen of weefsels zichtbaar maken. In tegenstelling tot technieken waarbij DNA eerst uit de cel wordt geïsoleerd, hybridiseert de probe rechtstreeks aan het chromosomale DNA in het preparaat — vandaar de toevoeging "in situ", Latijn voor "op de oorspronkelijke plaats". Het resultaat is een punt van licht (een signaalspot) dat met een fluorescentiemicroscoop kan worden gezien en geteld. FISH wordt ingezet voor de detectie van chromosomale afwijkingen in de prenatale diagnostiek, oncologie en hematologie, voor fundamenteel genetisch onderzoek, en voor de identificatie van micro-organismen in milieu, voeding en klinische microbiologie. Voor nanoscopische visualisatie van afzonderlijke RNA-moleculen in cellen via hybridisatieprobes worden FISH-varianten gecombineerd met super-resolutiemicroscopie (DNA-PAINT, STED-FISH).
Hybridisatie is de vorming van een dubbelstrengs nucleïnezuurmolecuul door twee complementaire enkelvoudige strengen die via waterstofbruggen aan elkaar binden. Bij in-situ-hybridisatie (ISH) vindt dit proces niet in een reageerbuis maar rechtstreeks in het biologische preparaat plaats — in de chromosomen van een cel op een objectglas of in een weefselcoupe. De celstructuur blijft behouden, zodat de ligging van een sequentie op een specifiek chromosoom of in een specifiek weefselcompartiment direct zichtbaar is.
FISH is de fluorescente variant van klassieke ISH. Vroegere ISH-protocollen gebruikten radioactief gelabelde probes (autoradiografie) of enzymatische kleuringsreacties (chromogeen ISH, CISH). FISH verving deze methoden voor het merendeel van de diagnostische toepassingen omdat fluorescentie geen radioactief afval produceert, meerdere kleuren tegelijk mogelijk maakt (multiplex FISH) en resultaten sneller beschikbaar zijn.
Een FISH-probe is een enkelvoudig DNA-fragment — typisch 100 bp tot enkele honderden kilobasenparen lang — waaraan fluoroforen zijn gekoppeld. De probe is complementair aan de doelsequentie in het celpreparaat. Er bestaan vier hoofdtypen:
Probes worden gefabriceerd via nick-translatie of willekeurige primerverlenging waarbij fluorescent gemodificeerde nucleotiden (direct labeling: FITC, Cy3, Cy5) of haptenen (indirect labeling: biotine, digoxigenine — detectie via fluorescent anti-biotine of anti-digoxigenine antilichamen) worden ingebouwd.
Het FISH-protocol verloopt in vijf opeenvolgende stappen die in het schema hierboven zijn samengevat.
Cellen worden gefixeerd in methanol:azijnzuur (3:1) en als dunne laag op een objectglas uitgestreken (cytologisch preparaat). Voor chromosoomanalyse worden cellen eerst in metafase-arrest gebracht via colchicine of colcemide, die de spindelvorming remmen en de chromosomen condenseren. Weefselcoupes (FFPE of vriessecties) worden op silaangecoate objectglasjes gebracht en ontparaffineerd. De preparaten worden gedroogd en kort behandeld met pepsin of proteinase K om chromatine-eiwitten te verwijderen die de hybridisatie kunnen belemmeren.
Dubbelstrengs DNA wordt thermisch gedenatureerd tot enkelvoudige strengen. Gebruikelijke omstandigheden zijn 70—80 °C in een formamide/2×SSC-buffer gedurende 2—5 minuten. Formamide verlaagt de smelttemperatuur (Tm) van DNA, waardoor denaturatie bij een lagere temperatuur mogelijk is en het preparaat minder schade oploopt. Probe en preparaat kunnen gelijktijdig (co-denaturatie) of apart worden gedenatureerd. Co-denaturatie vindt plaats op een verwarmde objectglastafel: probe en preparaat worden tegelijk op 75—80 °C gebracht, waarna het objectglas onmiddellijk wordt overgebracht naar de hybridisatieoven. Dit vereenvoudigt het protocol, maar vraagt om nauwkeurige temperatuurcontrole om overkoken van het DNA te voorkomen.
De gedenatureerde probe in hybridisatiebuffer (formamide, dextransulfaat, SSC) wordt op het preparaat aangebracht en met een dekglaasje afgedicht. Dextransulfaat verhoogt de effectieve probeconcentratie door water-activiteit te verlagen. Hybridisatie vindt plaats bij 37 °C gedurende 12—16 uur in een vochtige hybridisatieoven. Tijdens hybridisatie zoekt de probe via Watson-Crick-basenparing de complementaire chromosomale sequentie.
Niet-specifiek gebonden probe wordt verwijderd door wassen in SSC-oplossingen van oplopende stringentie (lagere SSC-concentratie en/of hogere temperatuur vergroot de specificiteit). Een typisch schema is 2×SSC bij kamertemperatuur gevolgd door 0,4×SSC bij 72 °C, 2 minuten. De stringentie is de kritieke parameter: te laag geeft achtergrond van aspecifieke binding; te hoog verwijdert ook specifieke signalen bij niet-perfecte complementariteit (gebruikt bij repetitieve sequenties).
Na wassen wordt DAPI aangebracht als tegenkleuring van de celkern. DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindool) is een fluorescente kleurstof die selectief aan AT-rijke sequenties in de kleine groeve van dubbelstrengs DNA bindt. Bij excitatie op 360 nm emitteert DAPI blauw licht (emissie ~460 nm), wat een helder blauw chromosomaal patroon geeft dat de celkern zichtbaar maakt en als referentiekader dient voor de gekleurde signaalspots van de probes. Doordat DAPI DNA-specifiek is en geen eiwitten kleurt, geeft het een scherpe kernafbakening met duidelijk zichtbare chromosoomstructuren. Het preparaat wordt ingebed in anti-fade montagemedium (DABCO, ProLong Gold). Analyse vindt plaats met een fluorescentiemicroscoop met geschikte filtersets. Per cel worden de signaalspots geteld; minstens 200 cellen worden geanalyseerd voor statistische betrouwbaarheid bij diagnostiek.
De interpretatie van FISH-resultaten berust op het tellen van signaalspots per cel en het vergelijken met de verwachte normale kopieaantallen. In een normale diploïde cel geeft een chromosoomspecifieke probe twee signalen (één per homoloog chromosoom). Afwijkingen worden als volgt herkend:
Een important aandachtspunt bij signaalinterpretatie is de kerntruncatie-artefact: in dunne coupes (4—5 μm FFPE) wordt een deel van elke kern weggesneden, waardoor sommige signalen buiten het analysevlak vallen. Hierdoor kunnen normale cellen soms slechts één signaal tonen in plaats van twee. Standaardcriteria (minimale celdrempels, correctie voor truncatie) zijn per testtype vastgelegd in internationale richtlijnen (ISCN, ASCO/CAP).
FISH is de snelste methode voor de detectie van trisomie 21 (Down-syndroom), trisomie 18, trisomie 13, en geslachtschromosoomafwijkingen in cellen uit vruchtwater (amniocentese) of chorionvlokken. Met de aneuploïdieprobe (Vysis AneuVysion) voor de chromosomen 13, 18, 21, X en Y is een resultaat beschikbaar in 24—48 uur — aanzienlijk sneller dan de klassieke karyotypering (10—14 dagen). FISH is ook de methode voor de detectie van microdeleties die met conventionele karyotypering niet zichtbaar zijn, zoals deletie 22q11 (DiGeorge-syndroom), deletie 5p (cri-du-chat) en deletie 15q11 (Prader-Willi/Angelman).
FISH is onmisbaar in de moleculaire pathologie voor behandelkeuze bij verschillende kankertypen:
Bij hematologische maligniteiten biedt FISH een voordeel boven conventionele karyotypering doordat ook interfasecellen (niet-delende cellen) kunnen worden geanalyseerd. Conventionele karyotypering vereist delende cellen in metafase. In klinische hematologie wordt FISH gecombineerd met flowcytometrie voor een volledig immunofenotypisch en cytogenetisch profiel.
In de basiswetenschap is FISH een essentieel instrument voor genoomcartografie, de studie van chromosoomorganisatie in de celkern (chromosoomterritoria), analyse van genduplicaties en -deleties bij evolutionaire studies, en de validatie van genomische herrangschikkingen ontdekt via next-generation sequencing. Voor de detectie van individuele RNA-moleculen in cellen wordt smFISH (single-molecule FISH) ingezet; deze techniek wordt verderop in dit artikel behandeld.
FISH wordt buiten de humane genetica ook ingezet voor de identificatie en kwantificering van micro-organismen in complexe monsters zonder voorafgaande kweek. Probes gericht op soortspecifieke regio's van het 16S rRNA (bacteriën) of 18S/28S rRNA (schimmels en gisten) binden rechtstreeks aan ribosomaal RNA in de intacte cel, wat een sterk signaal geeft doordat een cel tienduizenden ribosomen bevat. Toepassingen:
Zoals elke diagnostische techniek kent FISH bronnen van fout-negatieve en fout-positieve uitslagen. Fout-negatieve resultaten treden op wanneer een afwijking aanwezig is maar niet wordt gedetecteerd: dit kan het geval zijn bij een zeer laag percentage afwijkende cellen (onder de detectiegrens van ~5—10%), bij complexe herrangschikkingen buiten het probegebied, bij slechte hybridisatiekwaliteit door degradatie van het DNA (FFPE-weefsel van lage kwaliteit) of bij te weinig geanalyseerde cellen. Fout-positieve signalen ontstaan door aspecifieke probeadhesie, overlappende signalen in dikke coupes of technische artefacten als hybridisatie-klonten. Kwaliteitscontroles — meekleuren van controlechromosomen, interne referentieprobes, celdrempelcriteria — reduceren beide typen fouten. Bij twijfelachtige uitslagen wordt FISH gecombineerd met een alternatieve techniek zoals qPCR of array-CGH.
ISH (in-situ-hybridisatie) is de overkoepelende term voor alle technieken waarbij een gelabelde probe in intacte preparaten aan doelsequenties bindt. FISH is de specifieke variant waarbij de probe fluorescent is gelabeld en detectie via fluorescentiemicroscopie plaatsvindt. Andere ISH-varianten zijn CISH (chromogeen ISH, met enzymatische kleuring — detecteerbaar met een gewone lichtmicroscoop, geschikt voor routinepathologie), SISH (zilver-versterkte ISH), en radioactieve ISH (nu grotendeels verlaten). CISH heeft als voordeel dat een fluorescentiemicroscoop niet nodig is en preparaten duurzaam zijn; als nadeel is gelijktijdige meerkleuren-analyse moeilijker dan bij FISH.
Zowel FISH als PCR kunnen specifieke DNA-sequenties aantonen, maar ze geven andere informatie. PCR (waaronder qPCR en RT-PCR) detecteert en kwantificeert DNA- of RNA-sequenties in een celextract en geeft geen informatie over de chromosomale ligging of het ruimtelijke patroon in de cel. FISH behoudt de ruimtelijke context en toont de exacte chromosomale lokalisatie. In de oncologie zijn PCR en FISH complementair: FISH wordt gebruikt voor visuele bevestiging van kopieaantallen of fusiegenen op chromosoomniveau; qPCR (BCR-ABL International Scale) is gevoeliger voor kwantitatieve monitoring van minimale residuale ziekte in het bloed.
FISH en array-CGH (comparative genomic hybridization) zijn beide methoden voor de detectie van chromosomale kopieaantalvariaties, maar ze verschillen fundamenteel in scope en resolutie. FISH analyseert één of enkele specifieke loci per experiment — de onderzoekers of clinici moeten van tevoren weten welke regio relevant is. Array-CGH scant het gehele genoom tegelijk op kopieaantalvariaties met een resolutie van 50—100 kb (bij high-density arrays) en kan zo nieuwe, onverwachte deleties of duplicaties identificeren zonder gerichte hypothese. Het nadeel van array-CGH ten opzichte van FISH is dat chromosomale context in de cel verloren gaat (DNA wordt geëxtraheerd), balanceerde translocaties niet worden gedetecteerd, en de techniek gevoeliger is voor ruis bij laag tumorcelfractie. In de praktijk zijn FISH en array-CGH complementair: array-CGH voor genoombreed onderzoek in de prenatale en postnatale genetica, FISH voor gerichte bevestiging en voor diagnostiek in de tumorpathologie waarbij snel en celspecifiek resultaat vereist is.
Standaard-FISH gebruikt 1—3 probekleuren per analyse. Geavanceerde multiplex-FISH-varianten kleuren alle 24 menselijke chromosomen gelijktijdig elk in een unieke kleur:
M-FISH (Multiplex FISH) en SKY (Spectral Karyotyping) gebruiken 5 fluoroforen in combinaties die via spectraalmeting worden onderscheiden. Elk chromosoom krijgt een unieke kleurcode. Beide technieken zijn bijzonder nuttig voor de identificatie van complexe chromosomale herrangschikkingen en markerchromosomen die met conventionele karyotypering of standaard FISH niet te karakteriseren zijn. Ze worden ingezet in onderzoekslaboratoria en gespecialiseerde cytogenetische centra voor tumorgenetica en de studie van chromosomale instabiliteit.
RNA-FISH, smFISH en MERFISH richten zich op mRNA-moleculen in plaats van genomisch DNA. RNA-FISH maakt genexpressie direct in de cel zichtbaar: probes hybridiseren aan mRNA-transcripten in het cytoplasma of de kern, waardoor de aan- of afwezigheid van expressie op celniveau kan worden vastgesteld zonder extractie of amplificatie. smFISH (single-molecule FISH) telt individuele mRNA-moleculen via tientallen overlappende probes per doelmolecuul; MERFISH (Multiplexed Error-Robust FISH) maakt het mogelijk honderden genen gelijktijdig op mRNA-niveau in individuele cellen te detecteren, wat een revolutionaire bijdrage levert aan de single-cell transcriptomics. Voor de ruimtelijke dimensie van genexpressie in weefselcoupes is RNA-FISH ook de basis van spatial transcriptomics.
De monstervoorbereiding hangt af van het type uitgangsmateriaal:
Perifeer bloed en beenmerg: erytrocyten worden gelyseerd met hypotoon KCl-behandeling; leukocyten worden gecentrifugeerd en in methanol:azijnzuur gefixeerd. Eventueel na kortstondige kweek (24—48 uur) voor een hogere mitose-index.
Vruchtwater (amniocentese): cellen worden na centrifugatie direct gefixeerd. Voor snelle aneuploïdie-detectie (FISH) is geen kweek vereist. Voor volledig karyotype is 10—14 dagen kweek noodzakelijk. Bewaring van restmateriaal — inclusief cryogene opslag — is standaard.
FFPE-weefsel: coupes (4—5 μm) worden ontparaffineerd in xyleen, gerehydrateerd en behandeld met citraatbuffer (warmte-antigeen-terugwinning) en pepsin. FFPE-weefsel geeft vaak meer signaaloverloop (signal overlap) dan verse cellen door kerncompressie in de coupe.
Urine: cellen worden geconcentreerd via centrifugatie en gefixeerd. Voor de UroVysion-blaaskankertest worden minimaal 25 epitheelcellen geanalyseerd per monster.
Zowel Southern blot als FISH detecteren specifieke DNA-sequenties via hybridisatie met een probe, maar de methode en de toepassing verschillen fundamenteel. Southern blot isoleert genomisch DNA, splitst het met restrictie-enzymen, scheidt de fragmenten via gelelectroforese, draagt ze over naar een membraan en laat de probe hybridiseren aan de gefixeerde DNA-banden. Het resultaat is een bandenpatroon op een membraan dat informatie geeft over fragmentgrootte en restrictieprofiel — maar geen chromosomale lokalisatie. FISH behoudt het DNA in de cel en laat de probe hybridiseren in de chromosomale context; het resultaat is een beeld van een cel met gekleurde spots op de juiste chromosomale posities. Southern blot is vrijwel verlaten voor diagnostiek en wordt vervangen door NGS en PCR; FISH blijft standaard in cytogenetische diagnostiek.
FISH is onlosmakelijk verbonden met twee andere fluorescente technieken. De fluoroforen op de probe gehoorzamen aan de basisprincipes van fluorescentie-spectroscopie: absorptie van licht op de excitatiegolflengte, Stokes-verschuiving, emissie op een langere golflengte. De keuze van fluorofoor bepaalt welke excitatie- en emissiefilters op de microscoop nodig zijn. FISH-analyse vindt altijd plaats via fluorescentiemicroscopie of geautomatiseerde beeldanalyse. De DAPI-tegenkleuring — standaard bij FISH — is dezelfde kleurstof die breed wordt ingezet in fluorescentiemicroscopie voor kernvisualisatie. Fotobleking van de FISH-signalen is een praktische valkuil: montagemedium met anti-fade (DABCO, ProLong Gold) verlengt de levensduur van de signalen significant.
FISH wordt gebruikt als validatiemethode voor CRISPR-Cas9-bewerkingen. Na CRISPR-gemedieerde deletie of insertie op een specifieke chromosomale locatie laat FISH zien of de verwachte kopieaantalverandering heeft plaatsgevonden en of de herrangschikking op de juiste chromosomale positie zit. Omgekeerd kan FISH grote chromosomale off-target events detecteren die door sequencing alleen moeilijk te vinden zijn. De combinatie van CRISPR/NGS (kleine varianten) en FISH (grootschalige chromosomale effecten) geeft een completere veiligheidsevaluatie bij therapeutische toepassingen.
Moderne diagnostische laboratoria maken gebruik van geautomatiseerde FISH-analysesystemen (bijv. MetaSystems Metafer, Applied Spectral Imaging) die honderden cellen per uur scannen en signaalspots automatisch tellen. Digitale pathologen analyseren FISH-preparaten op gedigitaliseerde whole-slide images. Kunstmatige intelligentie-algoritmen worden getraind op FISH-signaalpatronen voor HER2, ALK en BCR-ABL, wat de interobserver-variabiliteit vermindert en de doorvoer verhoogt in grote diagnostische centra.
FISH is een van de drie klassieke hybridisatietechnieken naast Southern blot (DNA) en Northern blot (RNA). Voor de detectie van RNA-expressie op celniveau is RNA-FISH de in-situ-variant; voor kwantitatieve expressie-analyse in oplossing wordt qPCR en RT-PCR gebruikt. Chromosomale kopieaantalvariaties in het gehele genoom worden tegenwoordig ook bepaald via array-CGH en whole genome sequencing. Voor eiwitlokalisatie in de cel is immunofluorescentie de equivalent van FISH. Co-immunoprecipitatie en Western blot analyseren eiwitinteracties en -expressie als aanvulling op de genetische informatie van FISH. Voor de analyse van de binding van eiwitten aan specifieke genomische loci — histonmodificaties en transcriptiefactoren — is chromatine-immunoprecipitatie (ChIP) de aanvullende epigenomische methode. Celscheiding voor aanvullende analyse van FISH-positieve cellen is mogelijk via flowcytometrie en FACS-sortering. Voor de populatiebrede analyse van chromatinecontacten en 3D-genoomarchitectuur via sequencing in plaats van microscopie, zie het artikel over proximity ligation assays (Hi-C, 3C).
Voor een FISH-procedure zijn onder meer de volgende materialen nodig: hybridisatieoven of vochtige kamer met externe verwarming (voor co-denaturatie en hybridisatie op objectglas), waterbad op 72 °C (stringent wassen), fluorescentiemicroscoop met DAPI-, FITC- en Cy3/Cy5-filtersets, objectglasjes (silaangecoat of polylysine-gecoat voor goede adhesie), dekglaasjes (No. 1 dikte voor optimale optiek), pincetten voor objectglashantering, montagemedium met DAPI (VECTASHIELD met DAPI of equivalente producten) en commercieel verkrijgbare FISH-probes (LSI, CEP, WCP). Labvakhandel levert diverse materialen die in het moleculair-biologisch laboratorium worden gebruikt, waaronder pipetpunten, centrifugebuizen en koel- en vriesapparatuur voor probeopslagbeheer.
In situ is Latijn voor "op de oorspronkelijke plaats". In-situ-hybridisatie betekent dat de hybridisatie — de binding van een probe aan de doelsequentie — plaatsvindt in het intacte biologische preparaat (cel op objectglas, weefselcoupe) in plaats van in een buis na DNA-isolatie. De celstructuur en chromosomale context blijven behouden, waardoor de exacte lokalisatie van de doelsequentie zichtbaar is.
FISH combineert twee unieke eigenschappen: het behoudt de ruimtelijke context van het DNA in de cel en maakt de doelsequentie fluorescent zichtbaar onder de microscoop. Dit maakt directe telling van chromosomale kopieaantallen per cel mogelijk, detectie van chromosomale translocaties en deleties die niet zichtbaar zijn met conventionele karyotypering, en snelle diagnostiek (24—48 uur) zonder celkweek. In de oncologie is FISH onmisbaar voor behandelkeuze bij HER2-positieve borstkanker, CML, NSCLC en lymfomen.
ISH is de verzamelnaam voor alle in-situ-hybridisatiemethoden. FISH is de variant met fluorescent gelabelde probes; CISH (chromogeen ISH) gebruikt enzymatische kleuring detecteerbaar met een gewone lichtmicroscoop; radioactieve ISH is verouderd. FISH biedt multikleurenanalyse en is gevoeliger; CISH heeft als voordeel dat geen fluorescentiemicroscoop nodig is en preparaten permanent zijn.
FISH verloopt in vijf stappen: (1) fixatie en preparaatvoorbereiding, (2) denaturatie van dubbelstrengs DNA in het preparaat, (3) hybridisatie van de fluorescent gelabelde probe aan de doelsequentie (12—16 uur, 37 °C), (4) stringent wassen om ongebonden probe te verwijderen, en (5) DAPI-tegenkleuring en analyse via fluorescentiemicroscopie waarbij signaalspots per cel worden geteld. Het volledige protocol neemt 24—48 uur in beslag.
De totale doorlooptijd van een FISH-test is 24—48 uur, afhankelijk van het monstertype en de hybridisatieduur. De hybridisatiestap zelf duurt 12—16 uur bij 37 °C; de overige stappen (fixatie, denaturatie, wassen, microscopie en rapportage) nemen gezamenlijk enkele uren in beslag. Bij spoedindicaties — zoals verdenking op ernstige chromosomale afwijking bij een patiënt op de intensive care — zijn resultaten soms al na 18—24 uur beschikbaar. Dit staat in scherp contrast met de klassieke karyotypering, die een celkweekstap van 10—14 dagen vereist.
Ja, FISH en CISH worden gebruikt voor de detectie van humaan papillomavirus (HPV) DNA in biopten van het baarmoederhalskanaal en orofaryngeale tumoren. Een probe gericht op het HPV-genoom hybridiseert aan viraal DNA dat geïntegreerd is in het gastheerchromosoom of aanwezig is als episomaal DNA in de cel. De test onderscheidt geïntegreerd HPV (geassocieerd met maligne transformatie, diffuus puntpatroon) van episomaal HPV (actieve virusreplicatie, clusters van signalen). Voor de klinische HPV-test in baarmoederhalsscreening worden echter doorgaans PCR-gebaseerde methoden gebruikt vanwege de hogere gevoeligheid en betere doorvoer.
De voornaamste beperkingen zijn: (1) FISH detecteert alleen sequenties waarvoor een specifieke probe beschikbaar is — onbekende afwijkingen worden gemist; (2) balanceerde translocaties zonder kopieaantalverandering zijn niet detecteerbaar; (3) de techniek is arbeidsintensief en vereist geoefend personeel; (4) fluorescentiesignalen vervagen bij langdurige bewaring en belichting; (5) interpretatie bij complexe karyotypen of laag percentage afwijkende cellen is moeilijk.
Immunohistochemie (IHC) bepaalt de hoeveelheid HER2-eiwit op de celmembraan via antilichaamkleuring (score 0, 1+, 2+, 3+). FISH bepaalt het aantal kopieën van het HER2-gen op chromosoom 17q12. IHC wordt als eerste stap uitgevoerd vanwege lagere kosten en eenvoudigere uitvoering; bij een equivocale IHC-score 2+ is FISH verplicht conform ASCO/CAP-richtlijnen om te bevestigen of er werkelijk HER2-genamplificatie aanwezig is. IHC-score 3+ en FISH-amplificatie zijn beide indicaties voor HER2-gerichte therapie.
Een arts vraagt FISH aan bij: (1) verdenking op chromosomale afwijkingen in de prenatale diagnostiek (amniocentese, chorionvlokkentest), (2) diagnose of subclassificatie van leukemie en lymfoom waarbij chromosomale translocaties behandelrelevant zijn, (3) equivocale HER2-IHC bij borstkanker, (4) NSCLC voor detectie van ALK, ROS1 of MET-afwijkingen als indicatie voor targeted therapie, (5) verdenking op microdeleties (DiGeorge, Prader-Willi), en (6) monitoring van cytogenetische respons bij CML-patiënten in behandeling met tyrosinekinaseremmers.
RNA-FISH is een variant van FISH waarbij de probes niet aan chromosomaal DNA maar aan mRNA-moleculen in het cytoplasma of de kern binden. Hiermee wordt genexpressie direct in de intacte cel zichtbaar gemaakt, zonder dat RNA eerst moet worden geëxtraheerd of omgezet. RNA-FISH wordt ingezet voor het bepalen of een gen actief is in een specifiek celtype of weefselcompartiment, voor het lokaliseren van transcripten in de cel (kernretentie versus cytoplasmisch transport) en voor het kwantificeren van expressie op individueel celniveau. smFISH (single-molecule FISH), waarbij tientallen overlappende probes per transcriptmolecuul worden gebruikt, maakt absolute tellingen van mRNA-moleculen per cel mogelijk. Deze technieken zijn fundamenteel voor de studie van transcriptionele heterogeniteit tussen individuele cellen en vormen de moleculaire basis van spatial transcriptomics.
Om DNA fluorescerend te maken worden fluoroforen chemisch gekoppeld aan de nucleotiden van de probe. Dat kan op twee manieren. Bij directe labeling worden fluorescent gemodificeerde nucleotiden (zoals FITC-dUTP, Cy3-dUTP of Cy5-dUTP) tijdens de probesynthese enzymatisch ingebouwd via nick-translatie of willekeurige primerverlenging. Het fluorofoor zit dan direct aan het DNA en is na hybridisatie onmiddellijk zichtbaar onder de microscoop. Bij indirecte labeling wordt eerst een hapteen — een kleine chemische groep zoals biotine of digoxigenine — in de probe ingebouwd. Na hybridisatie wordt het hapteen in een tweede stap gedetecteerd via een fluorescent geconjugeerd antilichaam (anti-biotine of anti-digoxigenine). Indirecte labeling maakt signaalaversterking mogelijk maar verlengt het protocol. De keuze van fluorofoor bepaalt de kleur van het signaal en de vereiste filterset op de microscoop: FITC geeft groen licht (excitatie ~490 nm, emissie ~520 nm), Cy3 geeft rood-oranje licht (~550/570 nm) en Cy5 infrarood-rood (~650/670 nm).
Bij FISH worden twee categorieën fluorescerende kleurstoffen ingezet: probekleurstoffen voor de signaalspots en DAPI als tegenkleuring voor de celkern. De meest gebruikte probekleurstoffen zijn FITC (fluoresceïne-isothiocyanaat, groen), Cy3 (cyanine 3, rood-oranje), Cy5 (cyanine 5, ver-rood) en in geavanceerde multiplex-toepassingen ook Texas Red, Spectrum Orange en Spectrum Green. Elk fluorofoor heeft een karakteristiek excitatie- en emissiemaximum, wat bepaalt welke filterblokken op de microscoop nodig zijn. Bij multiplex-FISH worden vijf fluoroforen gecombineerd om alle 24 menselijke chromosomen tegelijk elk in een unieke kleur te kleuren. Een praktisch nadeel van organische fluoroforen is fotobleking: bij langdurige belichting verliest het fluorofoor zijn fluorescentieverogen doordat het molecuul onomkeerbaar beschadigt. Anti-fade-media (DABCO, ProLong Gold) vertragen dit proces door zuurstof — de voornaamste oorzaak van fotochemische afbraak — uit het preparaat te weren.
In-situ-hybridisatie werd in 1969 onafhankelijk van elkaar beschreven door twee groepen: Joseph Gall en Mary Lou Pardue (ribosomale DNA-lokalisatie in Xenopus-oöcyten) en Harold John Evans en collega's. Deze vroege experimenten gebruikten radioactief gelabelde probes. De overstap naar fluorescente labeling werd in de jaren tachtig van de twintigste eeuw mogelijk gemaakt door de ontwikkeling van fluorescent gemodificeerde nucleotiden en antilichaamdetectiesystemen. David Ward, Barbara Trask en collega's bij het Human Genome Project droegen in de late jaren tachtig en vroege jaren negentig sterk bij aan de verfijning van FISH als diagnostische en cartografische techniek. De introductie van commerciële probesets (Vysis, Abbott Molecular) in de jaren negentig maakte FISH toegankelijk voor routinediagnostiek in klinische laboratoria wereldwijd.
Bekijk het assortiment laboratoriumapparatuur en verbruiksmaterialen van Labvakhandel, of neem contact op voor advies bij de keuze van de juiste materialen voor uw toepassing.
Disclaimer: de informatie op deze pagina is bedoeld voor educatieve doeleinden en is niet bedoeld als medisch of diagnostisch advies. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke klinische of analytische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
