Kweekmedia — ook wel voedingsbodems of cultuurmedia genoemd — zijn de voedingsoplossingen of gestolde substraten waarop micro-organismen worden gekweekt. Ze leveren alle stoffen die een micro-organisme nodig heeft: een koolstofbron, een stikstofbron, minerale zouten en, afhankelijk van het organisme, groeifactoren of specifieke sporenstoffen. De keuze van het juiste medium bepaalt in hoge mate of een kweek slaagt, welke organismen groeien en of selectie op specifieke eigenschappen mogelijk is. Dit artikel beschrijft de grondstoffen, typen, bereidingsmethoden en kwaliteitsaspecten van microbiologische kweekmedia.
Elk microbiologisch kweekmedium bevat vier typen componenten, ongeacht of het om een vloeibaar of vast medium gaat:
1. Koolstofbron — Micro-organismen hebben koolstof nodig voor de opbouw van biomassa en als energiebron. In complexe media levert trypton, pepton of gistextract organische koolstofverbindingen. In synthetische (gedefinieerde) media wordt glucose, sucrose of een ander zuivere suiker als koolstofbron gebruikt. Autotrofe organismen zoals algen en sommige bacteriën benutten CO₂ als koolstofbron en behoeven geen organische koolstofbron in het medium.
2. Stikstofbron — Stikstof is onmisbaar voor de synthese van aminozuren, eiwitten en nucleïnezuren. Complexe media bevatten stikstof in de vorm van pepton (partieel gehydrolyseerd eiwit) of gistextract. Gedefinieerde media gebruiken ammoniumzouten (NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄) of nitraat als stikstofbron. Stikstoffixerende bacteriën zoals Rhizobium en Azotobacter zijn in staat elementaire stikstof (N₂) uit de lucht om te zetten en kunnen op stikstofvrije media worden geselecteerd.
3. Minerale zouten — Macro-elementen zoals fosfaat (HPO₄²⁻), sulfaat (SO₄²⁻), magnesium (Mg²⁺) en kalium (K⁺) zijn structurele onderdelen van celmembranen, enzymen en energiedragers (ATP). Sporenelementen zoals ijzer, mangaan, zink en koper zijn als cofactor onmisbaar voor enzymatische reacties, maar worden slechts in micromolaire concentraties benodigd.
4. Water — Water is het oplosmiddel voor alle overige componenten en het medium voor biochemische reacties in de cel. Voor microbiologische media wordt uitsluitend gedemineraliseerd of gedestilleerd water van Type II-kwaliteit of hoger aanbevolen, om contaminatie met ionen en micro-organismen te vermijden. Leidingwater bevat te veel ionen en organische verbindingen die de groei kunnen beïnvloeden of interferentie geven bij selectieve media. Meer informatie over de juiste waterkwaliteit voor laboratoriumtoepassingen staat in het kennisbankartikel over waterkwaliteit in het laboratorium.
Pepton en gistextract zijn beide complexe stikstofbronnen in microbiologische media, maar ze verschillen in oorsprong en samenstelling. Pepton is een mengsel van peptiden en vrije aminozuren dat ontstaat door enzymatische of zuurhydrolyse van eiwitrijke grondstoffen, zoals caseïne (trypton), soja-eiwit of vlees. Het levert voornamelijk aminozuren en korte peptiden als stikstof- en koolstofbron. Gistextract is een waterig extract van autolyseerde gistcellen (Saccharomyces cerevisiae) en bevat naast aminozuren ook vitaminen van de B-groep (thiamine, riboflavine, niacine, foliumzuur), nucleotiden en sporenelementen. Gistextract maakt media daarmee geschikt voor organismen die groeifactoren nodig hebben die pepton alleen niet levert. In LB-medium (Lysogeny Broth) is de combinatie van trypton (10 g/l) en gistextract (5 g/l) standaard: trypton levert de aminozuren, gistextract de vitaminen en nucleotidevoorlopers.
De fysieke aggregatietoestand van het medium bepaalt welke kweektechnieken mogelijk zijn en welke informatie een kweek oplevert.
Vloeibaar medium (bouillon) — Een vloeibaar medium bevat geen stollingsmiddel. Het wordt gebruikt voor schudculturen in erlenmeyers of buizen, voor fermentaties in een bioreactor en voor de voorvermenigvuldiging van inocula (bronmateriaal (zoals bacteriën, virussen, schimmels of celmateriaal)). Vloeibare kweken leveren snel grotere hoeveelheden biomassa op maar geven geen informatie over de morfologie van individuele kolonies. Troebeling van het medium is een indicatie voor groei; de optische dichtheid bij 600 nm (OD₆₀₀) is de standaardmethode om celconcentratie kwantitatief te volgen. Zie voor de meetmethode het kennisbankartikel celgroei meten en OD600.
Vast medium (agarplaat of schuinagar) — Door toevoeging van agar als stollingsmiddel wordt het medium vast. Op het vaste oppervlak kan plaatuitzaai worden uitgevoerd: elke cel groeit uit tot een zichtbare, telbare kolonie. Dit is de basis voor koloniemorfologie-beoordeling, bacterietelling (CFU/ml), isolatie van zuivere stammen en kwaliteitscontrole in de voedselindustrie en het klinische laboratorium. Schuinagar (agar in een schuin gestolde reageerbuis) wordt gebruikt voor kortetermijnopslag en transport van bacteriestammen.
Semi-vast medium — Een lage agarconcentratie (0,3–0,5%) geeft een half-gestolde consistentie waardoor micro-organismen kunnen bewegen maar niet wegspoelen. Dit wordt gebruikt voor motiliteitsbepalingen: beweeglijke bacteriën verspreiden zich vanuit het inoculatiepunt; niet-beweeglijke bacteriën groeien alleen ter plaatse.
De keuze tussen vloeibaar en vast medium hangt af van het doel van de kweek. Bouillon is de aangewezen keuze wanneer u snel een grote hoeveelheid biomassa wilt opbouwen — voor DNA-isolatie, eiwitproductie of fermentatie — en wanneer u celgroei kwantitatief wilt volgen via OD₆₀₀-meting. Agarplaten gebruikt u wanneer isolatie van zuivere stammen het doel is (uitstrektechniek), wanneer u koloniemorfologie wilt beoordelen, wanneer u het aantal kolonievormende eenheden (CFU) wilt tellen, of wanneer u selectieve en differentiaalmedia wilt toepassen waarbij zichtbare reacties op het plaatoppervlak informatie geven. In de praktijk worden vloeibaar en vast medium vaak gecombineerd: een kleine hoeveelheid bouillonkweek wordt uitgeplaat om de reinheid van de cultuur te controleren, waarna de vloeibare kweek wordt opgeschaald voor biomassaproductie. De praktische uitvoering van plaatuitzaai — van seriële verdunning en uitplaatmethodetot kolonietelling en berekening conform ISO 4833 — wordt behandeld in het kennisbankartikel kiemplaaten kolonietelling — voedsel- en pharmalab, praktisch.
In de microbiologie worden media ingedeeld naar samenstelling en selectieve eigenschappen:
Algemeen voedingsmedium (niet-selectief) — Ondersteunt de groei van een brede range van organismen zonder selectiedruk. Voorbeelden zijn Nutrient Agar, LB-agar (Lysogeny Broth, ook bekend als Luria-Bertani), Tryptic Soy Agar (TSA) en Mueller-Hinton Agar. LB is het standaardmedium voor laboratoriumstammen van Escherichia coli; Mueller-Hinton is het referentiemedium voor antibioticagevoeligheidsbepalingen (MIC-testen) conform EUCAST-richtlijnen.
Selectief medium — Bevat inhibitoren (antibiotica, kleurstoffen, galzouten, hoge zoutconcentraties) die de groei van ongewenste organismen onderdrukken terwijl de doelorganismen groeien. MacConkey Agar selecteert op Gram-negatieve bacteriën via galzouten en kristalviolet die Gram-positieven remmen. Mannitol Salt Agar (MSA) met 7,5% NaCl selecteert op zouttolerante stafylokokken. Sabouraud Dextrose Agar met een lage pH en cycloheximide wordt gebruikt voor schimmels en gisten.
Differentiaalmedium — Maakt onderscheid tussen organismen op basis van een zichtbare reactie in of op het medium, zonder de groei van bepaalde organismen te onderdrukken. MacConkey Agar is zowel selectief als differentiaal: lactosefermenterende bacteriën (zoals E. coli) produceren zuur dat de pH-indicator (neutraalrood) van kleur doet veranderen, waardoor kolonies rood kleuren; niet-fermenterende soorten blijven kleurloos. Bloedagar toont hemolysepatronen: alfa-hemolyse (groene verkleuring), bèta-hemolyse (heldere zone) en gamma-hemolyse (geen reactie).
Verrijkingsmedium — Bevat extra groeifactoren of nutriënten voor organismen met bijzondere voedingsbehoeften (fastidious organisms). Chocolade-agar (verhit bloedagar, waarbij rode bloedcellen worden gelyseerd en groeifactoren vrijkomen) is vereist voor Haemophilus influenzae en Neisseria gonorrhoeae. Bloedagar en serum-verrijkte media worden gebruikt voor de kweek van klinische isolaten.
Gedefinieerd (synthetisch) medium — Elke component is kwantitatief bekend en in chemisch zuivere vorm aanwezig. Voordelen zijn volledige reproduceerbaarheid en de mogelijkheid om de concentratie van één variabele (bijv. koolstofbron of één sporenelement) systematisch te variëren. Gedefinieerde media zijn onmisbaar voor metabole studies, groeikinetiek-experimenten en de productie van geneesmiddelen waarbij de exacte samenstelling voor regulatoire doeleinden (GMP) gedocumenteerd moet zijn.
Complex medium — Bevat componenten met een variabele, niet volledig gekarakteriseerde samenstelling, zoals pepton, gistextract of vleesbouillon. Complex media zijn goedkoper, eenvoudiger te bereiden en groeien de meeste organismen goed, maar zijn minder reproduceerbaar dan gedefinieerde media.
Een selectief medium onderdrukt de groei van bepaalde organismen actief, zodat alleen de doelorganismen kolonies kunnen vormen. Een differentiaalmedium laat alle organismen groeien, maar maakt ze van elkaar te onderscheiden op basis van een zichtbare reactie — zoals kleurverandering, hemolyse of neerslag. In de praktijk zijn veel media selectief én differentiaal tegelijk: MacConkey Agar onderdrukt Gram-positieve bacteriën (selectief) en kleurt lactosefermenteerders rood terwijl niet-fermenteerders kleurloos blijven (differentiaal). Het onderscheid is functioneel relevant: met een selectief medium isoleert u uw doelorganisme uit een mengcultuur; met een differentiaalmedium identificeert u het. Voor de selectie van E. coli-transformanten met een antibioticumresistentiegen wordt LB-agar aangevuld met het betreffende antibioticum gebruikt — dit is selectief maar niet differentiaal. Voor identificatie van E. coli in een mengmonster is MacConkey Agar zowel selectief als differentiaal de betere keuze.
Voor routinekweek van laboratoriamstammen van E. coli is LB-agar (vast) of LB-bouillon (vloeibaar) de standaardkeuze: het medium is niet-selectief, ondersteunt snelle groei (generatietijd circa 20 minuten bij 37 °C) en is breed beschikbaar. Voor selectie van getransformeerde klonen wordt ampicilline (100 µg/ml), kanamycine (50 µg/ml) of een ander antibioticum toegevoegd dat correspondeert met het resistentiegen op het plasmide. Voor detectie en identificatie van E. coli in omgevings- of voedselmonsters is MacConkey Agar of Eosin Methylene Blue (EMB) Agar de gebruikelijke keuze: beide zijn selectief voor Gram-negatieven en differentiaal voor lactosefermentatie. Op EMB-agar produceren sterke lactosefermenteerders zoals E. coli een karakteristieke groene metaalglans.
Agar is een polysaccharide dat wordt gewonnen uit roodwieren (voornamelijk Gelidium- en Gracilaria-soorten). Het bestaat uit agarose (de gelerende fractie) en agaropectine. Agar lost op bij verhitting boven 85 °C en stolt bij afkoeling onder circa 45 °C, wat het gieten van warme agar in petrischalen mogelijk maakt zonder dat de agar al stolt. Eenmaal gestold, smelt het medium pas opnieuw boven 85 °C, zodat incubatie bij 37 °C geen probleem vormt.
Agar heeft twee cruciale eigenschappen die het tot de gouden standaard voor microbiologie hebben gemaakt: de overgrote meerderheid van micro-organismen kan agar niet als voedingsbron gebruiken (het wordt niet afgebroken), en het is transparant na stollen, wat koloniewaarneming en reactiezones (hemolysezones, precipitatielijnen) goed zichtbaar maakt. De gebruikelijke concentratie is 1,5% (15 g/l) voor standaard vaste media; 0,7–1,0% voor zachter agar bij bepaalde toepassingen.
Gelatine werd historisch als stollingsmiddel gebruikt vóór de introductie van agar door Angelina Fanny Hesse (1882, in het laboratorium van Robert Koch), maar heeft een smeltpunt van circa 28 °C, waardoor het bij incubatietemperaturen vloeibaar wordt. Bovendien kunnen gelatinase-producerende bacteriën gelatine afbreken. Agar vervangt gelatine in vrijwel alle microbiologische toepassingen.
Agarplaten worden gegoten wanneer het geautoclaveerde medium is afgekoeld tot 47–50 °C. Bij deze temperatuur is de agar nog vloeibaar genoeg om goed te stromen maar niet meer heet genoeg om condensatie in de petrischaal te veroorzaken. Boven 55 °C neemt de vorming van waterdamp in de gesloten schaal toe, wat condensdruppels op het agaroppervlak geeft; beneden 44 °C begint de agar te stollen in de fles of tijdens het gieten, wat een ongelijkmatig oppervlak oplevert. Luchtbellen ontstaan doordat agar bij kloppen of snel gieten schuimt. Vermijd dit door de fles rustig te laten zakken langs de schaalwand en de agar langzaam in te gieten zonder te zwenken of te schudden. Ontstaan er toch bellen, dan worden deze direct na het gieten doorgeprikt met een gloeiende ent-naald of uitgedreven door de bovenkant van de schaal kort langs een vlam te houden — de warmte breekt de belfilms op. Giet op een vlakke, trillingsvrije ondergrond zodat de agar egaal uitloopt en afkoelt.
De bereiding van microbiologische kweekmedia verloopt in vijf stappen die in strikte volgorde worden uitgevoerd:
Stap 1 — Afwegen en oplossen — De droge componenten worden nauwkeurig afgewogen op een analytische of semi-analytische balans en opgelost in een iets kleinere hoeveelheid gedemineraliseerd water dan het eindvolume. Pepton en gistextract lossen goed op bij kamertemperatuur; agar heeft verhitting nodig. Voor complexe media wordt vaak gebruik gemaakt van kant-en-klaar dehydrated culture media (droogpoeder) van leveranciers als Oxoid, BD Difco of Merck, waarbij de fabricageinstructie (g/l) op de verpakking leidend is. Het medium wordt aangevuld tot het exacte eindvolume en de pH wordt gecontroleerd.
Stap 2 — pH-instelling — De meeste bacteriologische media hebben een optimale pH tussen 6,8 en 7,4. De pH wordt gemeten met een gekalibreerde pH-meter en indien nodig bijgesteld met 1 M NaOH (voor verhoging) of 1 M HCl (voor verlaging). De pH-instelling vindt altijd vóór sterilisatie plaats, omdat autoclaveren de pH enigszins kan beïnvloeden. Meer over pH-meting en -meters staat in het artikel over pH-meting in het laboratorium.
pH-instelling vóór sterilisatie is om twee redenen de correcte volgorde. Ten eerste verandert autoclaveren de pH van het medium licht — doorgaans een daling van 0,1–0,3 eenheden, veroorzaakt door de vorming van vluchtige zuren en de hydrolyse van fosfaatesters bij hoge temperatuur. Als u de pH instelt ná autoclaveren, werkt u niet-steriel: elke pipet of elk hulpmiddel dat u gebruikt om NaOH of HCl toe te voegen, introduceert het risico op contaminatie. Ten tweede maakt een vooraf ingestelde pH het mogelijk om de uiteindelijke pH na autoclaveren voorspelbaar te sturen door een kleine correctiefactor in te rekenen. In de praktijk noteert u bij het ontwikkelen van een nieuw bereidingsprotocol de pH vóór en na autoclaveren, en past u de instelling voor volgende batches dienovereenkomstig aan.
Stap 3 — Verdelen in flacons of kolven — Het medium wordt verdeeld over glazen of autoclaveerbare plastic flacons of erlenmeyers. Glazen Schottflacons met schroefdop zijn de standaard voor distributie van gesmolten agar; erlenmeyers worden gebruikt voor vloeibare bouillon in grotere volumes. De containers worden afgedekt maar niet luchtdicht afgesloten (stoom moet vrij kunnen circuleren tijdens autoclaveren) en voorzien van autoclaaftape.
Stap 4 — Sterilisatie door autoclaveren — Alle microbiologische media worden gesteriliseerd door vochtig-hittesterilisatie in een autoclaaf bij 121 °C gedurende 15–20 minuten (vloeistofprogramma). Dit garandeert een steriliteitsniveau (SAL) van 10⁻⁶, wat betekent dat de kans op een levensvatbaar micro-organisme kleiner is dan één op een miljoen. Het vloeistofprogramma koelt trager af dan het standaardprogramma om overkoken te voorkomen. Meer over het gebruik van de autoclaaf staat in het kennisbankartikel over autoclaven.
Hittegevoelige componenten — antibiotica, serumfracties, sommige suikers — worden apart sterielgefiltreerd door een 0,22 µm membraanfilter en pas na afkoeling van het geautoclaveerde medium (tot ca. 50 °C) toegevoegd. Dit voorkomt denaturatie of afbraak van thermolabiele stoffen.
In sommige situaties — vooral bij kleine volumes (tot circa 200 ml) of in onderwijslaboratoria zonder directe toegang tot een autoclaaf — wordt een magnetron gebruikt om agar op te lossen. De magnetron is in dat geval geen sterilisatiemethode maar uitsluitend een verhittingsmethode: het medium moet daarna alsnog worden gesteriliseerd, of de magnetron wordt ingezet om vooraf gesteriliseerde, gestolde agar opnieuw te smelten voor hergebruik. Verhit in korte intervallen van 20–30 seconden en zwenk de fles tussendoor voorzichtig (met hittebestendige handschoenen) om oververhitting te voorkomen. Plaats de dop los op de fles — nooit volledig dichtgedraaid — omdat overdruk anders tot springen of overkoken kan leiden. Voor microbiologische werken die echte steriliteit vereisen, blijft autoclaveren de standaardmethode.
Stap 5 — Gieten van agarplaten — Het geautoclaveerde agarmedium wordt afgekoeld tot circa 47–50 °C (voelbaar warm maar niet meer brandend heet; bij lagere temperatuur begint agar te stollen in de fles) en aseptisch in steriele petrischalen gegoten. Elk 90 mm petrischaaltje ontvangt 15–20 ml agar. De platen worden open gelaten tot de agar volledig gestold is, vervolgens omgekeerd bewaard (deksel naar beneden, zodat condenswater niet op de agarplaat druppelt) en bij 4 °C in de koelkast opgeslagen. Goed bereide platen zijn transparant, zonder luchtbellen en zonder condenswater op het agaroppervlak.
Een kwalitatief goede agarplaat voldoet aan vijf criteria die visueel te beoordelen zijn vóór gebruik. Het agaroppervlak is vlak en egaal, zonder kratertjes, scheuren of een golfpatroon dat duidt op te snel koelen of een niet-horizontale giettafel. De agar is volledig transparant of heeft een lichtgele tint, afhankelijk van de mediasamenstelling; troebeling kan op contaminatie of onvoldoende oplossing wijzen. Er zijn geen luchtbellen zichtbaar in de laag. De onderkant van de schaal toont geen condensdruppels op het agaroppervlak — dit is het voordeel van omgekeerd bewaren. Ten slotte heeft een correct gegoten 90 mm schaal een agarlaag van circa 3–4 mm dikte, wat overeenkomt met 15–20 ml medium; te dunne platen drogen snel uit tijdens langdurige incubatie.
Micro-organismen worden gekweekt in een steriele omgeving om contaminatie te voorkomen en werknemers te beschermen. De bereiding van media en het gieten van platen vindt bij voorkeur plaats onder een laminaire-luchtstroom-werkbank of in de directe nabijheid van een gasbrander. De vlam van de gasbrander creëert een opstijgende warme luchtstroom die contaminanten uit de directe werkomgeving wegdrijft; daarnaast wordt de vlam gebruikt voor het steriliseren van instrumenten en het vlammen van flessenmonden. Zie het kennisbankartikel over steriel versus niet-steriel voor een uitgebreide richtlijn over de keuze van steriel laboratoriummateriaal.
Bij het werken met pathogenen of genetisch gemodificeerde organismen (GGO's) gelden aanvullende veiligheidsklassificaties (BSL-1 t/m BSL-4 respectievelijk ML-1 t/m ML-4 in de Nederlandse regelgeving). De inrichting van de werkruimte, het gebruik van biologische veiligheidskabinetten en de afvoer van biologisch afval zijn vastgelegd in de Wet milieubeheer en de bijbehorende vergunning. Gebruikt biologisch materiaal — platen, buizen, pipetten — wordt vóór afvoer geautoclaveerd of op andere wijze geïnactiveerd.
LB-agar en LB-bouillon hebben een identieke basissamenstelling — trypton (10 g/l), gistextract (5 g/l) en NaCl (10 g/l) — maar LB-agar bevat daarnaast 15 g/l agar als stollingsmiddel. LB-bouillon wordt gebruikt voor vloeibare schudkweken waarbij u snel biomassa wilt opbouwen of waarbij u OD₆₀₀-metingen wilt uitvoeren. LB-agar wordt gebruikt voor plaatuitzaai, kolonie-isolatie en het bewaren van stammen op plaat. Wanneer LB-agar wordt aangevuld met een antibioticum — bijvoorbeeld ampicilline (100 µg/ml) of kanamycine (50 µg/ml) — dient het medium voor selectie van getransformeerde bacteriën die het corresponderende resistentiegen dragen. Het antibioticum wordt altijd pas na afkoeling van het geautoclaveerde medium toegevoegd (bij circa 50 °C), zodat het niet wordt afgebroken door de hitte.
Schimmels en gisten hebben andere eisen aan het kweekmedium dan bacteriën. De optimale pH voor de meeste schimmels ligt tussen 5,0 en 6,0; gisten groeien goed tussen pH 4,0 en 6,5. Sabouraud Dextrose Agar (SDA) heeft een pH van 5,6 en bevat 40 g/l dextrose (glucose) als koolstofbron — een hogere concentratie dan bacteriologische media, waardoor schimmels een osmotisch voordeel hebben. De lage pH onderdrukt de meeste bacteriën.
Voor de selectieve isolatie van gisten uit voedsel of omgeving wordt chloramfenicol of gentamicine aan Sabouraud-agar toegevoegd als antibacteriële remmer. Potato Dextrose Agar (PDA) bevat aardappelextract als complexe koolstofbron en wordt gebruikt voor de sporenproductie van schimmels. Malt Extract Agar ondersteunt de groei van zowel schimmels als gisten en wordt veel gebruikt in de voedingsmiddelenindustrie voor kwaliteitscontrole.
Dermatofyten (schimmels die huid, nagels en haar aantasten) worden gekweekt op Dermatophyte Test Medium (DTM) met cycloheximide, dat de groei van niet-dermatofyte schimmels onderdrukt en een pH-indicator bevat die van geel naar rood verkleurt bij alkalinisering door dermatofyten.
Beide media zijn ontworpen voor de kweek van schimmels en gisten, maar ze verschillen in samenstelling en toepassingsprofiel. Sabouraud Dextrose Agar (SDA) bevat pepton als stikstofbron en een hoge glucoseconcentratie (40 g/l) bij een lage pH (5,6), waardoor het medium selectief is voor schimmels en gisten ten opzichte van bacteriën. SDA is het referentiemedium voor klinische mycologie — isolatie van Candida-soorten, dermatofyten en Aspergillus. Potato Dextrose Agar (PDA) bevat aardappelextract als complexe koolstofbron, wat de sporulatie van schimmels bevordert: het medium stimuleert de aanmaak van conidiosporen beter dan SDA. PDA heeft een minder sterke selectieve werking op bacteriën en wordt daarom in combinatie met antibiotica gebruikt wanneer bacteriecontaminatie een risico is. Voor routinematige isolatie in een klinisch laboratorium is SDA de standaard; voor onderzoek naar sporenproductie of morfologische identificatie van schimmels is PDA de betere keuze.
Een kweekmedium moet aan vijf fundamentele groeivoorwaarden voldoen om bacteriën optimaal te laten groeien:
1. Voedingsstoffen — Koolstof, stikstof, minerale zouten en eventueel groeifactoren (vitaminen, aminozuren die het organisme niet zelf kan aanmaken). Auxotrofe mutanten missen een biosynthetische enzymactiviteit en groeien alleen als het betreffende eindproduct aan het medium wordt toegevoegd.
2. Water — Biochemische reacties vinden uitsluitend in waterige omgeving plaats. De wateractiviteit (aw) van het medium moet hoog genoeg zijn; toevoeging van hoge suiker- of zoutconcentraties verlaagt de wateractiviteit en remt de groei van de meeste organismen.
3. Geschikte temperatuur — Elke soort heeft een minimale, optimale en maximale groeitemperatuur. Mesofiele organismen (waaronder de meeste pathogenen en laboratoriumstammen) groeien optimaal bij 20–45 °C. Een nauwkeurig geregelde laboratoriumincubator is onmisbaar voor reproduceerbare kweken.
4. Juiste pH — De meeste bacteriën groeien bij pH 6,5–7,5; neutrofiele organismen hebben een optimum bij pH 7,0. Acidofiele organismen (zoals Lactobacillus) groeien bij lage pH; alcalofiele organismen bij pH boven 9. Buffering van het medium — met fosfaatbuffers, MOPS of HEPES — voorkomt pH-drift door zuurvormende metabolieten tijdens kweek. Voor gespecialiseerde driedimensionale kweeksystemen — zoals organoïden — worden speciaal samengestelde media met weefselspecifieke groeifactoren en matrixcomponenten gebruikt, die wezenlijk afwijken van standaard celkweekmedium.
5. Juiste atmosfeer — Aeroben hebben zuurstof nodig; obligate anaeroben worden gedood door zuurstof; facultatieve anaeroben groeien met of zonder zuurstof. Micro-aërofiele organismen (zoals Campylobacter) groeien optimaal bij een verlaagde zuurstofconcentratie (5%) en een verhoogd CO₂-gehalte (10%). Schudculturen en beluchte bioreactoren zorgen voor voldoende zuurstoftoevoer bij aeroben; voor anaeroben worden anaërobepotten met gasopwekkende sachets of anoxische kabinetten gebruikt.
De standaardmethode voor sterilisatie van microbiologische kweekmedia is autoclaveren bij 121 °C, 1 bar overdruk, gedurende 15–20 minuten. Deze condities zijn voldoende om vegetatieve cellen, schimmelsporen en de meeste bacteriesporen (met uitzondering van de meest hittebestendige sporen van bepaalde Bacillus-soorten) te doden. Het vloeistofprogramma van de autoclaaf moet worden gebruikt — niet het standaard instrumentenprogramma — om koken en overdruk in de flacons te voorkomen.
Alternatieve sterilisatiemethoden zijn sterielfiltratie (0,22 µm membraanfilter) voor hittegevoelige oplossingen, en tyndallisatie (herhaaldelijk verhitten op 100 °C gedurende drie opeenvolgende dagen) als historische methode voor media die niet kunnen worden geautoclaveerd. Tyndallisatie is niet betrouwbaar genoeg voor moderne laboratoria en wordt vervangen door sterielfiltratie of de keuze voor hittestabiele alternatieven.
Na sterilisatie worden media bewaard bij 4 °C (agarplaten maximaal 2–4 weken; vloeibare bouillon 3–6 maanden mits afgesloten). Media die een antibioticum bevatten, worden korter bewaard: de meeste bèta-lactam-antibiotica (ampicilline, penicilline) hebben een halfwaardetijd van enkele dagen tot weken bij 4 °C. Ampicillineplaten worden bij voorkeur niet langer dan twee weken opgeslagen; carbenicilline is stabieler en wordt als alternatief gebruikt bij langdurige kweekexperimenten.
De houdbaarheid van kant-en-klaar gegoten agarplaten is afhankelijk van de mediasamenstelling en de opslagomstandigheden. Standaard niet-selectieve platen — Nutrient Agar, LB-agar, TSA — zijn bij bewaring bij 4 °C in de originele verpakking of in een gesloten plastic zak doorgaans 8–12 weken houdbaar. Selectieve platen met antibiotica — ampicillineplaten, kanamycineplaten — zijn aanzienlijk korter houdbaar: maximaal 2–4 weken bij 4 °C, doordat bèta-lactam-antibiotica bij lage temperatuur geleidelijk worden gehydrolyseerd en inactief worden. Platen met kleurstoffen of pH-indicatoren — MacConkey, Sabouraud — behouden hun differentiaaleigenschappen tot circa 6–8 weken mits beschermd tegen licht. Commercieel geleverde kant-en-klare platen zijn voorzien van een houdbaarheidsdatum op de verpakking; deze datum geldt voor platen in de ongeopende, originele verpakking. Na opening dienen platen binnen 4 weken gebruikt te worden en altijd visueel gecontroleerd op tekenen van contaminatie (ongewone verkleuring, kolonies) of uitdroging voordat ze worden ingezet.
Bij het herinkweken (subkultiveren) van een mengcultuur op een vaste voedingsbodem maakt de uitstrektechniek het mogelijk individuele cellen van elkaar te scheiden en te isoleren. Elke geïsoleerde cel groeit uit tot een zichtbare kolonie die — in theorie — afkomstig is van één enkele voorloupercel (kloon). Dit maakt de isolatie van zuivere stammen mogelijk, wat de basis vormt voor identificatie, typering en verdere experimenten.
In een vloeibaar medium vermengen alle organismen zich onvermijdelijk. Een snelgroeiend organisme overheerst de kweek in korte tijd; langzaamgroeiende of kwetsbare organismen worden weggeconcurreerd. Op een vaste voedingsbodem groeit elke kolonie op zijn eigen plek, onafhankelijk van zijn buren, waardoor ook langzaam groeiende of competitief zwakkere organismen zichtbaar worden.
Nee. Agar en gelatine zijn chemisch fundamenteel verschillend. Agar is een polysaccharide (koolhydraat) van plantaardige/algenoorsprong; gelatine is een eiwit (gehydrolyseerd collageen) van dierlijke oorsprong. Agar heeft een smeltpunt van circa 85 °C en een stelpunt van circa 42 °C; gelatine smelt al bij 28 °C, wat gebruik bij bacteriologische incubatietemperaturen (37 °C) onmogelijk maakt. Bovendien kunnen proteolytische bacteriën gelatine afbreken door de productie van gelatinase, terwijl agar door de overgrote meerderheid van micro-organismen niet als koolstofbron wordt benut.
Elk zelfbereid of commercieel aangekocht kweekmedium dient te worden gecontroleerd vóór gebruik. De ISO 11133-norm beschrijft de eisen voor de kwaliteitscontrole van microbiologische voedingsbodems. De minimale kwaliteitscontroles omvatten een steriliteitstest (incubatie van niet-geïnoculeerde platen of buizen gedurende 48–72 uur bij 37 °C om contaminatie uit te sluiten), een groeibevorderingstest met referentiestammen (ATCC- of WDCM-stammen) en een functionele test voor selectieve en differentiaalmedia (groeiremming van de doelorganismen resp. correct kleurpatroon).
Bereid kweekmedium dat aan kwaliteitscontrole onderworpen is geweest, wordt gedocumenteerd met bereidingsdatum, lot-nummer van de droge componenten, sterilisatieparameters en testresultaten. In geaccrediteerde laboratoria (ISO 17025) en GMP-omgevingen is deze documentatie verplicht.
Referentiestammen zijn gecertificeerde, gestandaardiseerde bacterie- of schimmelstammen met bekende en stabiele eigenschappen, die worden gebruikt als positieve controle bij de kwaliteitscontrole van kweekmedia. De meest gebruikte collecties zijn ATCC (American Type Culture Collection) en WDCM (World Data Centre for Microorganisms). Bij de groeibevorderingstest wordt een referentiestam met bekende groeicapaciteit geïnoculeerd op het te testen medium, waarna de groei wordt beoordeeld en vergeleken met de verwachte norm. Bij selectieve media wordt aanvullend een inhibitiestam geïnoculeerd — een organisme dat op het selectieve medium juist níet mag groeien — om te bevestigen dat de selectieve werking behouden is gebleven. Referentiestammen worden bewaard als gevriesdroogde ampullen of in glycerolstocks bij -80 °C, zodat elke nieuwe werkingstam vanuit dezelfde gecertificeerde bron wordt geprepareerd en de eigenschappen niet door passagering verschuiven.
In de microbiologie worden vijf hoofdgroepen van micro-organismen onderscheiden, elk met eigen kenmerken en bijbehorende kweekmedia. Bacteriën zijn prokaryoten zonder celkern; ze worden gekweekt op voedingsbodems zoals LB-agar, Nutrient Agar of selectieve media als MacConkey Agar. Schimmels zijn eukaryotische organismen met een celwand van chitine; ze groeien op zure media zoals Sabouraud Dextrose Agar en hebben doorgaans meer tijd nodig dan bacteriën (dagen tot weken). Gisten zijn unicellulaire schimmels die worden gekweekt op YPD-medium of Sabouraud-agar. Algen zijn fotosynthetische micro-organismen die groeien op anorganische, gedefinieerde media zoals Bold's Basal Medium onder belichting. Virussen zijn geen zelfstandige levende cellen en kunnen niet op een kweekmedium worden gekweekt: ze zijn voor hun vermeerdering volledig afhankelijk van levende gastheercellen en worden vermenigvuldigd in celkweken of embryo's. Protozoa — eencellige eukaryoten zoals Paramecium en Giardia — worden soms als zesde groep genoemd; hun kweekbehoeften zijn sterk soortspecifiek en vallen buiten de standaard bacteriologische laboratoriumroutine.
"Een infectie op kweek zetten" of "kweek afnemen" is een klinisch diagnostisch begrip: een patiëntenmonster — zoals bloed, urine, wonduitstrijk, sputum of cerebrospinaalvocht — wordt op een of meer kweekmedia geplaatst om te beoordelen of er micro-organismen in groeien en zo ja, welke. Als een pathogeen groeit, is er sprake van een positieve kweek; het geïsoleerde organisme kan vervolgens worden geïdentificeerd en getest op gevoeligheid voor antibiotica (antibiogram). Bloedkweken worden afgenomen bij vermoeden van bacteriëmie of sepsis; urinekweken bij urineweginfecties; wondkweken bij geïnfecteerde wonden of postoperatieve complicaties. De keuze van het kweekmedium is afhankelijk van het monster en het vermoedelijke pathogeen: bloedagar en chocoladeagar voor klinische isolaten, MacConkey Agar voor Gram-negatieve darmbacteriën, Sabouraud Dextrose Agar voor schimmels en gisten. Mueller-Hinton Agar is het standaardmedium voor de vervolgtest: de antibioticagevoeligheidsbepaling (MIC-test) conform EUCAST-richtlijnen.
Microbiologische kweekmedia — het onderwerp van dit artikel — zijn ontworpen voor de kweek van micro-organismen: bacteriën, schimmels, gisten en algen. Ze bevatten een koolstofbron, een stikstofbron, minerale zouten en eventueel selectieve additieven, en worden gesteriliseerd door autoclaveren. Celkweekmedia zijn bestemd voor de kweek van eukaryotische cellen van dierlijke of menselijke oorsprong — zoals cellijnen of primaire cellen — en hebben een wezenlijk andere samenstelling. Ze bevatten doorgaans een basismedium (zoals DMEM of RPMI-1640) aangevuld met foetaal bovien serum (FBS) als bron van groeifactoren, een bicarbonaat-CO₂-buffersysteem voor pH-controle, L-glutamine als stikstofbron en antibiotica ter preventie van bacteriële contaminatie. Celkweekmedia worden niet geautoclaveerd maar sterielgefiltreerd en bewaard bij -20 °C (serumvoorraden) of 4 °C (complete media). De celkweektechnieken en de bijbehorende mediasamenstelling worden uitgebreid behandeld in het artikel over celkweektechnieken.
Voor de bereiding en het gebruik van kweekmedia is de volgende apparatuur en het volgende materiaal nodig: een autoclaaf voor sterilisatie (zie het kennisbankartikel over autoclaven), een analytische of semi-analytische balans, een magnetische roerder met verwarmingsplaat voor het oplossen van agar, een pH-meter voor de pH-instelling, steriele petrischalen of kweekkolven voor het gieten of distribueren van media, en een incubator voor de kweek. Schudkweken in vloeibaar medium vereisen een orbitale schudder die voldoende zuurstoftoevoer garandeert (zie het kennisbankartikel over laboratoriumrotatoren en schudders). Het kweken zelf en de groeifasen worden uitgebreid behandeld in het kennisbankartikel eencelligen kweken in het laboratorium. Alle materialen die in contact komen met het medium moeten steriel zijn; het kennisbankartikel over steriel versus niet-steriel biedt een praktische richtlijn voor de materiaalkeuze.
Labvakhandel levert een breed scala aan kweekmedia en voedingsbodems voor microbiologische toepassingen. Het assortiment omvat zowel droge poedermedia voor zelfbereiding (Nutrient Agar, LB-medium, Sabouraud, MacConkey en andere standaardmedia) als kant-en-klaar gegoten platen en voorbereide flessen met steriel medium. Voor laboratoria en onderwijsinstellingen die snel willen kunnen starten, zijn voorbereide platen vaak de praktischste keuze: ze zijn direct inzetbaar, kwaliteitsgecontroleerd en hoeven niet meer te worden geautoclaveerd of gegoten. Een voorbeeld uit het assortiment is de Nutrient Agar in 9 cm petrischaal — kant-en-klaar voor inoculatie. Voor specifieke media, andere verpakkingsvormen of grotere afnames buiten de webwinkel kunt u contact opnemen voor een offerte op maat.
Voor downstream moleculaire analyse van kweekresultaten op RNA-niveau — zoals RNA-isolatie uit bacteriën of kweekcellijnen en detectie via RT-qPCR — zie het artikel over RNA-isolatie en RNA-analyse.
Neem contact op voor advies over kweekmedia, autoclaafapparatuur of kweekmateriaal voor uw specifieke toepassing, of bekijk ons assortiment voor microbiologie en biotechnologie.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
