Proteomics is de grootschalige studie van eiwitten — het complete set van eiwitten dat een cel, weefsel of organisme op een bepaald moment tot expressie brengt, het zogenoemde proteoom. Waar genomics de blauwdruk van het leven in kaart brengt, beschrijft proteomics de werkelijke functionele uitvoering ervan: welke eiwitten worden gemaakt, in welke hoeveelheden, in welke gemodificeerde vormen, en hoe verandert dat patroon bij ziekte, ouderdom, stress of behandeling. Twee-dimensionale polyacrylamide-gelelektroforese (2D-PAGE of 2-DE) is de klassieke scheidingsmethode binnen de proteomics: in één gel worden honderden tot duizenden eiwitten gescheiden op twee orthogonale eigenschappen — isoëlektrisch punt en moleculair gewicht — wat een uniek "vingerafdruk-patroon" van het proteoom oplevert. In dit artikel leest u wat proteomics is, hoe 2D-PAGE werkt, welke kleuringen en detectiemethoden er zijn, hoe de koppeling met massaspectrometrie verloopt, en welke moderne ontwikkelingen (DIGE, gel-vrije proteomics) er bestaan.
Proteomics is het onderzoeksveld dat zich richt op de identificatie, kwantificering en functionele karakterisering van alle eiwitten in een biologisch systeem. De term werd in 1995 gemunt door Marc Wilkins als analoog aan "genomics", en sindsdien uitgegroeid tot een centraal onderdeel van de moleculaire levenswetenschappen. Het proteoom is fundamenteel complexer dan het genoom: een mens heeft circa 20.000 eiwit-coderende genen, maar door alternatieve splicing, post-translationele modificaties (fosforylering, glycosylering, ubiquitinering en vele andere) ontstaan er miljoenen verschillende eiwitvormen, proteoforms genoemd.
Proteomics omvat meerdere subdisciplines:
De twee technologische pijlers van moderne proteomics zijn scheidingstechnieken — waarvan 2D-PAGE de oudste en visueel meest informatieve is — en massaspectrometrie voor identificatie en kwantificering.
2D-PAGE staat voor two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis en is een scheidingstechniek waarbij eiwitten in twee opeenvolgende stappen op twee verschillende eigenschappen worden gescheiden. De techniek werd in 1975 onafhankelijk gepubliceerd door Patrick H. O'Farrell en door Joachim Klose. O'Farrell wist op één gel meer dan duizend eiwitten van Escherichia coli als afzonderlijke vlekken (spots) zichtbaar te maken — een doorbraak die de basis legde voor de hedendaagse proteomics.
Het principe berust op de combinatie van twee orthogonale scheidingsmechanismen:
Doordat de twee criteria onderling onafhankelijk zijn, vormen eiwitten met dezelfde pI maar verschillend gewicht (of omgekeerd) afzonderlijke vlekken op de gel. Een typische 2D-gel toont 1000–2500 eiwit-spots in een patroon dat karakteristiek is voor het onderzochte monster.
Bij isoëlektrische focusing wordt het eiwitmengsel aangebracht op een strip die een immobilized pH-gradient (IPG-strip) bevat — een polyacrylamide-strip waarin tijdens fabricage een gradient van zwakke zuren en basen is verankerd, doorgaans van pH 3 aan de anode-zijde tot pH 10 aan de kathode-zijde. Onder invloed van een aangelegde spanning migreren de eiwitten door de gradient. Een eiwit met netto positieve lading beweegt richting de kathode (basisch); een negatief geladen eiwit richting de anode (zuur). Op het punt waar de pH gelijk is aan het isoëlektrisch punt van het eiwit, draagt het eiwit netto geen lading en stopt de migratie. Op deze manier "focusseren" alle eiwitten met dezelfde pI in een scherpe band op één plek in de strip.
IPG-strips waren een grote verbetering ten opzichte van de oorspronkelijke IEF-methode met vrije ampholiet-buffers in glasbuisjes, omdat de gradient stabiel is gefixeerd in de gel-matrix. Hierdoor verdween de zogeheten cathodic drift en werd 2D-PAGE veel reproduceerbaarder. IPG-strips zijn commercieel verkrijgbaar in verschillende pH-bereiken:
IEF duurt typisch 6–24 uur en wordt vaak uitgedrukt in volt-uren — een maat voor de totale elektrische arbeid die in het systeem is gestopt. Voor een goede focusering zijn typisch 30.000–100.000 V·h nodig.
Na IEF wordt de IPG-strip eerst geëquilibreerd met SDS (natriumdodecylsulfaat) en een reductor (DTT of TCEP), waarna alkylering plaatsvindt met iodoacetamide. SDS is een anionisch detergent dat zich proportioneel aan de lengte van het eiwit aan het peptide-skelet bindt. Het gevolg is dat alle eiwitten een uniforme negatieve lading-per-massa-verhouding krijgen, en hun oorspronkelijke pI verdwijnt; ze migreren in een elektrisch veld uitsluitend op basis van grootte. De equilibratiestap is cruciaal — eiwitten die niet goed met SDS zijn gecoat zullen onvolledig in de tweede dimensie scheiden. Tegelijkertijd zorgt deze stap voor enig eiwitverlies (5–25 %), wat een bekende bron van variabiliteit tussen gels is.
De geëquilibreerde IPG-strip wordt vervolgens op de bovenkant van een SDS-polyacrylamide-gel geplaatst en met een agarose-laag verzegeld. Onder invloed van een hoge spanning migreren de eiwitten loodrecht op de strip de gel in. Kleine eiwitten bewegen sneller door de polymeer-matrix dan grote, met als resultaat dat na elektroforese alle eiwitten verspreid liggen in een 2D-patroon: horizontaal gerangschikt op pI (van zuur links naar basisch rechts), verticaal op moleculair gewicht (groot bovenaan, klein onderaan).
Het percentage acrylamide in de gel bepaalt het effectieve scheidingsbereik:
Na elektroforese zijn de eiwitten in de gel onzichtbaar en moeten ze met een kleuring of label zichtbaar worden gemaakt. De keuze hangt af van het benodigde detectielimiet, kosten, downstream-compatibiliteit met massaspectrometrie en de noodzaak tot kwantificering.
De gekleurde gel wordt gescand of gefotografeerd met een gespecialiseerd densitometrisch systeem, waarna beeldanalysesoftware (PDQuest, Progenesis, Delta2D, Melanie) de spots automatisch detecteert, kwantificeert en vergelijkt tussen gels.
Een belangrijke verbetering op klassieke 2D-PAGE is 2D-DIGE (Differential In-Gel Electrophoresis), in 1997 geïntroduceerd door Unlü en collega's. Bij DIGE worden twee of drie monsters vooraf gelabeld met spectrale verschillende fluorescente cyanine-kleurstoffen (Cy2, Cy3, Cy5) en vervolgens in dezelfde gel gescheiden. Hierdoor verdwijnt de tussen-gel-variabiliteit volledig en kunnen verschillen tussen monsters met grote precisie worden bepaald. Vaak wordt een interne standaard (een mengsel van alle monsters gelabeld met Cy2) gebruikt om gels onderling te normaliseren.
Een gel-spot alleen vertelt nog niet om welk eiwit het gaat. Voor de identificatie wordt de spot uit de gel "gepicket" (handmatig of met een geautomatiseerde spot-picker), in stukjes gesneden, ontkleurd en in-gel verteerd met een protease — vrijwel altijd trypsine, dat eiwitten specifiek splitst aan de C-zijde van lysine en arginine. De resulterende peptiden worden geëxtraheerd en met massaspectrometrie geïdentificeerd:
Voor algemene informatie over de techniek zelf, zie het kennisbankartikel over massaspectrometrie.
Een typische 2D-PAGE-gebaseerde proteomics-studie verloopt in zes hoofdstappen:
De totale doorlooptijd bedraagt typisch drie tot vijf werkdagen voor een set van een handvol gels.
Een van de krachtigste toepassingen van 2D-PAGE is vergelijkende proteomics: hetzelfde proteoom analyseren onder twee of meer condities en de verschillen identificeren. Voorbeelden van zulke vergelijkingen zijn gezond versus ziek weefsel, behandeld versus onbehandeld, voor versus na een interventie, of verschillende ontwikkelingsstadia. De beeldanalyse software detecteert spots die in intensiteit verschillen (regulatie) of die in het ene monster wel en in het andere niet aanwezig zijn (presence/absence). Dergelijke "differentiële spots" zijn kandidaat-biomarkers en worden vervolgens via MS geïdentificeerd.
Statistisch significante verschillen worden bepaald met technieken als Student's t-test of ANOVA in combinatie met false-discovery-rate-correctie. Voor robuuste conclusies zijn gewoonlijk drie tot zes biologische replicaten per conditie nodig.
2D-PAGE blijft, ondanks de opkomst van gel-vrije technieken, om een aantal redenen relevant:
De belangrijkste beperkingen zijn:
Sinds circa 2000 heeft gel-vrije proteomics — ook wel shotgun-proteomics genoemd — een grote opmars gemaakt. Hierbij wordt het eiwitmonster eerst volledig getrypsineerd, vervolgens worden de resulterende peptiden gescheiden met (vaak meerdimensionale) vloeistofchromatografie en direct gemeten met LC-MS/MS. Voor de scheidingstechnieken zelf, zie de kennisbankartikelen over HPLC, nano-LC en LC-MS en LC-MS/MS.
Gel-vrije methoden zijn doorgaans sneller, hebben een hogere doorvoer en kunnen meer eiwitten identificeren in één analyse. Ze leveren echter geen "kaart" van intacte eiwitvormen op en zijn minder geschikt voor het direct vergelijken van proteoforms. In moderne laboratoria worden gel-gebaseerde en gel-vrije methoden vaak complementair ingezet — DIGE-2D-PAGE voor visuele proteoform-analyse, LC-MS/MS voor diepere coverage en kwantificering.
Andere recente ontwikkelingen zijn top-down proteomics, waarin intacte eiwitten direct worden gemeten zonder voorafgaande tryptische digestie, en data-independent acquisition (DIA, ook wel SWATH-MS) waarmee reproduceerbare kwantificering over honderden monsters mogelijk is.
Proteomics en 2D-PAGE zijn breed inzetbaar:
Voor reproduceerbare 2D-PAGE-resultaten zijn enkele praktische punten cruciaal. De monstervoorbereiding bepaalt voor een groot deel het eindresultaat: onvolledige eiwitoplossing leidt tot streaking, vervuiling met zouten verstoort de IEF, en proteolytische afbraak veroorzaakt artefactspots. Werk altijd op ijs met verse protease-remmers, gebruik ultrazuiver water voor alle buffers, en pas een effectieve cleanup-stap toe vóór de IEF. Voor poederreagentia zijn de zuiverheidsgraad en herkomst belangrijk — voor het juiste niveau van zuiverheid, zie zuiverheidsgraden van chemicaliën. Voor opslag en veilig werken met denatureringsmiddelen als ureum, thio-ureum, DTT en acrylamide raadpleegt u het veiligheidsinformatieblad (VIB) van de betreffende stof.
Acrylamide is in monomere vorm een neurotoxine en mogelijk carcinogeen — werk altijd met handschoenen en bij voorkeur met kant-en-klare gels of voorgegoten oplossingen. Voor het bijbehorende glaswerk en kunststof artikelen — gel-platen, micropipetten, scheidingsbuffers — kunt u terecht in onze categorieën glaswerk en porselein en laboratoriumplastics.
Proteomics raakt aan tal van andere laboratoriumtechnieken. Voor de hoofdtechniek voor eiwit-identificatie, zie massaspectrometrie. Voor de chromatografische voorbereiding van peptiden in gel-vrije workflows, zie HPLC, UHPLC, nano-LC en LC-MS en LC-MS/MS. Voor verwante analytische scheidingstechnieken zie capillaire elektroforese.
Neem contact op voor advies over reagentia, glaswerk en disposables die passen bij uw proteomics-toepassing.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
