Een helderveldmicroscoop is de klassieke lichtmicroscoop (brightfield-microscoop): het licht gaat van onderen door het preparaat en u ziet donkere of gekleurde structuren tegen een lichte achtergrond. Het is de microscoop op school, in het klinisch laboratorium en in de microbiologie, en het statief waarop donkerveld, fasecontrast en fluorescentie als uitbreiding worden gebouwd. Het artikel Microscoop: types, onderdelen en gebruik behandelt de microscoop als geheel. Dit artikel richt zich op de techniek zelf: hoe het contrast ontstaat, welke preparaten u ermee bekijkt en hoe u die voorbereidt, hoe u het beeld optimaliseert en waar de grenzen liggen.
Een helderveldmicroscoop is een lichtmicroscoop met doorvallend licht en een gewone condensor, zonder extra contrastvoorzieningen. In de dagelijkse praktijk is dit wat men een gewone of samengestelde microscoop noemt. Het gezichtsveld is helder verlicht, en het preparaat verschijnt als schaduw of als kleur op die lichte achtergrond.
De techniek is eenvoudig, robuust en goedkoop in onderhoud. Dat verklaart waarom de meeste studie- en routinemicroscopen in de basis als helderveldmicroscoop zijn uitgevoerd. Het nadeel is dat transparante, ongekleurde preparaten nauwelijks contrast geven.
Het beeld ontstaat door absorptie van licht:
De verlichting wordt bij voorkeur ingesteld volgens Köhler. Hoe dat werkt, staat stap voor stap in Microscoop: types, onderdelen en gebruik.
Het contrast komt uit absorptie. Een kleurstof die zich aan celonderdelen bindt, een pigment zoals chlorofyl, of een dicht en dik weefseldeel houdt licht tegen. Een doorzichtige cel in water doet dat nauwelijks. Daarom worden de meeste preparaten voor helderveld gefixeerd en gekleurd; zie Microscopische preparaten: voorbereiding en kleuringen.
De vergroting en de resolutie worden bepaald door het objectief, het oculair en de numerieke apertuur (NA). De tabel geeft de gangbare combinaties met een 10× oculair.
De waarden zijn indicatief; de NA staat op het objectief gegraveerd en verschilt per uitvoering. Voor het 100× objectief is immersieolie nodig, omdat de lichtstralen anders buiten het objectief worden gebroken.
De lens waar u doorheen kijkt, bovenaan de tubus, is het oculair (ook wel oogglas). Meestal vergroot het oculair 10×. Het oculair vergroot het beeld dat het objectief vormt, maar voegt geen detail toe.
De totale vergroting is de vergroting van het oculair vermenigvuldigd met die van het objectief. Met een 10× oculair en objectieven van 4×, 10×, 40× en 100× komt u op 40×, 100×, 400× en 1000×. Een revolver met vier objectieven is de gangbare opzet voor een helderveldmicroscoop.
De bruikbare vergroting wordt begrensd door de resolutie, ruwweg 200 tot 300 nanometer voor een lichtmicroscoop. Als vuistregel ligt de nuttige vergroting tussen 500 en 1000 keer de NA van het objectief; bij een NA van 1,25 tot 1,4 is dat ruwweg 600 tot 1400×. Daarboven wordt het beeld groter maar niet scherper, en spreekt men van lege vergroting.
Let op de NA, de correctieklasse en de dekglasdikte. Een achromaat corrigeert kleur- en beeldfouten voor twee kleuren; een plan-achromaat geeft daarnaast een vlak beeldveld; een plan-apochromaat corrigeert nog verder en wordt gebruikt voor veeleisend werk en fotografie. Op het objectief staat bijvoorbeeld 40/0,65 en 0,17: vergroting, NA en de dekglasdikte in millimeters waarvoor het is berekend. Gebruik dus een dekglaasje van de juiste dikte.
Een goede instelling levert meer beeldkwaliteit op dan een duurder objectief.
Een te ver geopend diafragma geeft een vlak, overbelicht beeld met weinig contrast. Een te ver gesloten diafragma geeft meer contrast, maar ook diffractiestructuren, randen rondom objecten en verlies van resolutie. Stel het diafragma dus in als compromis en gebruik het niet om de helderheid te regelen.
Pak de microscoop met één hand vast aan de arm (het statief) en ondersteun hem met de andere hand onder de voet. Houd hem rechtop, zodat het oculair niet uit de tubus valt. Pak de microscoop niet vast bij de tubus, de preparaattafel of de objectieven.
Helderveld werkt het best voor dunne, gekleurde preparaten en voor structuren met een eigen kleur. De tabel geeft gangbare voorbeelden.
Meer over fixeren en kleuren leest u in Microscopische preparaten: voorbereiding en kleuringen en, voor bacteriën, in Gram-kleuring: protocol, troubleshooting en kwaliteitscontrole.
Dat hangt af van het preparaat en de vergroting. Met een 40× objectief ziet u cellen en celkernen, met een 100× olie-immersieobjectief ook bacteriën en de details van bloedcellen. Ongekleurde, doorzichtige preparaten tonen in helderveld weinig; gekleurde preparaten en preparaten met eigen pigment tonen veel.
Een lichtmicroscoop toont cellen, celkernen, chloroplasten, bacteriën, schimmels, protozoën, weefselopbouw en kleine organismen. Structuren kleiner dan ongeveer 200 nanometer zijn niet afzonderlijk te onderscheiden. Virussen, DNA-moleculen en atomen zijn dus niet te zien.
Wat u onder de microscoop bekijkt, moet dun en doorschijnend zijn: een uienvlies, waterpest, pollen, wangslijmvlies, een bloeduitstrijkje, gist, vezels of kristallen. Vijverwater is geschikt, maar levende organismen zijn in helderveld lastig te volgen. Dikke of ondoorzichtige voorwerpen, zoals munten of insecten, bekijkt u beter met een stereomicroscoop met opvallend licht.
Men maakt een bloeduitstrijkje: een druppel bloed wordt in een dunne laag over een objectglas uitgestreken, gedroogd, gefixeerd en gekleurd, meestal met een Romanowsky-kleuring zoals May-Grünwald-Giemsa. Onder het 100× objectief met immersieolie zijn rode bloedcellen, witte bloedcellen en bloedplaatjes te onderscheiden. Een telkamer wordt gebruikt om cellen te tellen; zie Hemocytometer (telkamer).
Dat verschilt per aandoening. Bij sommige vormen van leukemie zijn witte bloedcellen of onrijpe voorlopercellen verhoogd, bij andere vormen is het aantal juist normaal of laag. Een microscoop toont de cellen, maar de beoordeling en een diagnose zijn voorbehouden aan een arts of klinisch analist. Raadpleeg bij klachten uw huisarts.
Gistcellen zijn ronde tot ovale cellen van ongeveer 5 tot 10 micrometer, groter dan bacteriën, en vertonen vaak knopvorming: een kleinere dochtercel hangt aan de moedercel. Methyleenblauw wordt als klassieke indicatie gebruikt voor de levensvatbaarheid: dode cellen kleuren blauw, levende cellen blijven kleurloos. Meer over het kweken en tellen van eencelligen leest u in Eencelligen kweken in het laboratorium.
As bestaat uit de anorganische resten van verbranding, bij menselijke as vooral calciumfosfaat uit botweefsel. Onder de microscoop ziet u onregelmatige, vaak hoekige korrels en fragmenten in grijs en wit, meestal ondoorzichtig. Omdat de korrels niet doorschijnend zijn, geeft opvallend licht, bijvoorbeeld met een stereomicroscoop, een beter beeld dan helderveld. De bepaling van het asgehalte in een monster staat in Asgehalte en gloeirest bepalen.
Helderveld heeft een duidelijke grens: levende, doorzichtige cellen en ongekleurde bacteriën geven nauwelijks contrast. Kleuren lost dat op, maar doodt vaak de cellen en kan artefacten geven. Voor levend, ongekleurd materiaal zijn andere contrastmethoden beter geschikt.
Donkerveldmicroscopie is een contrastmethode waarbij alleen het door het preparaat verstrooide licht het objectief bereikt. Objecten lichten helder op tegen een zwarte achtergrond. Het is geschikt voor kleine, ongekleurde deeltjes en bewegende bacteriën. Zie Donkerveldmicroscoop: werking, condensor en toepassingen.
Fasecontrast is beter voor levende cellen in kweek, omdat het faseverschillen omzet in helderheid zonder kleuring. Zie Fasecontrastmicroscoop: werking, onderdelen en gebruik. Fluorescentie is beter voor het aantonen van specifieke structuren of eiwitten met een fluorescent label; zie Fluorescentie-microscopie.
Dat is vaak mogelijk. Een eenvoudige donkerveldschijf in de condensor of een fasecontrastset met ringdiafragma’s en fasecontrastobjectieven maakt van veel helderveldmicroscopen een instrument met meer contrastmethoden. Controleer bij de fabrikant of de condensorhouder en de objectieven geschikt zijn.
Helderveld is slechts een van de technieken binnen de lichtmicroscopie. Hieronder volgen de gangbare indelingen en de grenzen van de lichtmicroscoop.
De drie hoofdgroepen zijn lichtmicroscopen, elektronenmicroscopen en scanning-probemicroscopen. Binnen de lichtmicroscopen zijn helderveld, donkerveld, fasecontrast en fluorescentie de gangbare technieken. Zie Microscoop: types, onderdelen en gebruik.
Een lichtmicroscoop gebruikt zichtbaar licht en glazen lenzen, met een resolutie van ruwweg 200 nanometer. Een elektronenmicroscoop gebruikt een elektronenbundel en elektromagnetische lenzen in vacuüm, en bereikt een resolutie tot ver onder de nanometer. Het beeld is monochroom, en de preparaatvoorbereiding is veel ingrijpender. Zie Elektronenmicroscopie (SEM en TEM).
De grootste vergroting en resolutie bieden elektronenmicroscopen, tot op de schaal van atomen, en scanning-probemicroscopen zoals atomaire krachtsmicroscopie (AFM). Bij lichtmicroscopen verlegt super-resolutiemicroscopie de grens onder de diffractielimiet. Voor het eigen vakgebied bepaalt de vraag, niet de sterkte, welke microscoop het best past.
De helderveldmicroscoop is de oudste vorm van de lichtmicroscoop. De eerste instrumenten waren al helderveld.
De samengestelde microscoop wordt vaak toegeschreven aan de Middelburgse brillenmaker Zacharias Janssen, rond 1590, al is die toeschrijving onder historici omstreden. Robert Hooke publiceerde in 1665 zijn Micrographia, met tekeningen van wat hij met een samengestelde microscoop zag. Antonie van Leeuwenhoek uit Delft beschreef met zelfgeslepen lenzen als eerste systematisch levende micro-organismen.
Nederland speelt een grote rol in de geschiedenis van de microscoop, via Janssen en Van Leeuwenhoek, en later via de fasecontrastmicroscoop van Frits Zernike. Of de microscoop strikt een Nederlandse uitvinding is, is onder historici een punt van discussie.
Meestal wordt Zacharias Janssen uit Middelburg genoemd, naast zijn vader Hans. Van Leeuwenhoek is geen uitvinder van de samengestelde microscoop, maar wel de bekendste gebruiker van de enkelvoudige microscoop met een zeer sterke lens. Hij zag als eerste bacteriën en protozoën.
De eerste samengestelde microscopen bestonden uit een buis met een lens aan elk uiteinde, met een beperkte vergroting en een matige beeldkwaliteit. Van Leeuwenhoek gebruikte juist een enkele kleine lens, in een metalen plaatje gevat en vlak voor het oog gehouden. Met zelfgeslepen lenzen haalde hij naar verluidt ruwweg 200 tot 300 keer vergroting.
Kijk naar de volgende punten:
De Welke microscoop kiezen? Keuzewijzer voor laboratoria helpt u bij de keuze van het basisinstrument.
Dat hangt af van uw preparaat en vraagstelling. Voor gekleurde preparaten, bloeduitstrijkjes en coupes is een helderveldmicroscoop de standaard. Voor levende, ongekleurde cellen kiest u fasecontrast, voor kleine deeltjes donkerveld, en voor vaste voorwerpen een stereomicroscoop. Zie de keuzewijzer.
Voor helderveldmicroscopie vindt u bij Labvakhandel lichtmicroscopen en microscoopcamera’s in de webgroep optisch onderzoek, telkamers en objectglasdispensers in glaswerk voor microbiologie, immersieolie en kleurstoffen bij kleurstoffen en reagentia voor microscopie en een microscoopreinigingsset in reiniging. Neem contact op voor advies over een geschikte microscoop.
Onderdeel van: Klinisch laboratorium · Milieulaboratorium
Geschreven door Labvakhandel, specialist in laboratoriumbenodigdheden voor bedrijven en instellingen.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
