Nano-LC — ook geschreven als nano-vloeistofchromatografie of capillaire vloeistofchromatografie — is een variant van HPLC waarbij extreem dunne kolommen en flowsnelheden van slechts nanoliters per minuut worden gebruikt. Het resultaat is een drastisch hogere gevoeligheid, een sterk verminderd monsterverbruik en een uitstekende koppeling met massaspectrometrische detectie. Dit artikel legt uit hoe nano-LC werkt, welke componenten een rol spelen en in welke toepassingen de techniek onmisbaar is.
Bij conventionele HPLC stroomt de mobiele fase door een kolom met een inwendige diameter van 2,1 tot 4,6 mm, bij flowsnelheden van 0,2 tot 2 mL/min. Nano-LC gebruikt kolommen met een inwendige diameter van 10 tot 100 µm en flowsnelheden van 10 tot 1000 nL/min — drie tot vijf ordes lager. Die verkleining heeft een diepgaand effect: doordat analyt-moleculen in een kleinere vloeistofhoeveelheid blijven geconcentreerd, stijgt de piekconcentratie en daarmee de gevoeligheid bij elektrosprayverdamping (ESI) tot wel 1000 maal ten opzichte van standaard-HPLC.
De term capillaire vloeistofchromatografie (capillary LC) wordt soms gebruikt voor het bredere bereik van 0,1 tot 0,5 mm kolomdiameter (met flows van 1–10 µL/min), terwijl nano-LC strikt genomen de kolommen onder 100 µm ID aanduidt. In de praktijk worden beide termen regelmatig door elkaar gebruikt.
De onderstaande figuur toont de belangrijkste schaalverschillen tussen de vier technieken.
De vermindering van de kolomdiameter heeft twee directe voordelen. Ten eerste wordt het benodigde monstervolume kleiner: waar een HPLC-injectie 1–20 µL bedraagt, volstaan bij nano-LC injecties van 1–500 nL. Ten tweede neemt het solventverbruik sterk af, wat zowel de laboratoriumkosten als de afvalstroom verlaagt.
Het scheidingsprincipe is identiek aan dat van standaard vloeistofchromatografie: analyt-moleculen wisselen reversibel uit tussen de mobiele fase (vloeistof) en de stationaire fase (kolomvulling). Componenten met een grotere affiniteit voor de stationaire fase elueren later. Wat verschilt, is de schaal van elk onderdeel.
De pomp moet nauwkeurig flows leveren in het nL/min-bereik. Dit vereist speciale zuigerpompen met een minimaal dood volume of een splitsysteem waarbij een conventionele pomp een hogere flow genereert die vóór de kolom wordt gesplitst. Pulsdempende systemen zijn essentieel: zelfs kleine flowvariaties verstoren het signaal bij massaspectrometrie. Sommige nano-LC-systemen werken met directe nanopompen zonder splitter (splitless), wat de kans op verlies van schaarse monsters vermindert.
Monstervolumes van 1 tot 500 nL worden ingebracht via een injectieklep met een nano-loop. Automatische injectie gebeurt met behulp van een autosampler die is aangepast voor kleine volumes. Het is cruciaal dat het dode volume tussen injectiepunt en kolomingang minimaal is om piekverbreding te voorkomen.
Veel nano-LC-opstellingen gebruiken een trapkolom (trapping column) vóór de eigenlijke analytische kolom. De trapkolom concentreert het monster en wast ongewenste matrixcomponenten weg. Na het laden wordt de trapkolom in lijn geschakeld met de analytische kolom en begint de gradiëntelutie. De analytische kolom heeft een lengte van 5 tot 50 cm en een ID van 10 tot 100 µm, gepakt met deeltjes van 1,7 tot 3 µm of gevuld met monolietmateriaal. De kolom-efficiëntie is hoog: plaatnummers van 50.000 tot 200.000 zijn haalbaar bij optimale omstandigheden.
Nano-LC is bij uitstek geschikt voor koppeling met massaspectrometrie via elektrosprayverdamping (ESI). Bij lage flowsnelheden — typisch onder 200 nL/min — ontstaat nanoESI: een stabiele spray van extreem kleine druppels. De ionisatie-efficiëntie neemt sterk toe bij kleinere druppelgrootte, waardoor de detectiegevoeligheid stijgt. Dit maakt nano-LC/MS en nano-LC/MS/MS de gouden standaard voor proteomicaonderzoek, waarbij duizenden eiwitten in een enkel experiment worden geïdentificeerd. Voor meer achtergrond over de detectiemethode, zie het artikel over diode-array-detectie.
Nano-LC wordt ingezet wanneer de hoeveelheid beschikbaar monster beperkt is, de gewenste detectiegevoeligheid uitzonderlijk hoog is of het monstertype (zoals een celextract of biopsiemateriaal) in zijn oorspronkelijke concentratie geanalyseerd moet worden. De voornaamste toepassingsgebieden zijn:
De stationairfase-chemie voor nano-LC is in grote lijnen gelijk aan die van standaard omgekeerde-fase HPLC: C18 en C8 gebonden silica zijn het meest gebruikt. Omdat de kolommen zo dun zijn, is de hoeveelheid stationair-fasemateriaal minimaal, wat snelle massa-overdracht bevordert. Belangrijke kolomvarianten zijn:
Voor de reiniging en opconcentrering van monsters vóór de nano-LC-analyse wordt ook solid-phase-extractie (SPE) ingezet. SPE vermindert de matrixcomplexiteit en verhoogt de herhaalbaarheid, met name bij biologische en omgevingsmonsters.
Nano-LC stelt hoge eisen aan het laboratorium. Enkele kritische punten:
Bezoekers zoeken bij dit onderwerp regelmatig op de volgende vragen. Hieronder een beknopt antwoord op elk.
Vloeistofchromatografie is een scheidingstechniek waarbij een vloeibare mobiele fase een mengsel van stoffen door een kolom met vaste of gebonden vloeibare stationaire fase transporteert. Stoffen worden gescheiden op basis van hun relatieve affiniteit voor beide fasen. Nano-LC is een miniatuurvorm van deze techniek; een uitgebreide beschrijving van de grondbeginselen vindt u in het artikel over vloeistofchromatografie.
Het fundamentele scheidingsprincipe is identiek: beide technieken scheiden verbindingen op basis van hun verdeling tussen een mobiele en een stationaire fase. Het verschil zit in de schaal. Bij nano-LC is de kolomdiameter 10 tot 100 µm en de flowsnelheid 10 tot 1000 nL/min, terwijl bij standaard HPLC diameters van 2,1 tot 4,6 mm en flows van 0,2 tot 2 mL/min worden gebruikt. Door die miniaturisatie concentreert nano-LC de analyt in een veel kleiner elutievolume, wat de detectiegevoeligheid — met name bij ESI-massaspectrometrie — met een factor tot 1000 kan verhogen. Nano-LC vraagt daarvoor wel meer aandacht voor dood volume, solventkwaliteit en gespecialiseerde pompen.
In de chromatografische context verwijst "capillair" niet naar capillaire aanzuiging (zoals bij een dun glazen buisje), maar naar de inwendige diameter van de kolom: een capillaire kolom heeft een ID van minder dan 1 mm. De kleine diameter vermindert piekverbreding door wand-effecten en verlaagt het dode volume drastisch, wat direct bijdraagt aan hogere gevoeligheid en betere plaatnummers.
Nano-LC wordt voornamelijk ingezet voor toepassingen waarbij schaars of kostbaar monstermateriaal zo gevoelig mogelijk geanalyseerd moet worden. De voornaamste gebieden zijn proteomics en eiwitidentificatie (gekoppeld aan ESI-massaspectrometrie), metabolomics, klinische biomarkeranalyse uit beperkt patiëntmateriaal, neurowetenschappelijk onderzoek met microdialyse-fracties en spooranalyse in omgevings- of farmaceutische monsters. De techniek is onmisbaar overal waar picogram- of femtogramgevoeligheid vereist is en monstervolumes in het nanoliterbereik liggen.
Standaard HPLC is toegankelijk voor laboranten met een basisopleiding analytische chemie. Nano-LC vraagt aanvullende kennis van kolomonderhoud, low-dead-volume verbindingen en massaspectrometrische detectie. Praktijkervaring met het opsporen van lekkages en verstoppingen in capillairen is essentieel.
Het principe is gelijk aan dat van alle vloeistofchromatografie: verdeling van analyt-moleculen tussen mobiele en stationaire fase. Het onderscheidende kenmerk is de miniaturisatie: door de kolom-ID te verkleinen daalt het elutie-volume evenredig met het kwadraat van de diameter, waardoor de concentratie van de analyt in de detector stijgt en de gevoeligheid toeneemt.
Een trapkolom (trapping column) is een korte voorzuil die vóór de eigenlijke analytische kolom wordt geplaatst. Het monster wordt eerst op de trapkolom geladen: de analyt-moleculen worden vastgehouden terwijl storende matrixcomponenten worden weggespoeld. Vervolgens wordt de trapkolom in lijn geschakeld met de analytische kolom en worden de analyt-moleculen met een gradiënt van de trap naar de analytische kolom overgebracht en gescheiden. Deze aanpak verhoogt de zuiverheid van het ingebrachte monster en beschermt de kostbare analytische kolom tegen vervuiling.
De belangrijkste voordelen ten opzichte van conventionele vloeistofchromatografie zijn: een tot 1000 maal hogere detectiegevoeligheid bij ESI-massaspectrometrie dankzij de concentrerende werking van het kleinere elutievolume, een drastisch lager monsterverbruik (injecties van 1–500 nL in plaats van 1–20 µL) en een sterk verminderd solventverbruik met bijbehorend lagere afvalkosten. Daarnaast maakt de lage flowsnelheid een stabiele nanoESI-spray mogelijk, wat de ionisatie-efficiëntie verder verbetert. Voor schaarse monsters — zoals biopsiemateriaal, microdialyse-fracties of gezuiverde eiwitfracties — is nano-LC vaak de enige techniek die voldoende gevoeligheid biedt.
Nano-LC stelt aanzienlijk hogere eisen aan apparatuur, materialen en gebruiker dan standaard HPLC. De voornaamste beperkingen zijn: een grotere gevoeligheid voor dood volume (elk niet-optimaal verbindingsstuk veroorzaakt merkbare piekverbreding), een lagere monsterbelastingscapaciteit (de kleine kolomdiameter raakt sneller verzadigd bij complexe matrices), een beperktere reproduceerbaarheid bij onvoldoende temperatuurbeheersing en een hogere kwetsbaarheid voor verstopping door deeltjes of neergeslagen eiwitten. De aanschafkosten van gespecialiseerde nanopompen, autosamplers en bijbehorende fittingen liggen bovendien aanzienlijk hoger dan voor een standaard HPLC-opstelling. Voor routinetoepassingen met grote monsteraantallen en voldoende beschikbaar materiaal is nano-LC doorgaans niet de meest efficiënte keuze.
Beide technieken werken bij hoge drukken (tot 1200–1500 bar) en maken gebruik van kleine deeltjesgrootten voor hoge kolom-efficiëntie, maar ze zijn geoptimaliseerd voor verschillende doelstellingen. UHPLC richt zich op snelheid en hoge doorvoer bij kolomdiameters van 1–2,1 mm en flowsnelheden van 0,1–0,6 mL/min; het monstervolume en de gevoeligheid zijn vergelijkbaar met standaard HPLC. Nano-LC daarentegen minimaliseert het elutievolume via een kolomdiameter van 10–100 µm en flows van 10–1000 nL/min, met als primair doel een maximale detectiegevoeligheid bij schaarse monsters en optimale koppeling met ESI-massaspectrometrie. UHPLC is geschikt voor routinelaboratoria met veel monsters; nano-LC is de voorkeurstechniek wanneer gevoeligheid en monsterminimalisatie doorslaggevend zijn.
Nano-LC is nauw verwant aan andere vloeistofchromatografische technieken die Labvakhandel behandelt in de kennisbank. De onderliggende scheidingsprincipes zijn hetzelfde; het zijn de schaal en de toepassing die verschillen:
Labvakhandel levert verbruiksmaterialen en accessoires voor vloeistofchromatografie, waaronder capillaire kolommen, fittingen met laag dood volume en monstervoorbereidingsproducten zoals SPE-cartridges. Neem contact op voor advies over de juiste materialen voor uw nano-LC-opstelling, of bekijk het assortiment HPLC-benodigdheden in onze webshop.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
