Het kwantificeren van celgroei is een van de meest fundamentele handelingen in microbiologie, celbiologie en biotechnologie. Of het gaat om de groei van bacteriën in een fermentatieproces, de expansie van gistcellen tijdens de productie van recombinante eiwitten of de proliferatie van zoogdiercellen in een bioreactor (lees ook ons artikel: celkweektechnieken in het laboratorium) — in elk geval is een betrouwbare, reproduceerbare methode voor celkwantificering onmisbaar. De meest gebruikte techniek is de meting van de optische dichtheid bij 600 nm, afgekort als OD600. Dit artikel beschrijft het werkingsprincipe, de praktische uitvoering, de beperkingen en de alternatieve methoden voor celgroei-meting.
Celgroei is het proces waarbij cellen in aantal toenemen door deling. In de microbiologie en celbiologie verwijst de term doorgaans naar de toename van de celpopulatie in een kweekmedium — niet naar de groei van individuele cellen in omvang. Elke cel deelt zich in twee dochtercellen, die zich op hun beurt opnieuw delen: bij voldoende voedingsstoffen en optimale omstandigheden leidt dit tot exponentiële toename van het celgetal.
Celgroei meten is om meerdere redenen essentieel in het laboratorium. In de microbiologie bepaalt de groeicurve het optimale tijdstip voor oogst, de effectiviteit van antibiotica of desinfectiemiddelen en de reproductie van experimentele condities. In de biotechnologie en fermentatie is celgroei een directe maat voor de productiviteit van het proces: meer cellen betekent doorgaans meer doelproduct, of het nu gaat om recombinante eiwitten, enzymen of gefermenteerde metabolieten. In de farmacologie en toxicologie vormt celgroei de basis voor proliferatietesten, waarbij de remmende werking van een stof op celdeling gekwantificeerd wordt. En in het onderwijs maakt het bestuderen van celgroei de principes van microbiologie en celbiologie concreet en meetbaar.
Waarom celgroei belangrijk is, laat zich samenvatten in één zin: zonder betrouwbare celkwantificering zijn experimenten niet reproduceerbaar, processen niet beheersbaar en resultaten niet vergelijkbaar. De keuze van de juiste meetmethode — en de juiste apparatuur en materialen daarvoor — is daarom een kritische beslissing in elk laboratoriumprotocol.
Een eencellig organisme (synoniem: unicellulair organisme of micro-organisme in de brede zin) is een organisme waarvan het volledige leven — stofwisseling, groei, reproductie en respons op omgevingsstimuli — plaatsvindt binnen één enkele cel. In laboratoriumcontext omvat de term zowel prokaryoten als eukaryoten: bacteriën zoals Escherichia coli, Bacillus subtilis en Pseudomonas putida; gisten zoals Saccharomyces cerevisiae en Pichia pastoris; eencellige algen zoals Chlorella vulgaris en Chlamydomonas reinhardtii; en protisten zoals Trypanosoma-soorten in parasitologisch onderzoek. Zoogdiercellijnen als CHO en HEK293 zijn strikt genomen meercellig van oorsprong maar worden als geïsoleerde eencellige suspensies gekweekt en vallen daarmee onder vergelijkbare kweekmethodieken. Het onderscheid tussen eencellig en meercellig is in laboratoriumcontext relevant voor de keuze van meetmethode: eencellige organismen in suspensie lenen zich voor OD600-meting, terwijl meercellige of sterk aggregerende cellen directe tellingmethoden vereisen.
Eencellige prokaryoten (bacteriën, archaea) vermenigvuldigen zich via binaire fissie: de cel vergroot zijn volume, repliceert het chromosoom en deelt zich daarna symmetrisch in twee identieke dochtercellen. Dit proces verloopt zonder mitose of meiose. Eencellige eukaryoten zoals gist vermenigvuldigen zich via knopvorming (budding, bij S. cerevisiae) of via mitotische celdeling; seksuele reproductie door sporenvorming is mogelijk maar treedt op bij stress en niet tijdens actieve laboratoriumkweek. De praktische consequentie voor kwantificering is dat de populatiegroei in de exponentiële fase exact exponentieel verloopt — elke generatietijd verdubbelt het celgetal — en daarmee direct meetbaar is via OD600. De groeisnelheid (μ, uitgedrukt in h−1) is de voornaamste fysiologische parameter die uit de groeicurve wordt afgeleid en die de basis vormt voor procesontwerp in fermentatie en biotechnologie.
De nutriëntenopname van eencellige organismen bepaalt direct de groeisnelheid en de maximale biomassaopbrengst. Chemoheterotrofe bacteriën (waaronder E. coli) oxideren organische koolstofbronnen als glucose als energiebron en gebruiken stikstofbronnen (ammoniumzouten, aminozuren) voor biosynthese. Autotrofe eencelligen zoals cyanobacteriën en algen bedekken hun koolstofbehoefte via CO2-fixatie en gebruiken licht als energiebron — wat specifieke kweekvaten en verlichtingsarrangementen vereist. In laboratoriumkweek bepaalt de samenstelling van het kweekmedium welke nutriënten beschikbaar zijn en daarmee hoe lang de exponentiële fase aanhoudt. Nutriëntlimitatie — met name van de koolstofbron of de stikstofbron — is de meest voorkomende oorzaak van de overgang van de exponentiële naar de stationaire fase. In fed-batch en continuprocessen wordt substraattoevoer nauwkeurig gedoseerd om de groeisnelheid te beheersen en overmatige metabolietophoping (azijnzuur bij E. coli, ethanol bij gist) te vermijden.
Een bacteriële groeicurve is een grafische weergave van het celgetal (of de optische dichtheid) als functie van de tijd, opgenomen nadat bacteriën zijn geïnoculeerd in vers medium. De curve heeft een karakteristieke S-vorm die bestaat uit vier opeenvolgende fasen: lag, exponentieel, stationair en afsterving. Door OD600 op een logaritmische y-as uit te zetten tegen de tijd op een lineaire x-as, wordt de exponentiële fase zichtbaar als een rechte lijn — de helling ervan geeft direct de groeisnelheidsconstante (μ) weer. De groeicurve is een onmisbaar diagnostisch instrument: afwijkingen van het verwachte patroon wijzen op suboptimale mediumsamenstelling, contaminatie, temperatuurvariatie of ongewenste metabolietophoping.
Snel antwoord: OD600 vuistregels
Lineair bereik: OD600 0,1–0,8 — verdun bij hogere waarden en vermenigvuldig met de verdunningsfactor.
Groeifasen op een rij: Lag (aanpassing, OD nauwelijks stijgend) → Exponentieel (log-fase, OD verdubbelt per generatietijd) → Stationair (plateau) → Afsterving (OD daalt)
Kolonies omrekenen naar KVE/ml? Gebruik de kiemgetal-calculator (ISO 4833). Voor de meting zelf: bekijk ons assortiment spectrofotometers & cuvetten bij optisch onderzoek.
OD600 staat voor optische dichtheid gemeten bij een golflengte van 600 nm. Bij deze golflengte absorberen de meeste kweekbodems en celcomponenten minimaal licht, terwijl de cellen zelf de lichtbundel voldoende verstrooien om een betrouwbare meting mogelijk te maken. De keuze voor 600 nm is daarmee een pragmatisch compromis: de achtergrondabsorptie van het groeimedium is laag, de meting is niet-destructief en het benodigde apparatuur (een standaard spectrofotometer of fotometer) is in vrijwel elk laboratorium beschikbaar.
De meting berust op het principe van de wet van Beer-Lambert: de absorptie van licht is evenredig met de concentratie van de lichtabsorberende of lichtverstrooiende deeltjes en de padlengte van de cuvet. In de praktijk geldt dit lineaire verband voor bacteriële suspensies ruwweg tussen OD600-waarden van 0,1 en 0,8. Buiten dit bereik wijkt de meting significant af van lineariteit en moet worden verdund. OD600-meting is daarmee in principe een turbidimetrische techniek; de theoretische achtergrond van turbidimetrie en de verwante nephelometrie (90°-verstrooiingsdetectie) wordt uitgewerkt in het kennisbankartikel over turbidimetrie en nephelometrie.
De keuze voor 600 nm is historisch gegroeid en berust op drie praktische overwegingen. Ten eerste valt 600 nm buiten de sterke absorptiebanden van de meest gebruikte kweekbodems: LB-bouillon, M9-medium en TSB hebben bij 600 nm een relatief lage eigenabsorptie, zodat de blank nauwkeurig te compenseren is. Ten tweede is 600 nm ver genoeg verwijderd van de absorptiepieken van biologische macromoleculen (nucleïnezuren absorberen sterk bij 260 nm, eiwitten bij 280 nm), waardoor de OD600-meting selectief reageert op verstrooiing door intacte cellen en niet op opgeloste celcomponenten. Ten derde produceren de meeste spectrofotometers en fotometers een stabiel, goed gecollimeerd lichtsignaal in het zichtbare rood (~600 nm), wat instrumentvariatie minimaliseert. Bij algen en cyanobacteriën geldt deze redenering niet meer: chlorofyl a absorbeert sterk bij 680 nm en verstoort daarmee de OD600-meting. Daar worden alternatieve golflengten (OD680 of OD730) gebruikt — zie de sectie over golflengte-keuze verderop in dit artikel.
Welke OD600-waarde “goed” is, hangt volledig af van het doel van de meting. Voor het uitvoeren van een betrouwbare spectrofotometrische meting geldt als richtlijn dat de OD600 tussen 0,1 en 0,8 moet liggen — dit is het lineaire bereik van de wet van Beer-Lambert voor bacteriële suspensies. Waarden buiten dit bereik overschatten de werkelijke celdichtheid door meervoudige verstrooiing en vereisen verdunning. Voor experimentele toepassingen gelden de volgende vuistregels: voor het enten van een nieuwe kweek volstaat een OD600 van 0,05–0,1 als startpunt; voor het oogsten van cellen in optimale fysiologische conditie is de mid-log-fase (OD600 0,4–0,8 voor E. coli) het meest geschikt; voor IPTG-inductie van eiwitexpressie is OD600 0,6 de gangbare richtwaarde. Wat “hoog” of “laag” is, verschilt bovendien sterk per organisme: een OD600 van 5,0 is voor E. coli in een fed-batch fermentatie heel gebruikelijk, maar voor zoogdiercellen is OD600 als meetmethode dan al lang niet meer geschikt.
Optische dichtheid (OD) en turbiditeit worden in de praktijk vaak door elkaar gebruikt, maar verwijzen technisch naar verschillende grootheden. Turbiditeit is een maat voor de troebeling van een vloeistof door gesuspendeerde deeltjes en wordt uitgedrukt in NTU (Nephelometric Turbidity Units) of FTU; de meting vindt typisch plaats bij 90° ten opzichte van de lichtbron. Optische dichtheid meet de verzwakking van een lichtbundel in rechte lijn door de suspensie (transmissie-meting) en is een logaritmische grootheid: OD = −log10(I/I0). Voor bacteriële suspensies is de verstrooiing van licht door de cellen de dominante bijdrage aan de OD600-waarde, zodat beide grootheden sterk correleren — maar ze zijn niet uitwisselbaar voor kwantitatieve vergelijkingen.
Dit is een veelgestelde vraag die technisch een belangrijk onderscheid verdient. In strikte zin meet een spectrofotometer bij 600 nm de extinctie (ook wel absorbantie of absorptie genoemd) van de vloeistof, die zowel echte lichtabsorptie als lichtverstrooiing omvat. Voor bacteriële suspensies is verstrooiing veruit de dominante bijdrage: bacteriën absorberen zelf nauwelijks licht bij 600 nm, maar verstrooien de lichtbundel wel. Het apparaat registreert dit verlies aan doorgaand licht als “absorptie”. De term OD600 is daarmee een conventionele, operationele aanduiding die in de microbiologische praktijk breed geaccepteerd is, ook al is de onderliggende fysische grootheid strikt genomen extinctie door verstrooiing en niet door moleculaire absorptie. Voor gekleurde pigmenten in het medium (bijv. fenolrood in celkweekmedium) speelt echte lichtabsorptie wél een rol en verstoort die de OD600-meting — reden om bij OD-metingen altijd hetzelfde medium als blank te gebruiken.
Wanneer bacteriën worden geïnoculeerd in vers groeimedium, doorlopen ze een karakteristiek groeipatroon dat bestaat uit vier opeenvolgende fasen. Het volgen van de OD600 in de tijd geeft direct inzicht in welke fase de cultuur zich bevindt, wat essentieel is voor het plannen van experimenten, het bepalen van het optimale oogsttijdstip en het begrijpen van de fysiologie van de cellen.
Direct na inoculatie passen de cellen zich aan aan het nieuwe milieu. Er vindt nauwelijks celdeling plaats, maar de cellen zijn metabolisch actief: ze synthetiseren enzymen, bouwen ribosomen op en repareren eventuele schade opgelopen tijdens opslag of overdracht. De OD600 stijgt in deze fase nauwelijks. De duur van de lag-fase is afhankelijk van de fysiologische toestand van het inoculum, de temperatuur en de samenstelling van het medium. Een kort inoculum uit de mid-log-fase in identiek medium geeft typisch een lag-fase van minder dan 30 minuten; een inoculum vanuit de stationaire fase of een bevroren stock kan meerdere uren nodig hebben voor herstel. De lag-fase is daarmee niet een teken van inactiviteit maar van intensieve fysiologische voorbereiding: hoe gunstiger de condities, hoe korter het herstel.
In de exponentiële fase is de groeisnelheid maximaal en constant. Elke generatietijd verdubbelt het aantal cellen, wat resulteert in een rechte lijn wanneer de log van de OD600 wordt uitgezet tegen de tijd. Voor Escherichia coli bij 37 °C in rijke media bedraagt de generatietijd typisch 20–30 minuten; voor Saccharomyces cerevisiae bij 30 °C circa 90 minuten. Cellen in de log-fase zijn uniform van grootte en fysiologische toestand, en daarmee het meest geschikt voor biochemische experimenten, eiwit-expressie en het bepalen van de minimale inhibitoire concentratie (MIC) van antibiotica — de laagste concentratie van een antimicrobieel middel waarbij zichtbare groei wordt geremd.
De duur van de exponentiële fase is niet vastgesteld: ze wordt bepaald door de beschikbaarheid van voedingsstoffen en de ophoping van remmende metabolieten. In een gesloten batch-kweek (schudkolf of buisje) met een standaard LB-medium duurt de exponentiële fase voor E. coli bij 37 °C doorgaans 2–4 uur, waarna nutriëntlimitatie of pH-verandering de overgang naar de stationaire fase inleidt. In fed-batch fermentaties met continue toevoeging van substraat kan de log-fase kunstmatig worden verlengd tot tientallen uren. De log-fase eindigt zodra de groeicurve (semi-log plot) afwijkt van lineariteit — dit is het moment waarop de voedingstofconcentratie limiterend wordt.
De generatietijd (ook: verdubbelingstijd, doubling time, symbool td) is de tijd die een celpopulatie nodig heeft om te verdubbelen in aantal. U berekent deze uit twee OD600-metingen in de log-fase:
td = (t2 − t1) × log(2) / log(OD2 / OD1)
Waarbij t1 en t2 de tijdstippen van respectievelijk de eerste en tweede meting zijn (in minuten), en OD1 en OD2 de bijbehorende OD600-waarden. Alternatief kunt u de groeisnelheidsconstante μ berekenen: μ = ln(OD2/OD1) / (t2 − t1), waarna td = ln(2) / μ. Gebruik voor deze berekening uitsluitend meetpunten die aantoonbaar in het lineaire deel van de log-fase vallen (OD600 0,1–0,8 en een rechte lijn in de semi-log plot).
Bij recombinante eiwitproductie in bacteriën — met name E. coli — wordt inductie met IPTG (isopropyl β-D-thiogalactopyranoside) doorgaans uitgevoerd wanneer de cultuur zich in de mid-log-fase bevindt. De gangbare richtlijn is een OD600 van 0,4–0,8 (gemiddeld 0,6) voor inductie bij 37 °C, of een OD600 van 0,6–1,0 bij inductie bij lagere temperaturen (16–25 °C) voor betere oplosbare eiwitopbrengst. Op dit moment zijn de cellen metabolisch actief en kunnen ze de last van overexpressie dragen. Inductie te vroeg (OD < 0,3) geeft een te lage biomassa; inductie te laat (OD > 1,0) kan leiden tot onvoldoende opname van het inductor-molecuul en ophoping van inclusielichamen. De optimale OD voor inductie is systeem- en constructspecifiek en verdient altijd empirische optimalisatie.
Wanneer voedingsstoffen uitgeput raken of toxische metabolieten zich ophopen, komt de netto groei tot stilstand: de celdelingsnelheid en de afstervingssnelheid zijn in evenwicht. De OD600 bereikt een plateau. In de stationaire fase activeren veel micro-organismen stress-respons-mechanismen en produceren ze secundaire metabolieten. Voor fermentatietoepassingen is de stationaire fase soms juist het gewenste oogstmoment, afhankelijk van het doelproduct.
In de afsterfase overtreft de sterfte de celdeling. Cellen lyseren, waardoor de OD600 daalt. Celinhoud komt vrij in het medium, wat de OD-meting kan verstoren: dode cellen en celresten verstrooien licht maar zijn niet levensvatbaar. Dit is een belangrijke reden waarom OD600 alleen levende celconcentratie meet in de log- en vroege stationaire fase.
Voorafgaand aan elke meting wordt het spectrofotometer genulld (geblankeerd) met steriel groeimedium of buffer zonder cellen. Dit compenseert voor de achtergrondabsorptie van het medium zelf. Het blank-monster moet identiek zijn aan het groeimedium van de kweek, inclusief eventuele supplementen. Bij gebruik van complexe media zoals LB-bouillon is consistentie in blankvoorbereiding cruciaal voor vergelijkbaarheid tussen metingen.
Neem een representatief monster van de kweek onder aseptische omstandigheden. Bij OD600-waarden boven 0,8 dient het monster te worden verdund met steriel groeimedium of fysiologisch zout tot een OD600 binnen het lineaire meetbereik van 0,1–0,8. Verdun bij voorkeur serieel (1:2, 1:5 of 1:10) en reken de gemeten OD terug met de verdunningsfactor. Gebruik altijd hetzelfde verdunningsmiddel als het blank.
Vul een schone cuvet met het monster. Voor standaard spectrofotometers wordt een cuvet met 1 cm padlengte gebruikt. Vermijd luchtbellen door de cuvet rustig te vullen en licht te tikken. Plaats de cuvet in de juiste oriëntatie in het apparaat (optische vlakken loodrecht op de lichtbundel) en lees de OD600-waarde af. Noteer datum, tijdstip, verdunningsfactor en de ruwe meting voor de labjournaaldocumentatie.
Voor OD600-metingen zijn wegwerpcuvetten van PMMA (polymethacrylaat) of polystyreen voldoende: beide materialen zijn transparant in het zichtbare golflengtegebied rond 600 nm. Kwartscuvetten zijn niet nodig tenzij ook metingen in het UV-bereik (onder 340 nm) worden uitgevoerd, zoals bij eiwitbepaling op 280 nm of nucleïnezuurmeting op 260 nm. De standaard padlengte is 10 mm (1 cm), wat overeenkomt met de aanname in de wet van Beer-Lambert en vergelijkbaarheid met literatuurwaarden garandeert. Microcuvetten (40–100 µl) zijn bruikbaar bij schaarse monsters maar vereisen verificatie dat de lichtbundel volledig binnen de vloeistofzone valt. Semi-microcuvetten (1,5 ml) zijn een goede keuze voor routinemetingen waarbij monster-volume beperkt is.
De werkelijke OD600 van de onverdunde kweek = gemeten OD × verdunningsfactor. Voor kwantitatieve celtellingen kan de OD worden omgezet naar cel/ml via een vooraf opgestelde kalibratiecurve. Deze curve wordt eenmalig opgesteld door parallelle OD-metingen en plaattellingen (CFU/ml) of Coulter counter-metingen uit te voeren over het volledige groeibereik.
Voor een complete en reproduceerbare celgroei-analyse zijn de volgende materialen en apparatuur nodig.
Een standaard UV/Vis-spectrofotometer instelbaar op 600 nm is de meest universele oplossing. Dedicated celgroei-fotometers (zoals de Biochrom Novaspec of vergelijkbare instrumenten) zijn gefixeerd op 600 nm en eenvoudiger in gebruik. Voor hoge-doorvoer toepassingen zijn microplaat-readers met 600 nm-filter een efficiënt alternatief voor 96- of 384-wells groei-monitoring.
Voor OD600-metingen zijn wegwerpcuvetten van PMMA of polystyreen voldoende — bij 600 nm zijn beide materialen transparant. Kwartscuvetten zijn niet nodig tenzij ook UV-metingen worden uitgevoerd. Gebruik altijd een cuvet met 1 cm padlengte voor consistentie met literatuurwaarden. Beschikbaar in ons assortiment: spectrofotometers & cuvetten.
Voor parallelle plaattellingen (CFU-bepaling) zijn steriele petrischalen van 90 mm onmisbaar. Uitplaatverdelers en inoculatielusjes zorgen voor een reproduceerbare verdeling van het monster over het agaroppervlak.
Voor het pelleteren van cellen (ter bepaling van celdrooggewicht of voor wassen voor OD-meting) zijn centrifugebuizen en reactievaatjes van 1,5 ml, 15 ml en 50 ml nodig. Gebruik buizen van polypropyleen die compatibel zijn met de gebruikte centrifuge en rotor.
Nauwkeurig pipetteren is essentieel voor betrouwbare verdunningsreeksen. Gebruik gekalibreerde micropipetten voor volumes van 2–1000 µl en filterpipetpunten voor aseptisch werk om kruisbesmetting te vermijden. Ons assortiment pipetten en pipetpunten & tips biedt oplossingen voor elk volume.
Bij het werken met grotere cellen of celclusters — zoals plantencelculturen, schimmeldraden of aggregerende gistcellen — is een celzeef nodig om aggregaten te verwijderen vóór de OD-meting. Celclusters verstrooien licht disproportioneel en geven een overschatting van de celconcentratie. Een stamper wordt gebruikt in combinatie met de celzeef bij het bereiden van eencellige suspensies uit weefsel of vaste kweek. Bekijk onze celzeef in ons assortiment.
Een tafelcentrifuge is nodig voor het pelleteren van cellen bij celdrooggewicht-bepaling, het wassen van cellen voor OD-metingen in alternatief medium, en het bereiden van celvrij supernatant voor substraatanalyse. Bekijk ons assortiment laboratorium centrifuges.
OD600 is een indirecte, geïntegreerde maat voor celmassa — de methode meet verstrooiing van licht door alle deeltjes in de suspensie, niet uitsluitend levende cellen. Dit heeft een aantal praktische consequenties die de analist moet kennen.
Een OD600-waarde die de werkelijke celdichtheid overschat, kan meerdere oorzaken hebben. De meest voorkomende zijn: (1) een te hoge celdichtheid waardoor meervoudige verstrooiing optreedt buiten het lineaire bereik van de wet van Beer-Lambert; verdunnen lost dit op. (2) Aanwezigheid van celresten of lysaat in de suspensie, wat met name speelt in de late stationaire of afsterfase. (3) Luchtbellen in de cuvet die de lichtdoorgang verstoren. (4) Een inadequaat blankmonster dat de achtergrondabsorptie van het medium niet volledig compenseert — met name bij gebruik van troebele of sterk gekleurde supplementen zoals galzoutmengsels of inductiemiddelen. (5) Celclusters of aggregaten, die licht sterk verstrooien zonder een proportionele celconcentratie te vertegenwoordigen. Het is daarom altijd goed praktijk om bij onverwacht hoge OD-waarden een verdunningsreeks te meten en te controleren of de gemeten waarden lineair schalen met de verdunningsfactor.
De meetmethoden voor bacteriële en zoogdiercelgroei overlappen deels, maar er zijn fundamentele praktische verschillen. Bacteriën (1–5 µm) zijn te klein om betrouwbaar te tellen met een standaard lichtmicroscoop of Coulter counter, waardoor OD600 en plaattelling (CFU) de aangewezen methoden zijn. Zoogdiercellen (10–30 µm) zijn groot genoeg voor directe meting via hemocytometer of geautomatiseerde celtelautomaten, en hun celdichtheden liggen typisch 100–1000 maal lager dan bacteriële dichtheden bij vergelijkbare OD-waarden. Dit maakt OD600 voor zoogdiercellen minder gevoelig en minder informatief. Bovendien groeien zoogdiercellen vaak gehecht aan een oppervlak (adherente cultuur), waardoor directe fotometrie van het medium geen zinvol signaal geeft; voor adherente culturen worden viabiliteitstesten als de MTT-assay of celtellingen na trypsinisering gebruikt. Voor suspensieculturen van zoogdiercellen (CHO, HEK293) is de hemocytometer met trypan blauw de meest toegankelijke methode.
OD600 is niet in alle situaties de meest geschikte methode. Afhankelijk van het organisme, de nauwkeurigheidseis en de beschikbare apparatuur zijn alternatieve of complementaire methoden beter geschikt.
Plaattelling is de goudstandaard voor het bepalen van het aantal levensvatbare cellen. Een bekende verdunningsreeks wordt uitgeplate op selectief of niet-selectief agar en het aantal kolonies wordt geteld na incubatie.
CFU/ml staat voor “Colony Forming Units per milliliter”, oftewel kolonievormende eenheden per milliliter. Elke kolonie op het agaroppervlak stamt in theorie af van één levensvatbare cel (of soms een clump van meerdere aaneengekitte cellen) uit het uitgangsmonster. CFU/ml meet uitsluitend levende, deelbare cellen — een fundamenteel verschil met OD600, dat geen onderscheid maakt tussen levende en dode cellen en ook celresten meetelt. Om CFU/ml te berekenen, deelt u het gemiddeld aantal getelde kolonies (bij voorkeur 30–300 kolonies per plaat) door het uitgeplate volume (in ml) en vermenigvuldigt u met de verdunningsfactor: CFU/ml = (aantal kolonies / uitgeplaat volume in ml) × verdunningsfactor. Nadeel van plaattelling: resultaten zijn pas na 12–48 uur beschikbaar (afhankelijk van het organisme) en de methode is arbeidsintensief. Voor de omrekening conform ISO 4833 kunt u gebruik maken van onze kiemgetal-calculator (ISO 4833) — zie de vuistregels-box bovenaan dit artikel. Een praktisch overzicht van de volledige procedure — van verdunningsreeks en uitplaatmethodetot telbereik en normen — vindt u in het kennisbankartikel kiemplaaten kolonietelling — voedsel- en pharmalab, praktisch.
Met een hemocytometer en een lichtmicroscoop worden cellen direct geteld in een bekend volume. De methode is snel en geeft directe celconcentratie in cellen/ml. Een hemocytometer (ook: telkamer) is een dik glazen objectglaasje met een precies gedefinieerde telkamer van bekende diepte (0,1 mm), gemarkeerd met een gegraveerd rasterpatroon. Door cellen in de rastervakjes te tellen en te vermenigvuldigen met de verdunningsfactor en de kamerfactor (typisch 104 voor een Neubauer-kamer) verkrijgt u de celdichtheid in cellen/ml.
Trypan blauw is de meest gebruikte vitaliteitskleuring voor celtellingen onder de lichtmicroscoop. De kleurstof passeert de beschadigde celmembraan van dode cellen en kleurt het cytoplasma intens blauw, terwijl levende cellen met een intacte celmembraan de kleurstof uitsluit en daardoor ongekleurd (kleurloos of licht geel) blijven. Dit principe heet de trypan blauw-exclusiemethode. Het percentage levensvatbare cellen — de viabiliteit — wordt berekend als het aantal kleurloze cellen gedeeld door het totale celgetal, uitgedrukt als percentage. Een viabiliteit boven 90% wordt voor de meeste celkweek-toepassingen als acceptabel beschouwd. Alternatieve vitaliteitskleuringen zoals propidiumjodide (PI) worden toegepast in combinatie met flowcytometrie voor hogere throughput. De hemocytometer is geschikt voor eukaryote cellen (gist, zoogdiercellen); voor bacteriën is de resolutie van een standaard lichtmicroscoop onvoldoende.
Cellen worden gecollecteerd door centrifugatie, gewassen en gedroogd bij 105 °C tot constant gewicht. CDG is de meest directe maat voor celmassa en wordt gebruikt als referentie voor kalibratie van OD-metingen en voor massabalansberekeningen in fermentatieprocessen. Nadeel: destructieve en tijdrovende methode, niet geschikt voor frequente monitoring.
Flowcytometrie biedt naast celtellingen ook informatie over celgrootte, granulositeit en de aanwezigheid van specifieke markers (fluorescente antilichamen, DNA-kleuringen). De methode is bijzonder waardevol voor heterogene celpopulaties en voor het bepalen van celcyclusdistributie. Lees meer in ons artikel over flowcytometrie.
Een Coulter counter meet de elektrische impedantieverandering wanneer een cel door een nauwe opening stroomt. Dit geeft nauwkeurige celtellingen en celgroottedistributies onafhankelijk van optische eigenschappen. Breed ingezet in de farmaceutische industrie en voor bloedceltelling.
De MTT-assay is een colorimetrische methode voor het meten van celviabiliteit en celproliferatie, met name bij zoogdiercellen en tumorcelllijnen. Metabolisch actieve cellen reduceren het gele MTT-reagens (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide) tot een paars formazanproduct. De hoeveelheid formazaan, gemeten als absorptie bij 570 nm, is evenredig met het aantal levende, metabolisch actieve cellen. De MTT-assay is daarmee gevoelig voor zowel celproliferatie als cytotoxiciteit — een belangrijk verschil met OD600, dat geen onderscheid maakt tussen levende en dode cellen. Verwante assays zijn de MTS-, WST-1- en resazurine (PrestoBlue)-assay, die een vergelijkbaar principe gebruiken maar direct oplosbare kleurproducten vormen en daardoor minder bewerkingsstappen vereisen. Voor kwantitatieve celtellingen in combinatie met viabiliteitsbepaling kan ook flowcytometrie worden ingezet.
In onderzoek naar celproliferatie worden specifieke moleculaire markers gebruikt die aantonen dat een cel actief deelt. De meest toegepaste zijn Ki-67, een nucleair eiwit dat tot expressie komt in alle actieve fasen van de celcyclus (G1, S, G2 en M) maar afwezig is in rustende cellen (G0), en BrdU (bromodeoxyuridine) of het veiliger alternatief EdU (5-ethynyl-2′-deoxyuridine), die worden ingebouwd in nieuw gesynthetiseerd DNA tijdens de S-fase. Detectie van deze markers vindt plaats via immunofluorescentie of flowcytometrie. Ze geven kwantitatieve informatie over het percentage delende cellen in een populatie — iets wat OD600 of CFU niet kunnen bieden. Voor celcyclus-analyse en het opstellen van een proliferatietest zijn deze markers onmisbaar in moleculair-biologisch en farmacologisch onderzoek.
Via kwantitatieve PCR op specifieke celmarkers (zoals 16S rRNA-gen voor bacteriën) kan de hoeveelheid genetisch materiaal worden gekwantificeerd als maat voor celdichtheid. Bijzonder waardevol voor complexe mengpopulaties of omgevingsmonsters waar cultivering niet mogelijk is. Voor absolute celkwantificering zonder standaardcurve is digitale PCR (ddPCR) een aanvullende optie. Lees meer in ons artikel over SNP-genotypering en PCR-technieken.
De keuze voor 600 nm is gangbaar voor bacteriën en gist, maar niet universeel. Voor bepaalde toepassingen worden andere golflengten gebruikt.
Voor algen en cyanobacteriën is OD600 in de meeste gevallen niet geschikt als primaire groeimaat. Het probleem is dat chlorofyl a een sterke absorptiepiek heeft bij 680 nm, maar ook bij 600 nm nog significant licht absorbeert. Dit leidt tot een overschatting van de werkelijke celconcentratie, die bovendien niet-lineair schaalt met de chlorofylconcentratie afhankelijk van de lichtgeschiedenis van de cultuur (chloroplastveranderingen bij lichtadaptatie). Voor groene algen zoals Chlorella of Chlamydomonas wordt OD680 of OD750 aanbevolen; OD680 geeft een signaal dat deels door chlorofyl wordt bepaald maar bruikbaar is als relatieve groeimaat, terwijl OD750 buiten de chlorofylabsorptie valt en selectiever reageert op celmassa. Voor cyanobacteriën (zoals Synechocystis of Arthrospira) geldt OD730 als gangbare standaard. Wanneer u wisselt van OD-golflengte, dient u altijd een specifieke kalibratiecurve op te stellen voor uw eigen stam, medium en spectrofotometer.
OD600 en OD280 zijn voor volledig verschillende toepassingen bedoeld en mogen niet worden verward. OD600 meet celconcentratie via verstrooiing van zichtbaar licht door intacte cellen; het signaal is grotendeels onafhankelijk van de chemische samenstelling van de cellen. OD280 meet de absorptie van ultraviolet licht door aromatische aminozuren (tyrosine, tryptofaan, fenylalanine) in eiwitten, en wordt gebruikt voor de bepaling van de eiwitconcentratie in gezuiverde fracties of celextracten. OD280 is dus geen maat voor celmassa of celgetal, maar voor opgelost eiwit. Beide golflengten vereisen verschillende cuvetten bij lage OD280-waarden (PMMA is niet UV-transparant; kwarts of speciaal UV-glas is vereist), terwijl voor OD600 goedkope wegwerp-PMMA-cuvetten volstaan.
Een kalibratiecurve maakt het mogelijk om OD600-waarden te converteren naar absolute celconcentraties (cellen/ml of CFU/ml). De curve is organisme-, medium- en instrumentspecifiek en moet eenmalig worden bepaald voor elke nieuwe combinatie. De procedure is als volgt:
Voor E. coli geldt als ruwe vuistregel dat OD600 = 1,0 overeenkomt met circa 8 × 108 cellen/ml, maar dit varieert sterk per stam, groeimedium en spectrofotometer. Bij OD600 = 0,5 zijn dat dus ruwweg 4 × 108 cellen/ml — en bij OD600 = 0,1 circa 8 × 107 cellen/ml. Voor S. cerevisiae, met een celvolume van 20–50 maal groter dan een E. coli-cel, ligt de celdichtheid bij OD600 = 1,0 een factor 10–40 lager, dus ruwweg 2–5 × 107 cellen/ml. Voor Bacillus subtilis en andere staafvormige bacteriën van vergelijkbaar formaat gelden vergelijkbare richtwaarden als voor E. coli, maar sporenvormende stammen kunnen afwijken doordat sporen een sterk afwijkend lichtverstrooiingsprofiel hebben. Deze waarden zijn oriënterend: voor nauwkeurige kwantificering is een laboratoriumspecifieke kalibratiecurve onmisbaar.
OD600 en CFU/ml meten elk een ander aspect van de celpopulatie. OD600 meet de totale hoeveelheid lichtverstrooiend materiaal — levende cellen, dode cellen én celresten — en geeft daarmee een ogenblikkelijk resultaat. CFU/ml meet uitsluitend het aantal cellen dat in staat is een kolonie te vormen, dus exclusief dode of beschadigde cellen. In de log-fase, wanneer nagenoeg alle cellen levensvatbaar zijn, correleren OD600 en CFU/ml goed en schaalt de relatie lineair binnen het kalibratiebereik. In de late stationaire fase of afsterfase divergeren de twee methoden sterk: de OD600 kan gelijk blijven of zelfs stijgen door ophoping van celresten, terwijl CFU/ml daalt door afname van levende cellen. Het gelijktijdig meten van OD600 en CFU/ml geeft daarmee aanvullende informatie over de levensvatbaarheidsstatus van de cultuur. Als vuistregel geldt dat een significante discrepantie tussen de verwachte OD-CFU-correlatie (op basis van de kalibratiecurve) en de gemeten waarden altijd een aanleiding is voor nader onderzoek.
Er bestaat geen universeel beste methode voor celtelling: de keuze hangt af van het organisme, de vereiste nauwkeurigheid, de beschikbare tijd en apparatuur, en de vraag of u levende en dode cellen wilt onderscheiden. De onderstaande vergelijking helpt bij het maken van een afgewogen keuze.
Voor de meeste routinetoepassingen in microbiologie en fermentatie biedt OD600 de beste balans tussen snelheid en praktische uitvoerbaarheid. Wanneer het onderscheid tussen levende en dode cellen kritisch is — zoals bij toxiciteitstesten, antibiotica-onderzoek of procesoptimalisatie — verdient plaattelling (CFU) of een vitaliteitskleuring de voorkeur. Voor zoogdiercellen is de hemocytometer met trypan blauw de toegankelijkste keuze; bij grotere aantallen monsters biedt flowcytometrie hogere throughput en meer informatie per meting.
In de microbiologie wordt UV/Vis dagelijks gebruikt om celgroei te meten via OD600: de troebelheid van een bacteriecultuur bij 600 nm is een maat voor de biomassa.
Voor vragen over de juiste materiaalkeuze voor uw specifieke toepassing — of het nu gaat om bacteriële fermentatie, celkweek of algenteelt — kunt u contact opnemen met ons voor deskundig advies. Neem contact op of bekijk ons volledige assortiment voor biotechnologie & moleculaire biologie.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
