Vloeistofchromatografie (LC) is een analytische scheidingstechniek waarbij componenten uit een mengsel worden gescheiden op basis van hun wisselwerking met een vloeibare mobiele fase en een vaste stationaire fase. De techniek wordt breed toegepast in analytische laboratoria, de farmaceutische industrie, voedingsanalyse en milieubewaking.
Bij vloeistofchromatografie wordt een vloeibaar monster opgelost in een oplosmiddel — de mobiele fase — en vervolgens door een kolom gepompt die gevuld is met het kolommateriaal — de stationaire fase. Componenten in het monster interageren elk op een andere manier met de stationaire fase: stoffen die sterker worden vastgehouden, verlaten de kolom later dan stoffen die weinig interactie vertonen. Op deze manier worden de componenten in de tijd van elkaar gescheiden.
De naam vloeistofchromatografie verwijst naar de aard van de mobiele fase: bij LC is dat een vloeistof, in tegenstelling tot gaschromatografie waarbij een gas als mobiele fase fungeert. De term chromatografie zelf is afgeleid van de Griekse woorden voor kleur (chroma) en schrijven (graphein), naar de vroegste experimenten waarbij plantenpigmenten zichtbaar als gekleurde banden op een kolom werden gescheiden.
Een detector aan het uiteinde van de kolom registreert de elutie van elke component. Het resultaat is een chromatogram: een grafiek van het detectorsignaal als functie van de tijd, waaruit kwalitatieve en kwantitatieve informatie kan worden afgeleid.
Een LC-systeem bestaat doorgaans uit de volgende onderdelen:
De scheidingsefficiëntie wordt bepaald door de keuze van de stationaire fase, de samenstelling van de mobiele fase, de kolomtemperatuur en de stroomsnelheid. Door deze parameters te optimaliseren kan de scheiding worden afgestemd op de eigenschappen van het te analyseren mengsel.
De keuze van de detector is bepalend voor de gevoeligheid en selectiviteit van een LC-methode. De meest gebruikte detector in de routinelaboratoriumanalyse is de UV/Vis-detector, die absorptie van ultraviolet of zichtbaar licht door de component meet. Wanneer de verbindingen een chromofoor bevatten, biedt dit een eenvoudige en betrouwbare detectiemethode. De diode-array detector (DAD) is een uitbreiding hierop: in plaats van één vaste golflengte worden meerdere golflengten tegelijk gemeten, waardoor naast kwantificering ook een absorptiespectrum per piek beschikbaar is.
Voor fluorescerende verbindingen of stoffen die via derivatisering fluorescentie-actief worden gemaakt, is de fluorescentiedetector gevoeliger en selectiever dan UV. De geleidingsdetector wordt specifiek ingezet bij ionenchromatografie. De meest informatieve detector is de massaspectrometer: LC-MS combineert scheiding met structuuridentificatie op basis van massa-ladingsverhouding en is daarmee de standaard bij complexe matrices of spooranalyse.
De mobiele fase is het oplosmiddel of oplosmiddelenmengsel dat het monster door de kolom transporteert. Bij omgekeerde-fase LC bestaat de mobiele fase doorgaans uit water gecombineerd met een organisch oplosmiddel zoals acetonitril of methanol. De polariteit en samenstelling van de mobiele fase bepalen in hoge mate hoe sterk een component wordt vastgehouden door de stationaire fase en dus wanneer het de kolom verlaat.
Bij isocratische elutie blijft de samenstelling van de mobiele fase gedurende de gehele analyse constant. Bij gradiëntelutie wordt de verhouding van de oplosmiddelen tijdens de analyse geleidelijk gewijzigd — bijvoorbeeld door het aandeel organisch oplosmiddel te verhogen — waardoor ook sterk retentieve componenten binnen een aanvaardbare analysetijd van de kolom elueren. Gradiëntelutie is met name nuttig bij complexe mengsels met een breed bereik aan polariteiten.
De meest gebruikte oplosmiddelen voor de mobiele fase bij LC zijn water, acetonitril en methanol. Voor ionenchromatografie worden waterige bufferoplossingen met specifieke zuren of zouten ingezet. Bij normaalfase-LC worden apolaire oplosmiddelen zoals hexaan of dichloormethaan gebruikt. De keuze van het oplosmiddel is sterk afhankelijk van de scheidingsmodus en de eigenschappen van de te analyseren verbindingen.
Het onderscheid tussen isocratische elutie en gradiëntelutie is in de praktijk een van de eerste methodeontwikkelingskeuzes. Bij isocratische elutie is de mobiele fase gedurende de gehele analyse van constante samenstelling. Dit vereenvoudigt de apparatuur en de methodevalidatie, en is geschikt wanneer de te analyseren componenten een vergelijkbare retentie hebben en binnen een beperkt polariteitsbereik vallen.
Gradiëntelutie is de aangewezen aanpak bij complexe mengsels met sterk uiteenlopende polariteiten of retentietijden. Door de sterkte van de mobiele fase geleidelijk te verhogen — bij omgekeerde-fase LC door het organische gehalte op te voeren — elueren vroeg-eluterende pieken scherp en worden laat-eluterende componenten toch binnen een redelijke analysetijd van de kolom verwijderd. Een bijkomend voordeel is dat de kolom na de analyse teruggebracht wordt naar de beginomstandigheden voor de volgende injectie. Gradiëntelutie stelt hogere eisen aan de pompnauwkeurigheid en reproducibiliteit van de mengverhouding, maar is inmiddels standaard in de meeste moderne LC-systemen.
De stationaire fase is het kolomvulmateriaal waarmee de mobiele fase in contact komt. Het meest gebruikte basismateriaal is gesilicaniseerd silica, waarop functionele groepen zijn aangebracht die de scheidingseigenschappen bepalen. Bij omgekeerde-fase HPLC zijn dit apolaire alkylketens (C18, C8); bij normaalfase LC zijn het polaire groepen die hydrofiele interacties aangaan met het analytmolecuul. De deeltjesgrootte, poriediameter en oppervlaktechemie van de stationaire fase bepalen samen de retentie, resolutie en drukval van de kolom.
Een chromatogram toont het detectorsignaal (y-as) als functie van de retentietijd (x-as). Elke piek correspondeert met één component in het monster. De retentietijd — het tijdstip waarop de piek zijn maximum bereikt — is karakteristiek voor een verbinding onder de gekozen omstandigheden en wordt gebruikt voor kwalitatieve identificatie. De piekoppervlakte of pikhoogte is evenredig met de concentratie van de component en vormt de basis voor kwantitatieve bepaling.
Een goede scheiding kenmerkt zich door smalle, symmetrische pieken met voldoende resolutie tussen aangrenzende pieken. Resolutie is de mate waarin twee pieken van elkaar zijn gescheiden; een resolutiewaarde van 1,5 of hoger wordt als basislijnresolutie beschouwd, waarbij de pieken volledig zijn gescheiden. Pieksymmetrie — uitgedrukt als de piekasymmetriefactor — geeft aan of de piek ideaal Gaussisch van vorm is of een afwijking vertoont door overbelasting van de kolom of ongewenste interacties met de stationaire fase. Brede of asymmetrische pieken duiden op suboptimale kolomcondities of methodeproblemen die de kwantificeringnauwkeurigheid negatief beïnvloeden.
Vloeistofchromatografie is geschikt voor de analyse van een breed scala aan verbindingen, waaronder polaire moleculen, eiwitten, suikers, geneesmiddelen en milieuverontreinigingen. In tegenstelling tot gaschromatografie hoeven de te analyseren stoffen niet vluchtig te zijn, wat de toepasbaarheid aanzienlijk vergroot. De techniek levert zowel kwalitatieve informatie (identificatie van componenten aan de hand van retentietijden of massaspectra) als kwantitatieve informatie (bepaling van concentraties).
Kolomchromatografie en vloeistofchromatografie zijn nauw verwante begrippen, maar niet volledig synoniem. Kolomchromatografie is de bredere term voor elke chromatografische scheiding die in een kolom plaatsvindt — inclusief eenvoudige zwaartekrachtkolommen voor preparatieve zuivering. Vloeistofchromatografie verwijst specifiek naar systemen met een vloeibare mobiele fase en omvat zowel klassieke kolomchromatografie als de instrumentele varianten HPLC en UHPLC waarbij de mobiele fase onder druk wordt gepompt.
Onder de noemer vloeistofchromatografie vallen verschillende technieken die elk zijn aangepast aan specifieke toepassingen.
High Performance Liquid Chromatography (HPLC) is de meest gebruikte variant van vloeistofchromatografie in analytische laboratoria. Bij HPLC wordt de mobiele fase onder hoge druk door een kolom met fijn kolommateriaal (typisch 3–5 µm deeltjesgrootte) gepompt. Het resultaat zijn scherpere pieken, betere resolutie en kortere analysetijden vergeleken met klassieke kolomchromatografie bij atmosferische druk.
De hoge druk bij HPLC is een direct gevolg van de kleine deeltjesgrootte van het kolommateriaal. Fijner kolommateriaal biedt meer oppervlakte voor scheiding en kortere diffusieafstanden, waardoor de scheidingsefficiëntie sterk toeneemt. Tegelijk biedt een dicht pakking van kleine deeltjes veel meer stromingsweerstand dan grof materiaal. Om de mobiele fase met een bruikbare en reproduceerbare stroomsnelheid door het kolombed te transporteren, is een druk van doorgaans 50–400 bar vereist. Zonder deze druk zou de doorlooptijd onacceptabel lang worden of de stroomsnelheid oncontroleerbaar variëren. De hogere druk is dus niet een doel op zich, maar een technische noodzaak die onlosmakelijk verbonden is met de kleinere deeltjes die de hogere scheidingsefficiëntie mogelijk maken.
De term LC (liquid chromatography) is de overkoepelende aanduiding voor alle vormen van vloeistofchromatografie, inclusief eenvoudige zwaartekrachtkolommen. HPLC is een specifieke instrumentele variant waarbij de mobiele fase onder verhoogde druk door een kolom met fijn kolommateriaal wordt gepompt. In de praktijk wordt de term LC in laboratoriumcontext vaak gebruikt als synoniem voor HPLC, omdat de meeste moderne systemen op druk gebaseerd zijn. Het wezenlijke onderscheid zit in de deeltjesgrootte van het kolommateriaal en de benodigde druk: klassieke kolomchromatografie werkt bij atmosferische druk met grof materiaal (50–150 µm), terwijl HPLC met 3–5 µm deeltjes en drukken tot 400 bar werkt. Dit levert bij HPLC een veel hogere scheidingsefficiëntie, betere reproduceerbaarheid en kortere analysetijden op.
HPLC wordt ingezet voor kwaliteitscontrole van farmaceutische producten, analyse van voedingscomponenten, meting van milieuverontreinigingen en onderzoek naar biologische moleculen. Reversed-phase HPLC, waarbij een apolaire stationaire fase wordt gecombineerd met een polaire mobiele fase, is de meest toegepaste configuratie.
Lees meer over het principe, de opbouw en de toepassingen in het artikel over HPLC.
Ultra High Performance Liquid Chromatography (UHPLC) werkt met nog kleinere deeltjesgroottes (sub-2 µm) en hogere systeemdrukken (tot 1000–1500 bar). Dit levert kortere analysetijden, hogere piekresolutie en lager oplosmiddelverbruik op. UHPLC stelt hogere eisen aan de apparatuur maar is inmiddels een standaard techniek in routinematige analytische omgevingen waar snelheid en doorvoer belangrijk zijn.
De vraag of HPLC of UHPLC de betere keuze is, hangt af van de toepassing. UHPLC biedt een duidelijk voordeel in snelheid en gevoeligheid bij complexe mengsels en hoge monsteraantallen. Voor minder complexe analyses of wanneer bestaande HPLC-methoden gevalideerd zijn en niet herschreven mogen worden, blijft HPLC een volwaardige en kosteneffectievere oplossing. Veel moderne laboratoria gebruiken beide platforms naast elkaar.
Bij normaalfase-LC is de stationaire fase polair (bijv. kiezelgel) en de mobiele fase apolair. Sterk polaire verbindingen worden langer vastgehouden en elueren als laatste. Bij de veel vaker toegepaste omgekeerde-fase-LC (reversed-phase LC) is de verhouding omgekeerd: een apolaire stationaire fase (bijv. C18-gebonden silica) combineert met een waterige, polaire mobiele fase. Apolaire verbindingen worden hier het sterkst vastgehouden. De keuze tussen beide modi wordt bepaald door de polariteit van de doelcomponenten en de matrix.
Hydrofiele interactiechromatografie (HILIC) is een variant waarbij sterk polaire en hydrofiele verbindingen — zoals aminozuren, nucleotiden en suikers — worden gescheiden op een polaire stationaire fase met een overwegend organische mobiele fase. HILIC vult omgekeerde-fase LC aan voor componenten die op een C18-kolom nauwelijks retentie vertonen. De techniek is ook goed compatibel met electrospray-ionisatie, wat de koppeling met massaspectrometrie vergemakkelijkt.
De koppeling van vloeistofchromatografie met massaspectrometrie (LC-MS en LC-MS/MS) combineert de scheidingskracht van LC met de gevoeligheid en structuurinformatie van de massaspectrometer. Na scheiding op de kolom worden componenten geïoniseerd — doorgaans via electrospray-ionisatie (ESI) — en vervolgens gedetecteerd op basis van hun massa-ladingsverhouding. LC-MS is de methode bij uitstek voor de kwantificering van geneesmiddelen en metabolieten in biologische matrices, pesticiden in voedsel en micropollutanten in water.
Ionenchromatografie (IC) is een variant waarbij anionen en kationen worden gescheiden op basis van ionenwisselaarinteracties met de stationaire fase. De techniek is bij uitstek geschikt voor de bepaling van anorganische ionen zoals chloride, nitraat, sulfaat en fosfaat in water, voeding en industriële monsters. Een suppressormodule onderdrukt de achtergrondgeleiding van de mobiele fase, waardoor de gevoeligheid van de geleidingsdetector wordt vergroot.
Meer over het principe en de toepassingen is te lezen in het artikel over ionenchromatografie.
Bij Size Exclusion Chromatography (SEC), ook wel Gel Permeation Chromatography (GPC) genoemd, worden moleculen gescheiden op basis van hun hydrodynamische volume. Grotere moleculen worden uitgesloten van de poriën van het kolommateriaal en elueren eerder; kleinere moleculen dringen de poriën in en elueren later. SEC wordt veel gebruikt voor de karakterisering van polymeren en eiwitten.
Voor karakterisering van macromoleculen en nanodeeltjes buiten het SEC-bereik — met name subzichtbare aggregaten van 50 nm tot meer dan 1 µm en virusachtige deeltjes — is de kolomloze veld-vloeistoffractionering (FFF/AF4) de orthogonale aanvulling op SEC/GPC.
Bij affiniteitschromatografie berust de scheiding niet op chemische of fysische eigenschappen van het molecuul, maar op een biospecifieke interactie tussen het doelmolecuul en een immobiele ligand — vergelijkbaar met de sleutel-slot-relatie van een enzym en zijn substraat. Dit is het meest selectieve chromatografische mechanisme en wordt breed ingezet voor de zuivering van eiwitten, antilichamen en nucleïnezuren.
Bij chirale chromatografie worden enantiomeren — moleculen die elkaars spiegelbeeld zijn maar identieke fysische eigenschappen bezitten — van elkaar gescheiden met een chirale stationaire fase (CSP). De scheiding berust op stereospecifieke interacties tussen het analytmolecuul en de chirale selector, waardoor het ene enantiomeer sterker wordt vastgehouden dan het andere. Polysaccharide-derivaten (cellulose, amylose), cyclodextrines en macrocyclische antibiotica zijn de meest gebruikte selectoren. Chirale LC is onmisbaar in de farmaceutische industrie voor bepaling van de enantiomere overmaat (ee) bij chirale werkzame stoffen.
Vloeistofchromatografie kan worden ingezet voor twee fundamenteel verschillende doelen. Bij analytische LC is het doel het identificeren en kwantificeren van componenten in een monster; de hoeveelheid geïnjecteerd materiaal is klein en de kolom is niet gericht op opbrengst. Bij preparatieve LC is het doel het isoleren en zuiveren van een doelcomponent in voldoende hoeveelheid voor vervolgonderzoek of productie. Preparatieve systemen werken met bredere kolommen, hogere monsterbelasting en zijn geoptimaliseerd voor maximale opbrengst en zuiverheid in plaats van resolutie.
Bij gaschromatografie (GC) is de mobiele fase een inert gas en moeten de te analyseren componenten vluchtig zijn of vluchtig gemaakt worden. Vloeistofchromatografie werkt met een vloeibare mobiele fase en is daardoor toepasbaar op niet-vluchtige, thermisch labiele of polaire verbindingen die niet geschikt zijn voor GC. De keuze tussen LC en GC hangt af van de eigenschappen van de te analyseren matrix en de doelcomponenten. GC biedt een hogere scheidingsefficiëntie voor vluchtige organische verbindingen en is doorgaans sneller en goedkoper voor dergelijke analyses. LC is de aangewezen methode voor grote, polaire of ionische moleculen zoals geneesmiddelen, eiwitten, suikers en anorganische ionen die bij de hoge temperaturen van GC niet stabiel zijn. In veel laboratoria worden beide technieken naast elkaar ingezet, elk voor de toepassingen waarvoor ze het meest geschikt zijn.
Een goede monstervoorbereiding is een kritische stap in elke LC-analyse en heeft direct invloed op de nauwkeurigheid van de resultaten en de levensduur van de kolom. De basisvereiste is dat het monster voldoende opgelost is in een oplosmiddel dat compatibel is met de mobiele fase, en dat deeltjes en matrix-interferenten zoveel mogelijk zijn verwijderd.
Filtratie is de meest gebruikte voorbewerkingsstap: door het monster te filtreren via een spuitfilter met een poriegrootte van 0,2 of 0,45 µm worden vaste deeltjes verwijderd die de kolom zouden verstoppen. Ook de mobiele fase zelf wordt voor gebruik gefilterd en ontgast om luchtbellen in het systeem te voorkomen. Bij complexere matrices — zoals plasma, voedingsextracten of milieumonsters — zijn aanvullende bewerkingsstappen nodig, zoals eiwitprecipitatie, vloeistof-vloeistof-extractie of vaste-fase-extractie (SPE), om storende matrixcomponenten te verwijderen voordat het monster wordt geïnjecteerd. Een zorgvuldig voorbereide monsteroplossing verbetert de piekvormen, verhoogt de reproduceerbaarheid en verlengt de gebruiksduur van kolom en apparatuur.
Een klassiek voorbeeld van vloeistofchromatografie is de bepaling van de zuiverheid van een geneesmiddel zoals paracetamol in een tablet. Met reversed-phase HPLC wordt de werkzame stof gescheiden van hulpstoffen en mogelijke afbraakproducten; de concentratie wordt kwantitatief bepaald aan de hand van de piekoppervlakte in het chromatogram. Een tweede veelgebruikt voorbeeld is de analyse van pesticiden in drinkwater of oppervlaktewater via LC-MS: zelfs bij concentraties in het nanogramgebied per liter kunnen tientallen pesticiden in één analyse worden geïdentificeerd en gekwantificeerd. In de biochemie is de zuivering van een antilichaam via affiniteitschromatografie een direct voorbeeld: het doelmolecuul bindt selectief aan een immobiele ligand en wordt na wassen met een elutie-buffer in hoge zuiverheid van de kolom geëlueerd.
Vloeistofchromatografie wordt toegepast in uiteenlopende sectoren:
Voor het uitvoeren van vloeistofchromatografische analyses zijn naast het LC-systeem zelf diverse verbruiksartikelen nodig: chromatografievials voor monsteropslag en -injectie, zepkappen (septa), filtratiemembranen en spuitfilters voor monstervoorbereiding en mobiele-fasefiltratie. Een goede monstervoorbereiding is essentieel voor betrouwbare resultaten en een lange levensduur van de kolom.
Bekijk het assortiment chromatografievials en toebehoren in de webshop van Labvakhandel, of neem contact op voor advies bij de keuze van de juiste apparatuur en verbruiksartikelen voor uw toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
