Omgekeerde-fase HPLC — in het Engels reversed-phase HPLC, afgekort RP-HPLC — is de meest gebruikte variant van hogedruk vloeistofchromatografie. In de meeste analytische laboratoria is RP-HPLC de standaardmethode voor de scheiding en kwantificering van kleine organische moleculen, farmaceutica, peptiden en vele andere verbindingen. De naam "omgekeerde fase" verwijst naar de omkering van de polariteitsverdeling ten opzichte van klassieke normale-fase chromatografie: bij RP-HPLC is de stationaire fase apolairder dan de mobiele fase.
Dit artikel behandelt het principe van omgekeerde-fase chromatografie, de rol van de stationaire en mobiele fase, de betekenis van polariteit en retentietijd, en de praktische toepassing ervan. Voor een bredere inleiding op HPLC als techniek verwijzen wij naar ons artikel over HPLC; voor een overzicht van vloeistofchromatografie in het algemeen zie ons artikel over vloeistofchromatografie.
In de chromatografie onderscheiden we altijd twee fasen: een stationaire fase die in de kolom is aangebracht en stilstaat, en een mobiele fase die door de kolom stroomt en de te scheiden componenten meevoert. De polariteitsverhouding tussen deze twee fasen bepaalt welke stoffen worden geretineerd en welke snel doorlopen.
Bij normale-fase chromatografie (NP-HPLC) is de stationaire fase polair (bijvoorbeeld silicagel) en de mobiele fase apolair (hexaan, heptaan of andere organische oplosmiddelen). Polaire verbindingen hechten sterk aan de polaire stationaire fase en elueren langzaam; apolaire verbindingen bewegen snel door.
Bij omgekeerde-fase chromatografie is dit precies omgedraaid: de stationaire fase is apolair en de mobiele fase is polair (water gemengd met een organisch oplosmiddel als methanol of acetonitril). Apolaire verbindingen hechten nu sterk aan de apolaire stationaire fase en worden geretineerd; polaire verbindingen lopen sneller door. Dit is de "omgekeerde" situatie ten opzichte van normale fase — vandaar de naam.
De stationaire fase in RP-HPLC bestaat uit silicageldeeltjes waarvan het oppervlak chemisch is gemodificeerd met apolaire alkylketens. Deze alkylketens worden via een silaniseringsreactie covalent gebonden aan de silanol-groepen (-Si-OH) van het silicageloppervlak. Het resultaat is een sterk hydrofobe, apolaire laag op het kolomvulmateriaal — de zogenoemde gebonden fase.
De meest gebruikte gebonden fasen zijn:
C18 (octadecylsilaan, ODS): de langste en meest hydrofobe alkylketen, met 18 koolstofatomen. C18 is de meest universele stationaire fase voor RP-HPLC en de standaardkeuze voor de scheiding van apolaire tot matig polaire verbindingen. De sterke hydrofobe interactie zorgt voor goede retentie van een breed spectrum aan verbindingen.
C8 (octylsilaan): kortere keten dan C18, iets minder hydrofobe interactie. C8 wordt toegepast wanneer een kortere retentietijd gewenst is of wanneer verbindingen op C18 te sterk worden geretineerd. Ook geschikt voor matig polaire verbindingen.
C4 (butylsilaan): nog kortere keten, beduidend minder hydrofobe interactie. C4 is bij uitstek geschikt voor grote biomoleculen zoals eiwitten en peptiden: deze worden op C18 of C8 te sterk geretineerd en kunnen dan moeilijk elueren zonder te denatureren. Op C4 is de interactie milder.
Phenyl: een aromatische gebonden fase die naast hydrofobe interacties ook π-π-interacties aangaat met aromatische verbindingen. Dit geeft een andere selectiviteit dan C18 en is nuttig wanneer C18 onvoldoende onderscheid geeft tussen structureel verwante aromatische stoffen.
CN (cyanopropyl): een matig polaire gebonden fase, bruikbaar in zowel normale-fase als omgekeerde-fase modus. CN geeft een andere selectiviteit dan C18 en wordt soms ingezet als alternatief bij complexe scheidingsproblemen.
Is C18 een stationaire fase? Ja — C18 is de meest gebruikte stationaire fase in RP-HPLC en verreweg de meest toegepaste fase in de moderne analytische chemie. De aanduiding C18 verwijst naar de 18 koolstofatomen van de gebonden alkylketen, niet naar het silicagelsubstraat zelf.
Een polaire stationaire fase is een vaste fase met een polair oppervlak: moleculen met vrije OH-groepen, NH-groepen of andere polaire functionele groepen die waterstofbruggen kunnen vormen of dipoolinteracties aangaan. Voorbeelden van polaire stationaire fasen zijn ongemodificeerd silicagel (-Si-OH), aluminiumoxide en aminopropyl-gebonden silicagel.
In een polaire stationaire fase worden polaire verbindingen sterker geretineerd dan apolaire. Dit is het principe van normale-fase chromatografie. Bij RP-HPLC is de stationaire fase juist niet polair maar apolair — een fundamenteel onderscheid.
De polariteit van de stationaire fase in HPLC bepaalt de selectiviteit van de scheiding: welke verbindingen van elkaar worden onderscheiden en in welke volgorde ze elueren. Het kiezen van de juiste stationaire fase is daarom een van de eerste beslissingen bij het ontwikkelen van een HPLC-methode.
Wat gebeurt er als de mobiele fase te polair is bij RP-HPLC? Dan neemt de elutiekracht toe: verbindingen worden minder sterk geretineerd door de apolaire stationaire fase en elueren sneller. Bij een te hoog percentage water (te polaire mobiele fase) kunnen hydrofobe verbindingen neerslaan of juist zo sterk worden geretineerd dat ze niet meer elueren. Een te hoog percentage organisch oplosmiddel (te apolair) maakt de mobiele fase te sterk en elueren alle verbindingen te snel, met weinig onderscheid.
De mobiele fase in RP-HPLC is altijd een waterige oplossing gemengd met een organisch oplosmiddel. De meest gebruikte organische modificatoren zijn:
Acetonitril (ACN): de meest toegepaste organische modifier. Acetonitril heeft een lage viscositeit, een lage UV-absorptie (compatibel met UV-detectie bij 210 nm en hoger) en een goede mengbaarheid met water. Het geeft scherpe pieken en is de standaardkeuze in de farmaceutische analyse.
Methanol (MeOH): goedkoper dan acetonitril en ook breed toepasbaar, maar heeft een hogere viscositeit waardoor de systeemdruk hoger kan worden. De elutiekracht van methanol is iets lager dan die van acetonitril bij gelijke volumefractie.
Tetrahydrofuraan (THF): een sterkere organische modifier, soms gebruikt als additief of in specifieke toepassingen. THF is brandbaar en absorbeert UV-licht bij lagere golflengten, wat de toepasbaarheid beperkt.
De verhouding water/organisch oplosmiddel bepaalt de elutiekracht van de mobiele fase: meer organisch oplosmiddel betekent een apolairder mobiele fase, sterkere competitie met de apolaire stationaire fase, en daardoor kortere retentietijden. Meer water maakt de mobiele fase polairder en verlegt de retentie in de richting van langere retentietijden voor apolaire verbindingen.
Is eluens hetzelfde als mobiele fase? Ja — het eluens is de vloeistof die door de kolom stroomt en de te scheiden componenten meevoert. In de HPLC-praktijk worden de termen mobiele fase en eluens door elkaar gebruikt. Formeel is "mobiele fase" de correcte chromatografische term; "eluens" is meer gangbaar in de laboratoriumtaal.
Het bereiden van een HPLC-mobiele fase vereist aandacht voor een aantal praktische aspecten:
Filtreerkwaliteit: gebruik uitsluitend HPLC-kwaliteitswater (ultrapuur water, tenzij anders gespecificeerd) en HPLC-kwaliteitssolvent. Verontreinigingen in de mobiele fase veroorzaken stoorsignalen (ghost peaks) in het chromatogram en kunnen de kolom beschadigen.
Ontgassen: opgeloste lucht in de mobiele fase kan luchtbellen veroorzaken in de pomp en detector, wat leidt tot een instabiele basislijn en onreproduceerbare resultaten. Ontgas de mobiele fase vóór gebruik door heliumsparging, sonicatie of gebruik van een inline degasser.
pH-instelling: veel verbindingen zijn zwakke zuren of basen en bestaan in gedeeltelijk geïoniseerde en niet-geïoniseerde vorm, afhankelijk van de pH. De pKa-waarde van de analyt bepaalt bij welke pH de beste retentie en piekvorming worden verkregen. Stel de pH in met een bufferoplossing (fosfaat, acetaat, formiaat) vóór het mengen met het organische oplosmiddel.
Bufferconcentratie: typisch 10–50 mM. Een te lage bufferconcentratie geeft onvoldoende pH-controle; een te hoge concentratie kan neerslaan bij hogere percentages organisch oplosmiddel of de kolom beschadigen.
Volgorde van mengen: voeg het organische oplosmiddel toe aan het waterige deel, niet andersom — zeker bij hoge percentages buffer. Dit voorkomt neerslaan van bufferzouten.
Polariteit is het centrale concept in alle chromatografie. Een molecule is polair als de lading ongelijk is verdeeld — door elektronegativiteitsverschillen tussen atomen ontstaan dipoolmomenten. Zuurstof, stikstof en fluor zijn sterk elektronegatief en trekken elektronen naar zich toe; koolstof en waterstof zijn minder elektronegatief. Een molecule met veel O-H- of N-H-groepen is daardoor sterk polair; een koolwaterstofketen zonder heteroatomen is apolair.
In chromatografie geldt de vuistregel like dissolves like: stoffen met vergelijkbare polariteit hebben affiniteit voor elkaar. Een apolaire stationaire fase retineert apolaire verbindingen sterker; een polaire stationaire fase retineert polaire verbindingen sterker.
De poolfase — ook wel aangeduid als de meer polaire fase in een tweefasensysteem — is in RP-HPLC de mobiele fase (het waterige mengsel). De niet-polaire fase is de apolaire gebonden alkylketen van de stationaire fase. De verdeling van een analyt over beide fasen bepaalt zijn retentietijd.
Welke rol speelt polariteit bij gaschromatografie? Bij GC is de stationaire fase een polymeerlaag in een capillaire kolom. Bij een apolaire GC-kolom elueren apolaire verbindingen vroeg (lage interactie met de stationaire fase); bij een polaire GC-kolom worden polaire verbindingen sterker geretineerd en elueren ze later. In het algemeen geldt: bij GC komen apolaire verbindingen bij een polaire kolom later vrij dan polaire verbindingen met een vergelijkbaar kookpunt.
RRT staat voor relative retention time — de relatieve retentietijd. In plaats van de absolute retentietijd van een component te rapporteren, wordt de verhouding uitgedrukt ten opzichte van de retentietijd van een referentieverbinding (de interne standaard of een bekende hoofdcomponent):
RRT = retentietijd component / retentietijd referentie
De RRT is nuttiger dan de absolute retentietijd omdat hij minder gevoelig is voor kleine variaties in de stroomsnelheid, kolomtemperatuur of samenstelling van de mobiele fase. Bij het identificeren van onbekende componenten of onzuiverheden in farmaceutische analyses wordt de RRT breed toegepast als identificatiecriterium naast het UV-spectrum of de massaspectrumdata.
Hoewel RP-HPLC oorspronkelijk is ontwikkeld voor kleine organische moleculen, wordt de techniek ook toegepast voor de analyse van peptiden, eiwitten en antilichamen. De uitdaging bij grote biomoleculen is dat ze gevoelig zijn voor denaturatie door de organische oplosmiddelen in de mobiele fase en door de hydrofobe interactie met de stationaire fase.
Voor eiwitanalyse via RP-HPLC worden daarom specifieke kolommen ingezet: C4- en C8-kolommen met een wijder poriënvolume (300 Å of groter, tegenover 80–120 Å voor kleine moleculen) zodat grote eiwtmoleculen de poriën kunnen bereiken. De gradiënt wordt zorgvuldig geoptimaliseerd: een langzame, lineaire gradiënt van water naar acetonitril (met 0,1% trifluorazijnzuur als ion-paarreagens en voor betere piekvorming) geeft de beste resultaten.
Voor antilichamen (IgG, circa 150 kDa) is RP-HPLC echter een agressieve methode die leidt tot denaturatie. In de biotechnologische industrie worden voor antilichaamanalyse vaker andere HPLC-technieken ingezet, zoals hydrofobe interactiechromatografie (HIC) of grootte-exclusiechromatografie. Zie ons artikel over grootte-exclusiechromatografie (SEC / GPC) voor meer informatie.
De S-fase — ook wel de stationaire fase of vaste fase — verwijst in HPLC naar de gebonden fase op het kolommateriaal. In RP-HPLC is dit de apolaire alkylketen (C18, C8, C4 of een andere gebonden fase) op het silicagelsubstraat. Wat er in de S-fase gebeurt: apolaire verbindingen dringen door in de alkylketen via hydrofobe interacties en verblijven daar totdat de mobiele fase sterk genoeg is geworden om ze los te maken en verder te transporteren. Dit verblijf in de stationaire fase is precies wat de retentie veroorzaakt en de scheiding mogelijk maakt.
De retentietijd (tR) is de tijd die een component nodig heeft om vanaf het moment van injectie de kolom te verlaten en de detector te bereiken. De retentietijd is karakteristiek voor een verbinding onder vaste omstandigheden (kolom, mobiele fase, temperatuur, stroomsnelheid) en wordt gebruikt voor identificatie.
De dode tijd (t₀, ook holtetijd of void time) is de tijd die een niet-retinerende verbinding — een stof die geen affiniteit heeft voor de stationaire fase — nodig heeft om de kolom te passeren. De dode tijd weerspiegelt het volume van de mobiele fase in de kolom (holte-volume). Elke verbinding die wél met de stationaire fase wisselwerkt, heeft een retentietijd groter dan de dode tijd.
De gecorrigeerde retentietijd (t'R = tR − t₀) en de retentiefactor (k = t'R / t₀) zijn parameters die onafhankelijk zijn van de stroomsnelheid en de kolomlengte, en daardoor beter vergelijkbaar tussen verschillende systemen. Een retentiefactor k tussen 1 en 10 is ideaal voor de meeste analytische scheidingen: de verbinding wordt voldoende geretineerd voor een goede scheiding, maar eluert niet zo laat dat de piek te breed wordt.
Het belangrijkste voordeel van RP-HPLC ten opzichte van andere chromatografietechnieken is de combinatie van brede toepasbaarheid, hoge reproduceerbaarheid en eenvoudige methodeontwikkeling. Waterige mobiele fasen zijn compatibel met UV-detectie, massaspectrometrie en fluorescentiedetectie. De meeste farmaceutische werkzame stoffen en metabolieten zijn matig polair en scheiden uitstekend op C18. Kolomequilibratie na gradiëntprogramma's verloopt snel dankzij de goede menging van water en acetonitril. Bovendien zijn C18-kolommen van hoge kwaliteit breed beschikbaar en goed gekarakteriseerd, wat methodeoverdracht tussen laboratoria vergemakkelijkt.
Ten opzichte van normale-fase HPLC biedt RP-HPLC het voordeel dat waterige monsters direct kunnen worden geïnjecteerd zonder voorbewerking, en dat de mobiele fasen minder toxisch en ontvlambaar zijn dan de apolaire oplosmiddelen die bij NP-HPLC worden gebruikt.
De keuze van de stationaire fase hangt af van de polariteit van de te scheiden verbindingen, de gewenste selectiviteit en de compatibiliteit met de mobiele fase. Een praktische aanpak:
Begin met C18 als universele startkolom voor matig polaire tot apolaire verbindingen in een waterige matrix. Als de retentie te hoog is (verbindingen elueren te laat of niet), schakel over naar C8 of een kortere keten. Als de selectiviteit onvoldoende is — twee verbindingen elueren te dicht op elkaar — overweeg dan een phenyl- of CN-kolom die andere interactiemechanismen aanbiedt. Voor grote biomoleculen (eiwitten, peptiden) kiest u C4 met een brede porie van 300 Å.
Voor sterk polaire verbindingen die op C18 niet of nauwelijks worden geretineerd, is RP-HPLC niet de meest geschikte techniek. Overweeg in dat geval HILIC (hydrofiele interactiechromatografie) of ionenchromatografie. Zie ons artikel over ionenchromatografie voor de scheiding van ionen en sterk polaire verbindingen.
Wilt u advies over de juiste HPLC-kolom of mobiele fase voor uw toepassing? Neem contact op met onze specialisten.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
