Nano-LC — ook geschreven als nano-vloeistofchromatografie of capillaire vloeistofchromatografie — is een variant van HPLC waarbij extreem dunne kolommen en flowsnelheden van slechts nanoliters per minuut worden gebruikt. Het resultaat is een drastisch hogere gevoeligheid, een sterk verminderd monsterverbruik en een uitstekende koppeling met massaspectrometrische detectie. Dit artikel legt uit hoe nano-LC werkt, welke componenten een rol spelen en in welke toepassingen de techniek onmisbaar is.
Bij conventionele HPLC stroomt de mobiele fase door een kolom met een inwendige diameter van 2,1 tot 4,6 mm, bij flowsnelheden van 0,2 tot 2 mL/min. Nano-LC gebruikt kolommen met een inwendige diameter van 10 tot 100 µm en flowsnelheden van 10 tot 1000 nL/min — drie tot vijf ordes lager. Die verkleining heeft een diepgaand effect: doordat analyt-moleculen in een kleinere vloeistofhoeveelheid blijven geconcentreerd, stijgt de piekconcentratie en daarmee de gevoeligheid bij elektrosprayverdamping (ESI) tot wel 1000 maal ten opzichte van standaard-HPLC.
De term capillaire vloeistofchromatografie (capillary LC) wordt soms gebruikt voor het bredere bereik van 0,1 tot 0,5 mm kolomdiameter (met flows van 1–10 µL/min), terwijl nano-LC strikt genomen de kolommen onder 100 µm ID aanduidt. In de praktijk worden beide termen regelmatig door elkaar gebruikt.
De onderstaande figuur toont de belangrijkste schaalverschillen tussen de vier technieken.
De vermindering van de kolomdiameter heeft twee directe voordelen. Ten eerste wordt het benodigde monstervolume kleiner: waar een HPLC-injectie 1–20 µL bedraagt, volstaan bij nano-LC injecties van 1–500 nL. Ten tweede neemt het solventverbruik sterk af, wat zowel de laboratoriumkosten als de afvalstroom verlaagt.
Het scheidingsprincipe is identiek aan dat van standaard vloeistofchromatografie: analyt-moleculen wisselen reversibel uit tussen de mobiele fase (vloeistof) en de stationaire fase (kolomvulling). Componenten met een grotere affiniteit voor de stationaire fase elueren later. Wat verschilt, is de schaal van elk onderdeel.
De pomp moet nauwkeurig flows leveren in het nL/min-bereik. Dit vereist speciale zuigerpompen met een minimaal dood volume of een splitsysteem waarbij een conventionele pomp een hogere flow genereert die vóór de kolom wordt gesplitst. Pulsdempende systemen zijn essentieel: zelfs kleine flowvariaties verstoren het signaal bij massaspectrometrie. Sommige nano-LC-systemen werken met directe nanopompen zonder splitter (splitless), wat de kans op verlies van schaarse monsters vermindert.
Monstervolumes van 1 tot 500 nL worden ingebracht via een injectieklep met een nano-loop. Automatische injectie gebeurt met behulp van een autosampler die is aangepast voor kleine volumes. Het is cruciaal dat het dode volume tussen injectiepunt en kolomingang minimaal is om piekverbreding te voorkomen.
Veel nano-LC-opstellingen gebruiken een trapkolom (trapping column) vóór de eigenlijke analytische kolom. De trapkolom concentreert het monster en wast ongewenste matrixcomponenten weg. Na het laden wordt de trapkolom in lijn geschakeld met de analytische kolom en begint de gradiëntelutie. De analytische kolom heeft een lengte van 5 tot 50 cm en een ID van 10 tot 100 µm, gepakt met deeltjes van 1,7 tot 3 µm of gevuld met monolietmateriaal. De kolom-efficiëntie is hoog: plaatnummers van 50.000 tot 200.000 zijn haalbaar bij optimale omstandigheden.
Nano-LC is bij uitstek geschikt voor koppeling met massaspectrometrie via elektrosprayverdamping (ESI). Bij lage flowsnelheden — typisch onder 200 nL/min — ontstaat nanoESI: een stabiele spray van extreem kleine druppels. De ionisatie-efficiëntie neemt sterk toe bij kleinere druppelgrootte, waardoor de detectiegevoeligheid stijgt. Dit maakt nano-LC/MS en nano-LC/MS/MS de gouden standaard voor proteomicaonderzoek, waarbij duizenden eiwitten in een enkel experiment worden geïdentificeerd. Voor meer achtergrond over de detectiemethode, zie het artikel over diode-array-detectie.
Nano-LC wordt ingezet wanneer de hoeveelheid beschikbaar monster beperkt is, de gewenste detectiegevoeligheid uitzonderlijk hoog is of het monstertype (zoals een celextract of biopsiemateriaal) in zijn oorspronkelijke concentratie geanalyseerd moet worden. De voornaamste toepassingsgebieden zijn:
De stationairfase-chemie voor nano-LC is in grote lijnen gelijk aan die van standaard omgekeerde-fase HPLC: C18 en C8 gebonden silica zijn het meest gebruikt. Omdat de kolommen zo dun zijn, is de hoeveelheid stationair-fasemateriaal minimaal, wat snelle massa-overdracht bevordert. Belangrijke kolomvarianten zijn:
Voor de reiniging en opconcentrering van monsters vóór de nano-LC-analyse wordt ook solid-phase-extractie (SPE) ingezet. SPE vermindert de matrixcomplexiteit en verhoogt de herhaalbaarheid, met name bij biologische en omgevingsmonsters.
Nano-LC stelt hoge eisen aan het laboratorium. Enkele kritische punten:
Bezoekers zoeken bij dit onderwerp regelmatig op de volgende vragen. Hieronder een beknopt antwoord op elk.
Vloeistofchromatografie is een scheidingstechniek waarbij een vloeibare mobiele fase een mengsel van stoffen door een kolom met vaste of gebonden vloeibare stationaire fase transporteert. Stoffen worden gescheiden op basis van hun relatieve affiniteit voor beide fasen. Nano-LC is een miniatuurvorm van deze techniek.
In de chromatografische context verwijst "capillair" niet naar capillaire aanzuiging (zoals bij een dun glazen buisje), maar naar de inwendige diameter van de kolom: een capillaire kolom heeft een ID van minder dan 1 mm. De kleine diameter vermindert piekverbreding door wand-effecten en verlaagt het dode volume drastisch, wat direct bijdraagt aan hogere gevoeligheid en betere plaatnummers.
Standaard HPLC is toegankelijk voor laboranten met een basisopleiding analytische chemie. Nano-LC vraagt aanvullende kennis van kolomonderhoud, low-dead-volume verbindingen en massaspectrometrische detectie. Praktijkervaring met het opsporen van lekkages en verstoppingen in capillairen is essentieel.
Het principe is gelijk aan dat van alle vloeistofchromatografie: verdeling van analyt-moleculen tussen mobiele en stationaire fase. Het onderscheidende kenmerk is de miniaturisatie: door de kolom-ID te verkleinen daalt het elutie-volume evenredig met het kwadraat van de diameter, waardoor de concentratie van de analyt in de detector stijgt en de gevoeligheid toeneemt.
Nano-LC is nauw verwant aan andere vloeistofchromatografische technieken die Labvakhandel behandelt in de kennisbank. De onderliggende scheidingsprincipes zijn hetzelfde; het zijn de schaal en de toepassing die verschillen:
Labvakhandel levert verbruiksmaterialen en accessoires voor vloeistofchromatografie, waaronder capillaire kolommen, fittingen met laag dood volume en monstervoorbereidingsproducten zoals SPE-cartridges. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw nano-LC-opstelling, of bekijk het assortiment HPLC-benodigdheden in onze webshop.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
