MTT-assay en celviabiliteit

De MTT-assay is de meest gebruikte methode voor het bepalen van celviabiliteit en celproliferatie in het laboratorium. Het principe berust op de omzetting van het gele tetrazoliumzout MTT door metabolisch actieve cellen in een paars formazanproduct, waarvan de hoeveelheid spectrofotometrisch wordt gemeten. Hoe meer levende, metabolisch actieve cellen aanwezig zijn, hoe intenser de kleur. De assay wordt ingezet voor cytotoxiciteitstests, screeningsstudies van geneesmiddelen, en de beoordeling van behandelingseffecten op celgroei en -overleving. Voor de toepassing van viabiliteitsassays op driedimensionale celstructuren, zie het kennisbankartikel 3D-celkweek: sferoïden, scaffolds, hydrogelen en organ-on-chip.

Wat is celviabiliteit?

Celviabiliteit (ook wel cellevensvatbaarheid of cellulaire levensvatbaarheid) is het percentage levende cellen in een celmonster ten opzichte van het totale aantal cellen. Een hoge celviabiliteit geeft aan dat cellen metabolisch actief en intact zijn; een lage celviabiliteit duidt op celdood, stress of beschadiging. In celkweekexperimenten is een celviabiliteit van 90% of hoger de standaard voor gezonde kweken die geschikt zijn voor experimenten. Een celviabiliteit onder 70% wijst op problemen met het kweekmilieu, een besmetting, of een giftig effect van een teststof.

Waarom is de levensvatbaarheid van mijn cellen zo laag?

Een celviabiliteit onder 80–85% in een routine celkweek wijst vrijwel altijd op een pre-analytisch probleem. De meest voorkomende oorzaken zijn:

• Besmetting (contaminatie) — Bacteriële of schimmelcontaminatie verlaagt de pH van het medium en concurreert met cellen om voedingsstoffen. Controleer het medium onder de microscoop op troebeling, kleurverandering (pH-indicator in het medium slaat om) of zichtbare deeltjes. Gebruik altijd steriele technieken en antibiotica in het kweekmedium.
• Incorrecte temperatuur of CO₂-concentratie — De meeste zoogdiercellen groeien optimaal bij 37 °C en 5% CO₂. CO₂ reguleert via het bicarbonaat-buffersysteem de pH van het medium; afwijkingen leiden tot pH-stress en celdood. Controleer de incubatorinstellingen en kalibreer regelmatig.
• Verouderd of verkeerd medium — Groeifactoren in FBS, glutamine en vitaminen degraderen na verloop van tijd. Gebruik medium dat niet ouder is dan vier weken na bereiding en bewaar het bij 4 °C, beschermd tegen licht. L-glutamine is bijzonder instabiel: gebruik glutamine-gestabiliseerde media of voeg vers L-glutamine toe voor gebruik.
• Te hoge of te lage celdichtheid — Overbevolkte kweekflessen raken uitgeput in nutriënten en zuurstof; cellen worden gecomprimeerd en gaan in apoptose. Te weinig cellen missen paracrien signaalstoffen die de overleving stimuleren. Passeer cellen voordat ze meer dan 80–90% confluent zijn.
• Cryopreservatieprobleem — Cellen die direct na ontdooien worden ingezet zonder voldoende hersteltijd hebben een tijdelijk verlaagde viabiliteit. Ververs het medium 4–24 uur na het uitzaaien om DMSO (het cryoprotectans) te verwijderen, dat toxisch is voor cellen bij langdurige blootstelling.
• Mycoplasmacontaminatie — Mycoplasma’s zijn kleine bacteriën zonder celwand die niet zichtbaar zijn onder lichtmicroscoop en geen troebeling van het medium veroorzaken, maar de celstofwisseling en viabiliteit ernstig kunnen verstoren. Test celkweken regelmatig op mycoplasma met een specifieke detectiekit.

Hoe kan de levensvatbaarheid van cellen worden verbeterd?

Afhankelijk van de oorzaak zijn de volgende maatregelen effectief:

• Ververs het medium dagelijks of om de dag bij snelgroeiende cellijnen.
• Optimaliseer het FBS-percentage voor het specifieke celtype (standaard 10%, maar sommige cellijnen groeien beter bij 5% of 20%).
• Gebruik gevalideerde celcultuurflessen en controleer regelmatig op mycoplasma.
• Zorg voor een stabiele CO₂-incubator; log temperatuur en CO₂ continu met dataloggers.
• Beperk het aantal passages: cellen bij hoog passagenummer kunnen genetisch driften en verlaagde viabiliteit of abnormaal gedrag vertonen.

Voor de MTT-assay specifiek geldt dat lage celviabiliteit in de kweek zich direct vertaalt naar een laag en variabel MTT-signaal. Controleer de viabiliteit altijd met een trypan blauw-telling vóór aanvang van de assay en verwerk uitsluitend kweken met een viabiliteit van 90% of hoger.

Wat zijn levensvatbare en niet-levensvatbare cellen?

Levensvatbare cellen hebben een intacte celmembraan, een functionerend metabolisme en het vermogen om te delen. Niet-levensvatbare cellen hebben de membraanintegriteit verloren — een van de vroegste en meest betrouwbare indicatoren van celdood. Dit onderscheid vormt de basis van veel viabiliteitstesten: kleurstoffen zoals trypan blauw dringen door beschadigde membranen, waardoor dode cellen blauw kleuren en levende cellen kleurloos blijven.

Wat zijn de voornaamste oorzaken van celbeschadiging?

Celbeschadiging is de eerste stap op weg naar verlies van celviabiliteit. De oorzaken worden ingedeeld in vier categorieën:

• Chemische toxiciteit — Blootstelling aan giftige stoffen, geneesmiddelen, vrije radicalen (reactieve zuurstofspecies, ROS) of toxische metabolieten beschadigt eiwitten, lipiden en DNA. In cytotoxiciteitstests is dit de primaire oorzaak van viabiliteitsverlies die de MTT-assay kwantificeert.
• Osmotische stress — Een te hoge of te lage zoutconcentratie in het medium veroorzaakt cel-krimpen (bij hypertonische condities) of cel-zwellen en lysis (bij hypotonische condities). Osmotische stress treedt ook op bij onzorgvuldig wassen van cellen met water in plaats van PBS.
• Thermische schade — Temperaturen boven 42 °C veroorzaken hitte-shock en eiwitdenaturatie; temperaturen onder het vriespunt zonder cryoprotectans leiden tot ijskristallen die de celmembraan doorsteken. Koude schade treedt ook op bij het werken met cellen op kamertemperatuur voor langere tijd.
• Mechanische schade — Overmatig pipetteren, vortexen of centrifugeren met te hoge g-krachten beschadigt de celmembraan fysiek. Dit is een veelgemaakte fout bij de verwerking van fragiele primaire cellen of suspensiecellen.
• Hypoxie en nutriëntdepletie — Zuurstofgebrek (bij te hoge celdichtheid of onvoldoende beluchting) en uitputting van glucose, glutamine of groeifactoren leiden tot energietekort en apoptose. Dit onderscheidt zich van directe toxiciteit doordat het effect gradueel optreedt.
• Straling en UV-schade — Ioniserende straling (gamma, röntgen) en UV-licht beschadigen het DNA door dubbelstrengbreuken resp. thyminedimeervorming. Dit activeert DNA-schade-responsmechanismen, die — bij onvoldoende herstel — leiden tot apoptose of permanente groeirem.

De MTT-assay detecteert celbeschadiging indirect: zodra de metabole activiteit van een cel daalt — als vroeg signaal van schade, vóór membraanruptuur — neemt het formazansignaal af. Voor het onderscheid tussen reversibele beschadiging (verminderd metabolisme) en onomkeerbare celdood (membraanbreuk) is een aanvullende methode nodig, zoals een LDH-vrijzettingsassay of trypan blauw-exclusie.

Wat is de MTT-assay?

MTT staat voor 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide, een geel, wateroplosbaar tetrazoliumzout. Metabolisch actieve cellen reduceren MTT tot paars, onoplosbaar formazan. De reductie wordt uitgevoerd door NAD(P)H-afhankelijke oxidoreductasen, waarvan oorspronkelijk werd aangenomen dat ze uitsluitend mitochondriaal waren (succinaatdehydrogenase). Modern onderzoek heeft echter aangetoond dat zowel mitochondriale als cytoplasmatische en endosomale enzymen bijdragen aan de reductie. Het signaal is daarmee een maat voor de algehele metabole activiteit van de cel, niet uitsluitend voor mitochondriale functie. De assay is kwantitatief: de intensiteit van de paarse kleur, gemeten via absorptie bij 570 nm, is evenredig met het aantal levende, metabolisch actieve cellen.

Wat is de rol van NAD(P)H bij de MTT-assay?

NAD(P)H — de gereduceerde vorm van nicotinamide-adeninedinucleotide (NADH) en nicotinamide-adeninedinucleotidefosfaat (NADPH) — is de centrale elektronendonor in de MTT-reductie. Oxidoreductasen in de cel gebruiken NADH of NADPH om elektronen over te dragen op het MTT-molecuul, waardoor het tetrazoliumzout wordt omgezet naar formazan. De concentratie NAD(P)H in een cel is rechtstreeks gekoppeld aan de glycolyse, de citroenzuurcyclus en de mitochondriale ademhalingsketen: processen die alleen actief zijn in metabolisch levende cellen. Dode of beschadigde cellen hebben een sterk verlaagd NAD(P)H-gehalte en geven daardoor nauwelijks of geen formazansignaal. Dit maakt NAD(P)H-afhankelijke reductie tot een betrouwbare proxy voor cellulaire vitaliteit. Belangrijk voorbehoud: stoffen die het celmetabolisme stimuleren of remmen zonder cellen te doden — zoals metabole inhibitoren of bepaalde groeifactoren — beïnvloeden het NAD(P)H-gehalte en daarmee het MTT-signaal, zonder dat het celaantal verandert. In zulke gevallen geeft de MTT-assay metabole activiteit weer, niet uitsluitend het aantal levende cellen.

Wanneer kiest u voor de MTT-assay?

De MTT-assay is de aangewezen keuze wanneer u snel, goedkoop en in hoge doorvoer de metabolische activiteit van cellen wilt kwantificeren. De methode is bijzonder geschikt voor:

• Cytotoxiciteitstests en geneesmiddelenscreening — de 96-wells microplaatopzet maakt het mogelijk om in één experiment meerdere concentraties en controles parallel te meten.
• Vergelijkende studies — wanneer u het effect van een behandeling wilt uitdrukken als percentage ten opzichte van een onbehandelde controle, levert de MTT-assay een robuuste, reproduceerbare maat.
• Routinematige kwaliteitscontrole van celkweken — de assay is eenvoudig te standaardiseren en vereist geen gespecialiseerde apparatuur buiten een microplaatlezer.

De voordelen ten opzichte van oudere methoden zijn aanzienlijk: er is geen radioactiviteit nodig (zoals bij tritiumthymidine-incorporatie), de reagentia zijn stabiel en breed beschikbaar, en het protocol past binnen een standaard werkdag. Ten opzichte van fluorescentiegebaseerde methoden is de MTT-assay doorgaans kostenefficiënter en minder gevoelig voor interferentie door autofluorescentie van het medium. De methode heeft echter ook beperkingen: het is een eindpuntmeting (de cellen worden gelyseerd), en stoffen die zelf reducerend werken of sterk absorberen bij 570 nm kunnen het signaal verstoren. In die gevallen verdient een alternatieve methode de voorkeur — zie de vergelijkingstabel verderop in dit artikel.

Principe van de MTT-assay (MTT-kleuring)

Het biochemische principe verloopt in drie stappen:

1. Incubatie met MTT: MTT-oplossing (typisch 0,5 mg/ml in PBS of medium) wordt aan de cellen toegevoegd en gedurende 2–4 uur geïncubeerd bij 37 °C in een CO₂-incubator. Cellulaire oxidoreductasen reduceren het gele MTT tot paars formazan, dat als kristallen neerslaat.
2. Oplossen van formazan (solubilisatie): het formazanprecipitaat is onoplosbaar in water en moet worden opgelost. DMSO (dimethylsulfoxide) is het meest gebruikte oplosmiddel: het lost de kristallen volledig en snel op tot een homogene paarse oplossing. Alternatieven zijn SDS/HCl of isopropanol/HCl.
3. Spectrofotometrische meting: de absorptie van de oplossing wordt gemeten bij 570 nm (met referentiegolflengte bij 630–690 nm om achtergrondabsorptie te corrigeren). De gemeten absorptiewaarde is evenredig met de hoeveelheid formazan en daarmee met het aantal levende cellen.

Waarom wordt 570 nm gebruikt bij de MTT-assay?

Formazan absorbeert maximaal bij circa 570 nm (het absorptiemaximum ligt tussen 540 en 590 nm, afhankelijk van het oplosmiddel). Bij deze golflengte is het signaal het sterkst en de gevoeligheid het hoogst. De referentiegolflengte van 630–690 nm wordt gebruikt voor achtergrondcorrectie; bij die golflengten absorbeert formazan nauwelijks, zodat het verschil tussen 570 nm en de referentiegolflengte een betrouwbaarder signaal oplevert.

De MTT-assay is in de kern een UV/Vis-meting: het geproduceerde formazan wordt spectrofotometrisch gekwantificeerd bij 570 nm volgens de wet van Lambert-Beer.

Waarom wordt DMSO gebruikt in de MTT-assay?

DMSO wordt gebruikt als solubilisatiemiddel omdat het formazankristallen snel en volledig oplost in een homogene, paarse oplossing die stabiel is voor spectrofotometrische meting. DMSO is ook effectief bij kamertemperatuur, waardoor het protocol eenvoudig en snel uitvoerbaar is. Nadeel: DMSO is hygroscopisch en damp kan de microplaatlezer beïnvloeden; de plaat moet direct na toevoeging van DMSO worden afgelezen. Bovendien lyseert DMSO de cellen, waardoor de meting een eindpunt is en er na de assay geen levende cellen meer beschikbaar zijn.

Protocol: hoe voer je een MTT-assay uit?

1. Cellen inzaaien: zaai cellen in een 96-well microplaatformat in het juiste medium (doorgaans met 10% FBS) en laat 24 uur aangroeien. De microplaat-format en spectrofotometrische uitlezing van de MTT-assay zijn vergelijkbaar met die van een ELISA — beide assays maken gebruik van dezelfde microplaatlezers en absorptieprincipes.
2. Behandeling: vervang het medium door medium met de teststof in de gewenste concentraties. Incubeer gedurende de gewenste behandelingstijd.
3. MTT toevoegen: voeg MTT-oplossing (eindconcentratie 0,5 mg/ml) toe aan elk well. Incubeer 2–4 uur bij 37 °C, 5% CO₂, beschermd tegen licht.
4. Medium verwijderen: verwijder voorzichtig het medium inclusief niet-omgezet MTT zonder de formazankristallen te verstoren.
5. Solubilisatie: voeg 100–150 µl DMSO per well toe en meng goed (pipetteren of schudden) tot alle kristallen zijn opgelost.

Voor MTT-assays op 96-well platen versnelt een meerkanaalspipet zowel de mediaverwijdering als de DMSO-solubilisatie aanzienlijk. De pipet keuzewijzer helpt u bepalen of een handmatige of elektronische uitvoering het best aansluit op uw werkstroom.

6. Meting: meet de absorptie bij 570 nm (referentie 630 nm) in een microplaatlezer.
7. Berekening: zie de sectie hieronder.

Hoelang duurt een MTT-assay?

De totale doorlooptijd van een MTT-assay bedraagt doorgaans één tot meerdere dagen, afhankelijk van de behandelingsduur. De aanzetstap (inzaaien en aangroeien) vraagt 24 uur; de behandeling met de teststof duurt 24–72 uur afhankelijk van het experimentele ontwerp. De eigenlijke MTT-stap — incubatie, solubilisatie en uitlezing — neemt vervolgens 3–4 uur in beslag. Bij een standaard cytotoxiciteitsexperiment met 48 uur behandeling rekent u dus op een totale werkduur van ongeveer drie dagen, waarvan de actieve handen-aan-het-werk-tijd beperkt is tot enkele uren.

Hoe bewaart u MTT-oplossing?

MTT-poeder is relatief stabiel bij bewaring op een droge, donkere en koele plek (2–8 °C), maar is lichtgevoelig en hygroscopisch: blootstelling aan licht versnelt afbraak, en vocht kan het poeder doen klonteren en de oplosbaarheid verlagen. Bewaar MTT-poeder altijd in een goed afgesloten, lichtdichte verpakking. MTT-oplossing (in PBS of serumvrij medium) is beduidend minder stabiel dan het poeder: bereid bij voorkeur vers op de dag van gebruik, of bewaar gealiquoteerde porties maximaal 1–2 weken bij −20 °C in lichtdichte tubes. Vermijd herhaald invriezen en ontdooien. Een goed voorteken van bruikbaarheid is de kleur: een heldergele oplossing is correct; een oranje of bruine verkleuring duidt op oxidatie en geeft aanleiding tot een lagere of variabele MTT-reductie. Verwijder in dat geval de oplossing en bereid een nieuwe batch.

Kan de MTT-assay worden geautomatiseerd?

Ja, de MTT-assay leent zich goed voor automatisering. De stapsgewijze opzet — vloeistoftoevoeging, incubatie en spectrofotometrische uitlezing — is volledig compatibel met liquid handling robots en geïntegreerde laboratoriumsystemen. In routinematige screeningslaboratoria en farmaceutisch onderzoek worden de volgende stappen geautomatiseerd uitgevoerd:

• Vloeistofhandling: het inzaaien van cellen, toevoegen van teststoffen in serieverdunning, toevoeging van MTT-oplossing en solubilisatie met DMSO zijn alle geschikt voor pipetteerrobots met multi-channel of 96-kanaals dispenserkoppen.
• Microplaatlezer: moderne microplaatlezers lezen een volledig 96-wells of 384-wells formaat automatisch uit en exporteren absorptiewaarden direct naar analysesoftware.
• High-throughput screening (HTS): bij grootschalige geneesmiddelscreening wordt de MTT-assay in 384-wells of 1536-wells formaat uitgevoerd, waarbij duizenden verbindingen per dag getest kunnen worden.

Aandachtspunten bij automatisering zijn de timing van de solubilisatiestap (DMSO verdampt snel; directe uitlezing na toevoeging is essentieel) en de nauwkeurige kalibratie van dispens-volumes bij kleine wellvolumes in 384-wells formaat.

Optimaal inzaaigetal en lineair bereik

Voor een betrouwbare MTT-assay moet het inzaaigetal binnen het lineaire bereik van de assay vallen: de absorptie moet recht evenredig zijn met het aantal cellen. Het optimale inzaaigetal hangt af van het celtype, de behandelingsduur en de proliferatiesnelheid. Vuistregels:

• Snelgroeiende cellijnen (bijvoorbeeld HeLa, HEK293) — start met 3.000–5.000 cellen per well voor een 48–72-uurs assay.
• Langzaam groeiende of primaire cellen — 10.000–20.000 cellen per well om voldoende signaal te bereiken.
• Niet-prolifererende cellen (bijvoorbeeld gedifferentieerde neuronen, hepatocyten) — hoger inzaaigetal en kortere assay; resultaat is metabolisch in plaats van proliferatief.

Een celkalibratiecurve (absorptie versus inzaaigetal, gemeten op het tijdstip van MTT-toevoeging) is voor elke nieuwe cellijn essentieel om het lineaire bereik vast te stellen. Buiten dit bereik treedt verzadiging op (te veel cellen, signaal vlakt af) of is het signaal te dicht bij de detectiegrens (te weinig cellen).

Hoe bereken je celviabiliteit met de MTT-assay?

De celviabiliteit wordt uitgedrukt als percentage ten opzichte van een onbehandelde controlereeks:

Celviabiliteit (%) = (absorptie behandeld − absorptie blanco) / (absorptie onbehandeld controle − absorptie blanco) × 100

Een waarde van 100% betekent geen effect op celviabiliteit; een waarde van 50% duidt op een halvering van het signaal. Voor een betrouwbare berekening is het essentieel dat de blanco-wells (medium zonder cellen, maar met MTT en DMSO) worden meegemeten en van alle absorptiewaarden worden afgetrokken.

IC50, GI50, TGI en LC50

Bij dosis-respons-curves worden verschillende drempelwaarden gebruikt die niet altijd hetzelfde betekenen:

• IC50 — de concentratie waarbij het MTT-signaal gehalveerd is ten opzichte van de controle. Algemeen begrip; combineert anti-proliferatie en celdood.
• GI50 (Growth Inhibition 50%) — de concentratie waarbij de groei met 50% wordt geremd ten opzichte van de controle, met correctie voor het uitgangsaantal cellen op t = 0.
• TGI (Total Growth Inhibition) — de concentratie waarbij geen netto celgroei optreedt; eindpunt gelijk aan de t = 0-meting.
• LC50 (Lethal Concentration 50%) — de concentratie waarbij 50% van de cellen ten opzichte van de uitgangswaarde gedood is; eindpunt is lager dan de t = 0-meting.

Voor een correcte interpretatie wordt een dosis-respons-curve gefit met een sigmoïdaal model (vier-parameter Hill-vergelijking), waaruit IC50/GI50 en de Hill-coëfficiënt worden afgeleid.

Wat is het verschil tussen IC50 en CC50?

IC50 en CC50 worden in de literatuur soms door elkaar gebruikt, maar betekenen niet hetzelfde. IC50 (Inhibitory Concentration 50%) is een brede term voor de concentratie waarbij een biologisch effect — zoals enzymremming, groeiremming of virusreplicatieremming — met 50% is afgenomen ten opzichte van de controle. CC50 (Cytotoxic Concentration 50%) is specifieker: het is de concentratie waarbij 50% van de cellen cytotoxische schade ondervindt, gemeten via een viabiliteitsassay zoals de MTT-assay. In antiviraal en antimicrobieel onderzoek worden beide waarden vaak naast elkaar gerapporteerd. Uit de verhouding CC50/IC50 wordt de selectiviteitsindex (SI) berekend: een hoge SI betekent dat een stof effectief is tegen het doelwit (virus, bacterie) bij concentraties die voor de gastheercel weinig toxisch zijn. Een SI van 10 of hoger geldt doorgaans als minimumdrempel voor verdere ontwikkeling van een kandidaatverbinding.

Replicaten en statistiek

Voor publicatie- en regelgevingskwaliteit gelden de volgende richtlijnen:

• Technische replicaten — minimaal drie wells per conditie binnen dezelfde plaat, voor het corrigeren van pipetteer- en plaatfouten.
• Biologische replicaten — minimaal drie onafhankelijke experimenten op verschillende dagen of celpassages, voor statistisch betrouwbare uitspraken.
• Edge-effect controle — de buitenste wells van een 96-well plaat zijn gevoelig voor verdamping; deze worden vaak gevuld met PBS en niet voor metingen gebruikt.
• Statistische analyse — voor het vergelijken van twee groepen wordt een t-toets gebruikt, voor meerdere groepen ANOVA met post-hoc-test (bijvoorbeeld Dunnett's of Tukey's). Dosis-respons-data worden gemodelleerd met niet-lineaire regressie.

Is de MTT-assay kwantitatief of kwalitatief?

De MTT-assay is een kwantitatieve methode: de gemeten absorptie is binnen een lineair bereik proportioneel aan het aantal metabolisch actieve cellen. Het lineaire bereik hangt af van het celtype en de celdichtheid, maar ligt typisch tussen 1.000 en 50.000 cellen per well bij een 96-well formaat. Buiten dit bereik is de relatie niet meer lineair en zijn resultaten onbetrouwbaar.

Celviabiliteit versus cytotoxiciteit

Celviabiliteit en cytotoxiciteit zijn twee kanten van dezelfde munt, maar meten een ander aspect:

Cytotoxiciteit en viabiliteit zijn niet altijd elkaars perfecte spiegelbeeld: een afname van het MTT-signaal kan worden veroorzaakt door celdood (echte cytotoxiciteit), maar ook door een louter anti-proliferatief effect waarbij cellen levend blijven maar niet meer delen. Voor het onderscheid is een aanvullende methode nodig, zoals een LDH-vrijzettingsassay (specifiek voor membraanschade) of trypan blauw-exclusie.

Celproliferatie versus apoptose

Celproliferatie en apoptose zijn tegengestelde processen. Celproliferatie is de toename van het celaantal door celdeling; apoptose is geprogrammeerde, gecontroleerde celdood. De MTT-assay meet metabolische activiteit en kan beide niet direct onderscheiden: een afname van het MTT-signaal kan duiden op verminderde proliferatie, apoptose, of necrose. Voor het onderscheid tussen apoptose en necrose zijn aanvullende methoden nodig, zoals caspase-activiteitstests of annexine-V/propidiumjodide-flowcytometrie.

Kan de MTT-assay worden gebruikt voor bacteriën?

Ja, de MTT-assay kan in aangepaste vorm worden toegepast op bacteriën en andere micro-organismen. Bacteriële cellen bezitten eveneens NAD(P)H-afhankelijke oxidoreductasen die MTT kunnen reduceren tot formazan, waardoor metabolisch actieve bacteriën een meetbaar signaal geven. De methode wordt onder meer ingezet voor:

• Antimicrobiële screening — het bepalen van de minimale inhiberende concentratie (MIC) van antibiotica of desinfectantia in microplaatformaat.
• Biofilmviabiliteit — het kwantificeren van metabolisch actieve cellen in biofilms, waarbij de MTT-assay een alternatief biedt voor kweekmethoden die aan de biofilmmatrix gehechte cellen onderschatten.
• Milieutoxicologie — het meten van de toxische effecten van stoffen op bacteriële gemeenschappen.

De uitvoering wijkt op enkele punten af van de eukaryote versie. Bacteriën hebben geen mitochondriën; de MTT-reductie verloopt primair via membraangebonden en cytoplasmatische oxidoreductasen. De incubatietijd, pH en buffersamenstelling moeten worden afgestemd op het gebruikte organisme. Daarnaast kan de celwand van gramnegatieve bacteriën de penetratie van MTT beperken, wat de signaalintensiteit verlaagt. Een celvrije blanco en een groeicurve zijn ook hier onmisbaar voor een betrouwbare interpretatie.

Veelvoorkomende problemen bij de MTT-assay

• Achtergrondabsorptie: het medium, serumcomponenten en bepaalde teststoffen kunnen zelf absorberen bij 570 nm. Altijd een blanco (medium zonder cellen) meenemen en aftrekken.
• Interferentie van teststoffen: kleurige verbindingen, reducerende stoffen (ascorbinezuur, glutathion, polyfenolen) of stoffen die het mitochondriaal metabolisme beïnvloeden geven een vals signaal. Controleer de teststof op eigen absorptie bij 570 nm en op rechtstreekse MTT-reductie in een celvrij controle-experiment.
• Onvolledige solubilisatie: niet volledig opgeloste formazankristallen geven een laag en variabel signaal. Zorg voor goede menging en zichtbaar homogene oplossing voor de meting.
• Te weinig of te veel cellen: buiten het lineaire bereik is de correlatie met celaantal onbetrouwbaar. Bepaal altijd vooraf het optimale inzaaigetal via een celkalibratiecurve.
• Te korte of te lange MTT-incubatietijd: bij te kort incuberen is de conversie onvolledig; bij te lang incuberen kan formazan zich ophopen buiten de cel en kristalliseren op het plasmaoppervlak.
• pH-gevoeligheid: sterke pH-veranderingen in het medium tijdens de assay (bijvoorbeeld door zure of basische teststoffen) beïnvloeden zowel de MTT-reductie als de kleur van het formazan.

Alternatieven voor de MTT-assay

Naast de MTT-assay zijn er andere veelgebruikte celviabiliteitstests, elk met eigen voor- en nadelen:

Wat is het verschil tussen de MTT-assay en WST-1 / CCK-8?

WST-1 en WST-8 (het actieve bestanddeel van CCK-8) zijn tetrazoliumzouten van de tweede generatie die zijn ontwikkeld om de belangrijkste praktische beperking van MTT te omzeilen: de noodzaak van een solubilisatiestap. Waar MTT een onoplosbaar formazanprecipitaat vormt dat met DMSO moet worden opgelost, produceren WST-1 en WST-8 een wateroplosbaar formazanproduct dat direct in het medium wordt gemeten. Dit levert een eenvoudiger protocol op met minder pipetteerstappen en minder kans op variatie door onvolledige oplossing. Daarnaast zijn WST-gebaseerde assays niet-destructief: het medium kan na de meting worden verwijderd en de cellen blijven in leven voor vervolgexperimenten. Een ander verschil is dat WST-reductie voornamelijk extracellulaire enzymen en membraangebonden reducerende activiteit meet, terwijl MTT ook intracellulaire reductie omvat. In de praktijk zijn de uitkomsten voor de meeste celtypen vergelijkbaar, maar bij cellen met afwijkende membraanpermeabiliteit of bij stoffen die de membraanintegriteit beïnvloeden, kunnen de twee methoden uiteenlopende resultaten geven. MTT blijft de voorkeursmethode wanneer een lager reagensiakostenniveau en een breed gevalideerd protocol doorslaggevend zijn; WST-1/CCK-8 verdient de voorkeur wanneer herhaalde metingen op dezelfde cellen, eenvoudiger automatisering of vermijding van DMSO-blootstelling prioriteit hebben.

Waarom 10% FBS gebruiken in celkweek?

Foetaal bovien serum (FBS) bevat groeifactoren, hormonen, adhesieproteïnen en transporteiwitten die essentieel zijn voor de proliferatie en het overleven van de meeste celtypes in kweek. Een concentratie van 10% FBS is de standaard voor veel cellijnen en biedt een optimale balans tussen groeiondersteuning en kostprijs. Te weinig FBS leidt tot verminderde celgroei en lagere viabiliteit; te veel FBS kan de resultaten van cytotoxiciteitstests verstoren doordat serumeiwitten teststoffen binden. Voor de MTT-assay is het standaard om alle behandelingen in medium met hetzelfde FBS-percentage uit te voeren als de kweekcondities.

Gerelateerde onderwerpen bij Labvakhandel

De MTT-assay is onderdeel van een bredere celkweekpraktijk. Zie het kennisbankartikel over celkweektechnieken voor achtergrond bij het opzetten en onderhouden van celkweken. Bekijk ook het artikel over bioreactoren en fermentatie voor schaalvergroting van celkweekprocessen. Voor microplaatlezers, pipetten en verbruiksartikelen voor de MTT-assay kunt u terecht in de categorie biotechnologie & moleculaire biologie of petrischalen, PCR-platen & microtiterplaten.

Onderdeel van: Klinisch laboratorium

Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.