Een spectrofotometer is een instrument dat de hoeveelheid licht meet die een monster absorbeert of doorlaat bij een instelbare golflengte. Het apparaat wordt gebruikt in uiteenlopende laboratoria voor kwantitatieve analyse op basis van de wet van Lambert-Beer. Dit artikel beschrijft de opbouw, de instrumenttypen, de keuze van cuvetten en lichtbronnen, de kalibratie en het dagelijks gebruik — met bijzondere aandacht voor praktische vragen die in het lab regelmatig worden gesteld.
Voor de theoretische achtergrond van UV/Vis-spectrofotometrie — de absorptieprincipes, toepassingen en meetprotocollen — verwijzen wij naar het kennisbankartikel Over UV/Vis-spectrofotometrie. Voor rechtstreekse absorptieberekeningen staat de Lambert-Beer calculator beschikbaar.
Een spectrofotometer bestaat uit vijf functionele onderdelen die in serie zijn geschakeld: de lichtbron, de monochromator, de cuvethouder, de detector en de signaalverwerking. Elk onderdeel bepaalt mede de nauwkeurigheid, het golflengtegebied en de gevoeligheid van het instrument.
De lichtbron levert het polychromatische licht dat na golflengteselectie door het monster wordt gestuurd. Voor het UV-gebied (200–400 nm) wordt een deuteriumlamp (D₂-lamp) gebruikt. Deze gasgloeilamp produceert een continue spectrumuitstoot in het UV-bereik en is onmisbaar voor metingen aan eiwitten, nucleïnezuren en aromatische verbindingen. Voor het zichtbare gebied (400–800 nm) wordt een wolframhalogeen- of wolframlamp toegepast. Moderne full-spectrum spectrofotometers combineren beide lampen in één instrument met een automatische wisselschakeling rond 340–360 nm.
Xenonlampen (pulsed xenon) zijn een alternatief dat breed spectrum UV/Vis-licht levert vanuit één bron, een lange levensduur heeft en direct na aanschakeling meetklaar is. Ze worden ingezet in instrumenten waarbij frequent wisselen tussen UV en Vis wordt vereist of waarbij een koude start gewenst is.
De monochromator selecteert uit het brede spectrum van de lichtbron één smalle band van golflengten die het monster bereikt. De monochromator bestaat doorgaans uit:
De spleetbreedte bepaalt de spectrale bandbreedte: een smallere spleet geeft een puurder monochromatisch licht maar reduceert de lichtintensiteit. In de praktijk is een bandbreedte van 1–2 nm gangbaar voor routine-UV/Vis-werk; voor hogere spectrale resolutie (bijv. bij overlappende absorptiebanden) wordt de spleetbreedte verkleind.
Een filter is een passief optisch element dat slechts één vaste golflengteband doorlaat en alle overige blokkeert. Eenvoudige fotometers gebruiken uitwisselbare interferentiefilters (bijv. 540 nm, 620 nm) voor vaste golflengten; er is geen continue afstemming mogelijk. Een monochromator laat de golflengte continu instellen over het volledige meetbereik van het instrument. Het voordeel van een filter is de hogere lichtopbrengst (grotere openingshoek) en de lagere kosten; het nadeel is de beperkte selectiviteit. Spectrofotometers met een monochromator zijn veelzijdiger en bieden de mogelijkheid om een volledig absorptiespectrum op te nemen.
De cuvethouder positioneert het meetvat precies in de lichtbundel. Standaard is een padlengte van 1 cm; dit correspondeert met de breedte van een standaard cuvet. Sommige instrumenten beschikken over een variabele cuvethouder voor 0,2 cm-, 1 cm- en 5 cm-cuvetten, waarmee het meetbereik naar boven of beneden kan worden uitgebreid zonder dat de concentratie van het monster hoeft te worden aangepast. Bij semi-micro- en microcuvetten wordt de padlengte gehandhaafd op 1 cm maar het volume gereduceerd via een afgetaperd inwendig lumen.
Moderne spectrofotometers beschikken over thermostateerbare cuvethouders voor kinetische metingen waarbij de temperatuur constant moet worden gehouden (bijv. enzymkinetiek bij 37 °C), en over meervoudige cuvethouders (6- of 8-positie) voor het meten van series monsters zonder tussentijds wisselen.
De detector zet het doorgelaten licht om in een elektrisch signaal dat wordt verwerkt tot de absorptiewaarde. Twee detectortypen worden gebruikt:
Bij diode-array-detectie (DAD/PDA) wordt het polychromatische licht na het monster door een rooster gesplitst en op een reeks van 512 of 1024 fotodioden geprojecteerd. Hierdoor wordt het volledige spectrum simultaan gemeten zonder bewegende mechanische delen, wat robuust en snel is. DAD-spectrofotometers worden toegepast als detector in HPLC-systemen en in standalone spectrofotometers voor snel spectraal werk.
De meest fundamentele keuze bij spectrofotometers is die tussen een enkelbalk- (single beam) en een dubbelbalk- (double beam) configuratie.
Bij een enkelbalkinstrument loopt één lichtbundel afwisselend door de blanco en het monster. De blanco wordt eerst gemeten en opgeslagen als nulreferentie; vervolgens wordt het monster gemeten. Drift van de lichtbron tussen beide metingen in wordt niet gecompenseerd. Enkelbalkinstrumenten zijn eenvoudiger, goedkoper en compact, en voldoen voor de meeste routinemetingen bij een vaste golflengte.
Bij een dubbelbalkinstrument wordt de lichtbundel gesplitst in twee parallelle paden: één door het monster en één door de blanco (referentiestraal). Beide worden tegelijk gemeten. De absorptiewaarde wordt berekend als het verschil in log(I₀/I) van beide stralen, waardoor lampintensiteitsdrift in real time wordt gecorrigeerd. Dubbelbalkspectrofotometers geven betere nauwkeurigheid bij spectrumopnames over een breed golflengtegebied en bij kinetische metingen waarbij de meting lang duurt.
Een fotometer (ook: colorimeter of filterfotonmeter) is een eenvoudiger apparaat dat werkt met vaste interferentiefilters in plaats van een monochromator. Het apparaat is alleen bruikbaar op de golflengten waarvoor filters aanwezig zijn. Fotometers zijn compacte veldinstrumenten die worden gebruikt voor gestandaardiseerde kleurreacties (bijv. met Hach- of Spectroquant-testkits voor wateranalyse). Ze zijn robuust en eenvoudig te bedienen maar bieden geen mogelijkheid voor spectrumopnames of aanpassing van de golflengte.
Een spectrofotometer biedt continue golflengteinstelling, spectrumopname en hogere selectiviteit. Voor een volledig overzicht van de vergelijking zie het artikel Fotometrische en colorimetrische bepalingen.
Een microvolume spectrofotometer (ook: nano-drop of pedestal spectrofotometer) meet monsters van slechts 0,5–2 µl zonder cuvet. Het monster wordt aangebracht op een sokkel (pedestal); oppervlaktespanning houdt het monster in de lichtbundel. De padlengte wordt automatisch ingesteld op 0,5 mm of 1 mm, afhankelijk van de absorptiewaarde, en omgerekend naar een equivalente 1 cm-waarde. Microvolume spectrofotometers worden vrijwel uitsluitend gebruikt voor DNA/RNA-kwantificering (A260) en eiwitbepaling (A280 of Bradford) in moleculair-biologische laboratoria waar het monstervolume schaars is.
Een microplaatlezer (plate reader) meet absorptie (en optioneel fluorescentie of luminiscentie) in standaard 96-, 384- of 1536-putjesplaten. Het licht loopt van boven of van onderen door de kleine vloeistoflaag in elk putje; de padlengte is daarin gelijk aan de vloeistofhoogte. Microplaatlezers worden gebruikt voor ELISA, celviabiliteitsassays (MTT, WST-1), eiwitkwantificering in series en kinetische enzymassays in hoge doorvoer (HTS). De padlengte in een putje is niet 1 cm maar afhankelijk van het vulvolume; voor kwantificering wordt altijd gewerkt met een ijklijn op dezelfde plaat.
Voor metingen in het UV-gebied (200–320 nm) is een cuvet van smeltekwarts (UV-kwaliteit kwarts, SiO₂) vereist. Kwarts is transparant tot circa 190 nm en wordt niet aangetast door organische oplosmiddelen. Optisch glas is transparant vanaf circa 340 nm en is daarmee ongeschikt voor UV-werk. Kunststof cuvetten van PMMA (polymethylmethacrylaat) transmitteren geen licht onder circa 320 nm en zijn uitsluitend geschikt voor metingen in het zichtbare bereik. Kunststof cuvetten van polystyreen (PS) zijn transparant vanaf circa 340 nm.
Plastic disposable cuvetten zijn kostenefficiënt voor routinemetingen in het Vis-gebied en worden na gebruik weggegooid, waardoor contaminatierisico's worden geëlimineerd. Kwartscuvetten zijn herbruikbaar maar vereisen zorgvuldige reiniging en opslag.
Kwartscuvetten worden na gebruik direct gespoeld met demiwater, gevolgd door spoelen met het volgende te gebruiken oplosmiddel. Bij hardnekkige residuen wordt gespoeld met 1 M salpeterzuur of 1 M zoutzuur (tijdelijk, maximaal enkele minuten) gevolgd door uitgebreid naspoelen met demiwater. Nooit schuren of mechanisch reinigen; de optische vlakken (vensters) zijn kwetsbaar. Bewaar kwartscuvetten gevuld met demiwater of leeg en droog in een stofdichte doos; bewaar ze nooit leeg met open vensters op een laboratoriumbank waar stof en dampen het glas kunnen aantasten.
De lichtbundel treedt via één optisch vlak in de cuvet in en verlaat de cuvet via het tegenoverliggende vlak. Beide vlakken moeten optisch zuiver en vlak zijn zodat het licht ongestoord door het monster gaat. De twee zijwanden die haaks op de lichtbundel staan zijn opaque (mat geslepen of bedrukt) om reflectie en strooilicht te minimaliseren. Altijd de doorzichtige zijden van de cuvet in de lichtbundel plaatsen; nooit de doorzichtige vlakken met de vingers aanraken — vetsporen op de optische vlakken veroorzaken storende absorptie en verstrooiing.
Kalibratie van een spectrofotometer omvat doorgaans drie aspecten:
In gereguleerde omgevingen (ISO 17025, GMP, farmacopee) worden kalibratie en verificatie gedocumenteerd als onderdeel van het IQ/OQ/PQ-kwalificatietraject. Tussen formele kalibraties door is een dagelijkse controle met een bekende standaard aan te bevelen om vroege signaalverschuivingen te detecteren. Meer achtergrond over kalibratieprincipes staat in het kennisbankartikel kalibratie en verificatie van laboratoriumapparatuur.
De spectrale bandbreedte (SBW, ook: halve-hoogtebreedte of FWHM) is de breedte van het golflengtevenster dat de monochromator doorlaat, gemeten bij de helft van de maximale transmissie. Een SBW van 1 nm betekent dat licht tussen λ−0,5 en λ+0,5 nm het monster bereikt. Een kleinere SBW geeft een puurder monochromatisch licht, betere spectrale resolutie en een betere geldigheid van de Beer-Lambert wet bij stoffen met scherpe absorptiebanden. Een grotere SBW geeft meer lichtintensiteit op de detector maar slechtere spectrale resolutie en grotere afwijkingen van Beer-Lambert bij stoffen met smalle banden. Standaard voor routine-UV/Vis is SBW 1–2 nm; voor hoge-resolutiewerk (bijv. lanthanide-ionen met smalle emissiebanden) wordt SBW < 0,5 nm gebruikt.
Strooilicht (stray light) is licht van golflengten buiten de gewenste band dat de detector toch bereikt — via reflecties in de monochromator, verstrooiing door stof of via de cuvet. Bij lage absorptiewaarden is de invloed van strooilicht verwaarloosbaar, maar bij hoge absorptiewaarden (A > 2) wordt het totale signaal op de detector gedomineerd door strooilicht, waardoor de gemeten absorptie lager is dan de werkelijke waarde (negatieve afwijking van Beer-Lambert). Strooilicht is de voornaamste oorzaak van de maximale meetbare absorptie van een instrument, die voor moderne spectrofotometers typisch A = 2–3 bedraagt.
De deuteriumlamp zendt UV-straling uit die bij onbeschermde blootstelling schadelijk is voor ogen en huid. Kortdurende blootstelling aan UV-C-straling (200–280 nm) kan fotokeratitis veroorzaken — een tijdelijke maar pijnlijke beschadiging van het hoornvlies — en huidverbranding. Herhaalde blootstelling verhoogt op termijn het risico op cataract. In normaal gebruik is dit risico minimaal omdat de lamp volledig is afgeschermd in de gesloten behuizing van het instrument. Het risico doet zich voor tijdens onderhoud en lampvervanging. Schakelt u de lamp altijd uit voordat u de lampbehuizing opent. Als dit om technische redenen niet mogelijk is, draag dan een gecertificeerde UV-bril die ook UV-A en UV-B absorbeert. Raadpleeg ook het kennisbankartikel over persoonlijke bescherming in het laboratorium.
Meet altijd bij de absorptiemaximum (λmax) van de te bepalen stof. λmax is de golflengte waarop de absorptie het hoogst is; meting op λmax geeft de hoogste gevoeligheid en de beste lineariteit van de ijklijn. De λmax is stof- en pH-afhankelijk en staat vermeld in de farmacopee, in de methodeomschrijving van een testkit of kan worden bepaald door een absorptiespectrum van een bekende standaard op te nemen. Wijk nooit af van de voorgeschreven golflengte tenzij u dit expliciet heeft gevalideerd.
Een blanco is een oplossing die alle componenten bevat behalve de te meten stof (analyt). De blanco corrigeert voor absorptie door het oplosmiddel, buffers, reagentia en eventuele achtergrondkleur van de matrix. Bij kleurreacties (Bradford, BCA) bevat de blanco alle reagentia maar geen eiwit. Bij directe metingen (DNA, A280) is demiwater of de gebruikte buffer de blanco. Het instellen van de blanco als nulpunt (auto-zero) zorgt ervoor dat de gemeten absorptie uitsluitend die van de analyt vertegenwoordigt. Bij troebele monsters kan een monsterspeficieke blanco (het monster zelf vóór toevoeging van het reagens) worden gebruikt om lichtverstrooiing te corrigeren.
Een ijklijn (kalibratiefunctie) wordt opgesteld door de absorptie te meten van een reeks standaardoplossingen met bekende concentraties, gespreid over het verwachte meetbereik van de onbekende monsters. Doorgaans worden 5–7 punten gebruikt plus een nulpunt (blanco). De concentratie wordt uitgezet op de x-as, de absorptie op de y-as. Binnen het lineaire bereik van Beer-Lambert verwacht u een rechte lijn door de oorsprong; controleer de R² (aanbevolen > 0,999 voor kwantitatieve analytische toepassingen). Meer achtergrond over ijklijnen, lineariteit en de beoordeling van kalibratiedata staat in het kennisbankartikel kalibratielijn en lineariteit.
Bij een kinetische meting wordt de absorptie gevolgd als functie van de tijd bij een vaste golflengte en vaste temperatuur. Deze meetmodus wordt gebruikt bij enzymassays waarbij de productiesnelheid van een gekleurd of UV-absorberende verbinding evenredig is met de enzymactiviteit. Een klassiek voorbeeld is de NADH-afname bij 340 nm bij NAD⁺-gekoppelde dehydrogenase-reacties. De initiaalsnelheid (ΔA/min) in het lineaire deel van de kinetische curve is de analytisch relevante parameter. Zie ook kinetische analysemethoden voor achtergrond.
De meest voorkomende oorzaken van onjuiste absorptiewaarden zijn: vingerafdrukken op de optische vlakken van de cuvet, luchtbellen in de cuvet, troebelheid van het monster door onopgeloste deeltjes of neerslag, absorptie buiten het lineaire bereik van Beer-Lambert (A > 1,5, verdun het monster), verkeerde golflengte, een niet-correct ingestelde blanco, en condensatie of verontreinigingen in de cuvethouder. Controleer bij twijfel altijd het absorptiespectrum van het monster ter vergelijking met de verwachte spectrumvorm van de stof.
Een spectrometer is een breder begrip: elk instrument dat een spectrum meet — van lichtabsorptie tot -emissie tot massaspectra. Een spectrofotometer is specifiek een instrument dat de lichtabsorptie of -transmissie van een monster meet als functie van golflengte; het is een subtype van spectrometer. In het laboratorium verwijst "spectrometer" in spectroscopische context dikwijls naar een emissiespectrometer (bijv. ICP-OES) of een massaspectrometer, terwijl "spectrofotometer" voorbehouden is aan absorptiemetingen in UV/Vis.
Een spectrofotometer meet lichtabsorptie: hoeveel van het invallende licht het monster absorbeert op de weg van lichtbron naar detector (transmissierichting). Een fluorimeter (fluorescentiespectrofotometer) meet fluorescentie-emissie: het monster wordt belicht bij een excitatiegolflengte, waarna het emitteerde licht bij een andere (langere) golflengte haaks op de invallende bundel wordt gemeten. Fluorescentie is vele malen gevoeliger dan absorptiemeting maar is alleen toepasbaar voor fluorescerende verbindingen of na derivatisering. Meer achtergrond staat in het kennisbankartikel fluorescentie-spectroscopie.
Een refractometer meet de brekingsindex van een vloeistof, die een maat is voor de opgeloste-stofconcentratie in eenvoudige oplossingen (bijv. suiker in water). Een spectrofotometer meet lichtabsorptie. Refractometrie is sneller en vereist geen lichtbron of detector in de zin van spektrofotometrie, maar is minder selectief en niet toepasbaar bij complexe matrices. Beide technieken zijn complementair.
Spectrofotometers worden in vrijwel alle laboratoriumdisciplines ingezet. Enkele kerngebieden:
Het golflengtemeetbereik van standaard UV/Vis-spectrofotometers is doorgaans 190–1100 nm. Het fotometrisch meetbereik (absorptie) is typisch A = 0 tot A = 3 à 4, maar in de praktijk is het lineaire bereik beperkt tot A = 0,1–1,5 (Beer-Lambert). Buiten dit bereik treden negatieve afwijkingen op door strooilicht en hoge-concentratie-effecten. Bij metingen met A > 1,5 altijd verdunnen voor betrouwbare resultaten.
Deuterium- en wolframhalogeen-lampen moeten opwarmen voordat de lichtintensiteit stabiel is. De meeste fabrikanten adviseren een opwarmtijd van 15–30 minuten voor de deuteriumlamp voor kwantitatieve UV-metingen. Een wolframlamp stabiliseert sneller (5–10 minuten). Xenonlampen (pulsed xenon) zijn nagenoeg direct stabiel na aanschakeling. Meet nooit direct na het inschakelen van de lamp zonder eerst de basislijn te controleren.
Troebelheid veroorzaakt lichtverstrooiing die de gemeten absorptie kunstmatig verhoogt. Voor troebele monsters zijn centrifugeren of filtreren via een membraanfilter de aangewezen voorbereidingsstappen. In specifieke gevallen (bacteriële suspensies, OD₆₀₀-meting) wordt troebelheid juist gebruikt als indirecte maat voor celconcentratie. Voor directe meting van troebelheid als eigenschap (turbiditeit) wordt een turbidimeter of nefelometer ingezet.
Een isobestisch punt is een golflengte waarop twee chemische vormen van een stof (bijv. een zuur-base-paar of twee conformaties van een eiwit) dezelfde molaire extinctiecoëfficiënt hebben, zodat de totale absorptie op die golflengte onafhankelijk is van de verhouding tussen de twee vormen. Meting op een isobestisch punt maakt het mogelijk de totale concentratie van beide vormen samen te kwantificeren ongeacht de evenwichtspositie. Isobestische punten worden gebruikt in pH-indicatormethoden, bij de studie van conformationele veranderingen van eiwitten en bij spectrofotometrische titraties. Zie ook spectrofotometrische titratie.
Temperatuur beïnvloedt de absorptie op twee manieren: via de dichtheid en viscositeit van het oplosmiddel (geringe invloed) en via de moleculaire evenwichten van de opgeloste stof (grotere invloed bij pH-gevoelige chromoforen en biologische macromoleculen). Voor kinetische enzymmeting is thermostatie van de cuvethouder essentieel. Bij eiwitten kan verhoogde temperatuur denaturatie veroorzaken met bijbehorende veranderingen in het absorptiespectrum (hyperchroomeffect bij DNA bij smelten). Voor routinebepaling bij kamertemperatuur is stabilisatie van het monster en de cuvethouder op dezelfde temperatuur een aanbevolen praktijk.
Een VIS-spectrofotometer meet uitsluitend in het zichtbare gebied (400–800 nm) en heeft een wolframlamp en glasoptiek. Hiermee kunnen gekleurde oplossingen worden gemeten maar geen UV-absorptie (eiwitten, DNA, aromatische verbindingen). Een UV/Vis-spectrofotometer is uitgerust met zowel een deuteriumlamp als een wolframlamp en met kwartsoptiek, en meet van circa 190–1100 nm. Voor laboratoria die ook eiwitten, nucleïnezuren of UV-absorberende farmaceutica meten, is een UV/Vis-instrument vereist.
Bij een spectrofotometrische titratie wordt de absorptie van een oplossing gemeten als functie van het toegevoegde titrantvolume in plaats van een potentiaal of kleuromslag met het oog. Het eindpunt wordt bepaald uit het inflectiepunt of de breuk in de absorptie-titrantcurve. Deze aanpak is objectiever dan visuele eindpuntdetectie en is toepasbaar bij licht gekleurde of troebele oplossingen waarbij indicatoren moeilijk leesbaar zijn.
Voor spectrofotometrische metingen vindt u bij Labvakhandel spectrofotometers en optisch meetinstrumenten, plastic disposable cuvetten, kwartscuvetten en glazen cuvetten en het volledige assortiment laboratoriumapparatuur. Neem contact op voor advies over de keuze van het juiste instrument voor uw toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
