Kolomchromatografie is een van de meest gebruikte scheidingstechnieken in het laboratorium. Bij klassieke kolomchromatografie — ook wel gravity column chromatography of open-kolomchromatografie genoemd — stroomt een vloeibaar oplosmiddel onder invloed van de zwaartekracht door een glazen kolom gevuld met een vaste stof. Componenten in een mengsel scheiden omdat ze zich in verschillende mate hechten aan die vaste stof. Het resultaat: zuivere fracties die u afzonderlijk opvangt en verder analyseert of gebruikt.
De techniek is eenvoudig op te zetten, vereist geen pompen of druk, en is geschikt voor zowel analytische doeleinden als preparatieve zuivering op gramschaal. Klassieke kolomchromatografie vormt daarmee de basis waarop modernere varianten zoals HPLC en vloeistofchromatografie zijn gebouwd. Verderop in dit artikel leest u ook hoe kolomchromatografie zich verhoudt tot andere chromatografische technieken zoals papierchromatografie, en wat begrippen als dode tijd en resolutie precies betekenen.
Het scheidingsprincipe van kolomchromatografie berust op de wisselwerking tussen twee fasen: de stationaire fase (het vulmateriaal in de kolom) en de mobiele fase (het oplosmiddel dat door de kolom stroomt). Componenten verdelen zich continu over beide fasen op basis van hun chemische affiniteit. Een stof die sterk aan de stationaire fase hecht, beweegt langzaam mee met de mobiele fase; een stof met weinig affiniteit passeert snel.
Dit evenwicht wordt beschreven door de distributieverhouding K: de verhouding van de concentratie van een stof in de stationaire fase ten opzichte van de mobiele fase. Hoe groter het verschil in K-waarden tussen twee componenten, hoe beter ze van elkaar te scheiden zijn.
Een klassieke chromatografiekolom bestaat uit een glazen buis met onderaan een kraantje of glazen filter (fritta). De kolom wordt gevuld met de stationaire fase, die op de fritta rust. Bovenaan brengt u het te scheiden mengsel aan, waarna u het eluens — het oplosmiddel of oplosmiddelgemengsel dat als mobiele fase dient — toevoegt. Door de zwaartekracht stroomt het eluens door de kolom en verlaat de kolom onderaan als efflux, die u in fracties opvangt.
De kolomdiameter en -hoogte bepalen de capaciteit en scheidingskracht. Een langere kolom geeft meer scheidingsplaten en daarmee een hogere resolutie, maar verlengt ook de looptijd. Voor preparatieve zuivering kiest u een bredere kolom; voor analytische doeleinden volstaat een smallere.
De keuze van de stationaire fase is bepalend voor de scheiding. De meest gebruikte materialen zijn:
Silicagel is veruit het meest toegepaste vulmateriaal. Het heeft een polair oppervlak met vrije silanol-groepen (-Si-OH) die polaire verbindingen sterk adsorberen. Silicagel is geschikt voor de scheiding van de meeste organische verbindingen en wordt standaard aangeboden in korrelmaten van 40–63 µm (voor normale chromatografie) tot 15–40 µm (voor flash-chromatografie).
Aluminiumoxide (Al₂O₃) is verkrijgbaar in zure, neutrale en basische uitvoering. Het is minder universeel dan silicagel, maar bijzonder geschikt voor verbindingen die op silicagel ontleden of te sterk adsorberen, zoals basische stikstofhoudende verbindingen.
Reversed-phase materialen zijn silicageldeeltjes waarvan het oppervlak chemisch is gemodificeerd met apolaire alkylketens. De meest gebruikte varianten zijn C18 (octadecyl, 18 koolstofatomen), C8 (octyl, 8 koolstofatomen) en C4 (butyl, 4 koolstofatomen). Hoe langer de keten, hoe meer hydrofoob het oppervlak en hoe sterker apolaire verbindingen worden geretineerd. C18 is de meest universele keuze voor apolaire tot matig polaire verbindingen; C8 wordt ingezet wanneer een iets kortere retentietijd gewenst is; C4 is met name geschikt voor grote biomoleculen zoals eiwitten en peptiden, die op C18 te sterk zouden adsorberen. Reversed-phase kolomchromatografie werkt met waterige oplosmiddelmengsels als mobiele fase.
Vóór gebruik moet een reversed-phase kolom worden geconditioneerd. Bij een C18-kolom in open-kolomformaat spoelt u de kolom eerst door met puur methanol of acetonitril om het droge sorbens te bevochtigen en luchtbellen te verwijderen. Daarna equilibreert u met het startmengsel van de mobiele fase — doorgaans een water/methanol- of water/acetonitrilmengsel in de gewenste startverhouding — totdat de kolom stabiel is. Sla deze stap niet over: een niet-geëquilibreerde kolom geeft onreproduceerbare retentietijden en slechte piekvormen. Bij SPE-cartridges met C18-sorbens geldt hetzelfde principe; meer daarover leest u in ons artikel over Solid Phase Extraction (SPE).
Ionenwisselaars (kationisch of anionisch) zijn stationaire fasen voor de scheiding op basis van lading. Ze worden ingezet in biochemische toepassingen voor de zuivering van eiwitten, aminozuren en nucleotiden.
Grootte-exclusiemateriaal (zoals Sephadex) scheidt op molecuulgrootte: kleinere moleculen dringen dieper in de poriën en elueren later. Dit is de basis van grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC).
Chromatografie is een verzamelnaam voor een grote groep scheidingstechnieken. Alle varianten delen hetzelfde basisprincipe — een mobiele fase beweegt langs een stationaire fase — maar verschillen in de aard van die fasen, het aandrijvingsmechanisme en de toepassing. Een overzicht van de belangrijkste varianten:
Kolomchromatografie (dit artikel) gebruikt een gevulde kolom als stationaire fase en een vloeibaar oplosmiddel als mobiele fase. De scheiding verloopt via adsorptie, verdeling, ionenwisseling of grootte-exclusie, afhankelijk van het vulmateriaal.
Dunnelaagchromatografie (TLC) werkt op hetzelfde adsorptieprincipe als kolomchromatografie met silicagel, maar de stationaire fase is aangebracht als dunne laag op een aluminium- of glasplaat. TLC is snel en goedkoop, en wordt vooral gebruikt als analysetool — ook als voorbereiding op kolomchromatografie. Lees meer in ons artikel over dunnelaagchromatografie (TLC).
Papierchromatografie is de eenvoudigste chromatografische techniek en werkt met chromatografiepapier als drager. De stationaire fase is het gebonden water in het papier; de mobiele fase is een oplosmiddel dat via capillaire werking opstijgt. Papierchromatografie scheidt op basis van verdeling (partitie) tussen de waterige stationaire fase en de organische mobiele fase — niet primair via adsorptie zoals bij silicagelchromatografie. De techniek is laagdrempelig en wordt veel gebruikt in het onderwijs, maar geeft een lagere resolutie dan TLC of kolomchromatografie.
Gaschromatografie (GC) gebruikt een gas als mobiele fase en scheidt vluchtige verbindingen op basis van dampdruk en interactie met de stationaire fase in een capillaire kolom. Meer hierover leest u in ons artikel over gaschromatografie (GC).
HPLC is in essentie kolomchromatografie waarbij het eluens onder hoge druk door een kolom met zeer fijn vulmateriaal wordt gepompt. Dit geeft een veel hogere resolutie en snelheid dan klassieke kolomchromatografie, zoals uitgebreid beschreven in het kennisbankartikel over HPLC.
Het verschil tussen analytische en preparatieve chromatografie loopt dwars door alle bovenstaande technieken heen: analytisch betekent dat u meet en identificeert in kleine hoeveelheden; preparatief betekent dat u zuivert en isoleert in grotere hoeveelheden. Klassieke open-kolomchromatografie is vrijwel de enige chromatografietechniek die ook preparatief op gramschaal wordt ingezet zonder gespecialiseerde apparatuur.
Het eluens bepaalt mede de selectiviteit van de scheiding. Bij normale-fase kolomchromatografie (NP) met silicagel als stationaire fase gebruikt u apolaire tot matig polaire oplosmiddelen: hexaan, petroleumether, dichloormethaan, ethylacetaat of mengsels daarvan. De polariteit verhoogt u stapsgewijs of via een gradiënt om sterkere adsorberende componenten te elueren.
Bij reversed-phase chromatografie (RP) werkt u juist met waterige oplosmiddelen (water, methanol, acetonitril), waarbij u de organische fractie verhoogt om sterkere adsorbenten te elueren.
Een praktische hulpregel bij normale-fase chromatografie is de eluotrope reeks: de rangschikking van oplosmiddelen op toenemende elutiekracht ten opzichte van polaire adsorbenten. Hoe hoger in de reeks, hoe sneller componenten elueren.
De stationaire fase brengt u op twee manieren in de kolom aan:
Natte belading (wet packing): u maakt een suspensie van het vulmateriaal in het starteluens en giet deze in de kolom. Het vulmateriaal zakt gelijkmatig neer terwijl het oplosmiddel afloopt. Dit is de meest gebruikte methode en geeft een homogeen, luchtbelvrij kolombed.
Droge belading (dry packing): u brengt het droge vulmateriaal in de kolom aan en laat daarna het eluens inlopen. Dit werkt sneller maar geeft vaker een onregelmatig kolombed met luchtbellen, wat de scheidingskracht vermindert.
Het te scheiden monster brengt u bij voorkeur opgelost in een zo klein mogelijk volume van het starteluens aan. Een geconcentreerde, smalle monsterband aan het begin van de kolom leidt tot scherpe, goed gescheiden fracties.
Bij analytische kolomchromatografie is het doel het identificeren en kwantificeren van componenten in kleine hoeveelheden. De kolom is smal, het monstervolume klein en het vulmateriaal fijn. Analytische kolomchromatografie wordt tegenwoordig vrijwel uitsluitend uitgevoerd als HPLC of andere instrumentele variant.
Bij preparatieve kolomchromatografie is het doel de zuivering van een voldoende hoeveelheid product voor verdere bewerking — van milligram- tot gramschaal. Klassieke open-kolomchromatografie is hiervoor nog steeds zeer relevant. De verhouding vulmateriaal tot monster ligt typisch tussen 20:1 en 100:1 (gewicht/gewicht), afhankelijk van de moeilijkheidsgraad van de scheiding.
Een tussenvorm is flash-chromatografie: kolomchromatografie waarbij via een kleine overdruk (handpomp of stikstofleiding) het eluens sneller door de kolom wordt gedrukt. Met fijner silicagel (40–63 µm) en hogere doorstroomsnelheid bereikt u in kortere tijd een minstens vergelijkbare resolutie als bij klassieke gravitatiekolomchromatografie. Flash-chromatografie is tegenwoordig de standaard voor preparatieve zuivering in de organische synthese.
Vóór een preparatieve kolomchromatografie voert u vrijwel altijd een dunnelaagchromatografie (TLC)-analyse uit op hetzelfde vulmateriaal en met hetzelfde eluens. De Rf-waarde (retentiefactor) die u op de TLC-plaat meet, geeft een goede indicatie van het gedrag op de kolom:
Rf = afstand afgelegd door de vlek / afstand afgelegd door het oplosmiddelfront
Een Rf-waarde van 0,2–0,3 voor het gewenste product in het starteluens is ideaal: de stof hecht voldoende aan de stationaire fase om niet direct door te lopen, maar is wel te elueren met een redelijk volume oplosmiddel. Componenten met sterk verschillende Rf-waarden (verschil > 0,15) zijn doorgaans goed te scheiden op de kolom.
Bij instrumentele chromatografie (HPLC, GC) worden de scheidingseigenschappen van een kolom uitgedrukt in kwantitatieve grootheden. Ook bij klassieke kolomchromatografie zijn deze begrippen relevant om de kwaliteit van een scheiding te beoordelen.
De dode tijd (t₀, ook wel holtetijd of void time) is de tijd die een niet-retinerende stof — een stof die geen affiniteit heeft voor de stationaire fase — nodig heeft om de kolom te passeren. De dode tijd weerspiegelt het volume van de mobiele fase in de kolom (het holte-volume). Elke stof die wél met de stationaire fase wisselwerkt, verblijft langer in de kolom dan de dode tijd.
De retentietijd (tR) is de totale tijd die een component nodig heeft om de kolom te verlaten, gemeten vanaf het moment van injectie. De gecorrigeerde retentietijd (t'R = tR − t₀) geeft de extra tijd weer die de component in de stationaire fase heeft doorgebracht. Bij klassieke kolomchromatografie werkt u met volumes in plaats van tijden (retentievolume, dood volume), maar het principe is identiek.
De resolutie (R) beschrijft hoe goed twee aangrenzende pieken van elkaar gescheiden zijn. De formule is:
R = 2 × (tR2 − tR1) / (w1 + w2)
waarbij tR1 en tR2 de retentietijden zijn van de twee componenten en w1 en w2 de piekbreedten aan de basis. Een resolutie van 1,0 betekent dat de pieken raken; een resolutie van 1,5 of hoger duidt op een basislijnscheiding. Bij klassieke kolomchromatografie streeft u naar een resolutie waarbij de fracties van de twee componenten niet of nauwelijks overlappen, wat overeenkomt met een verschil in Rf-waarden van minimaal 0,15 op TLC.
De resolutie is te verhogen door de kolomlengte te vergroten (meer theoretische platen), de korrelmaat van het vulmateriaal te verkleinen (meer platen per lengte-eenheid) of de selectiviteit van het systeem te verbeteren via een andere eluenssamenstelling of stationaire fase.
Bij klassieke kolomchromatografie verlaat de kolom het efflux zichtbaar of onzichtbaar, afhankelijk van de verbindingen. Gekleurde verbindingen zijn direct te volgen; kleurloze verbindingen vereisen andere detectiemethoden:
De eenvoudigste methode is het analyseren van elke fractie via TLC met UV-licht (bij 254 nm of 366 nm) of een kleurreagens (zoals KMnO₄-oplossing of ninhydrine voor aminozuren). Fracties met hetzelfde chromatografische patroon worden samengevoegd.
In meer geavanceerde opstellingen gebruikt men een UV-detector in de effluxlijn, die continu de absorptie bij een bepaalde golflengte meet en een chromatogram genereert. Dit is gangbaar bij flash-chromatografiesystemen en vormt de brug naar volledig geautomatiseerde vloeistofchromatografie.
Klassieke kolomchromatografie wordt breed ingezet in de organische chemie, farmaceutische industrie, voedingsmiddelenanalyse en biochemie. Typische toepassingen zijn:
De zuivering van syntheseproducten: na een organische reactie bevat het ruwe product bijproducten, niet-omgezet uitgangsmateriaal en restanten van het reagens. Kolomchromatografie isoleert het gewenste product in hoge zuiverheid. Meer over zuiverheidsgraden leest u in ons artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën.
De isolatie van natuurstoffen: plantextracten, fermentatieproducten en andere complexe mengsels worden gefractioneerd om werkzame stoffen te isoleren. Hierbij worden soms ook Solid Phase Extraction (SPE)-cartridges ingezet als sneller alternatief voor kleine volumes.
De verwijdering van verontreinigingen: ongewenste kleuringen, restanten van katalysatoren of polaire bijproducten worden selectief op de kolom gehouden terwijl het gewenste product doorloopt.
De fractionering van complexe mengsels voor verdere analyse, waarbij de fracties vervolgens worden geanalyseerd via HPLC of gaschromatografie (GC).
Voor een klassieke kolomchromatografie heeft u het volgende nodig: een glazen chromatografiekolom met kraantje of fritta, een statief met klem om de kolom te bevestigen, passend glaswerk voor het opvangen van fracties (maatcilinders, erlenmeyers of reageerbuisjes in een rek), de stationaire fase, het eluens en het te scheiden monster. Voor TLC-controle heeft u een TLC-plaat en een UV-lamp of kleurreagens nodig. Een overzicht van het benodigde glaswerk en de bijbehorende filtratietechnieken vindt u in de kennisbank.
Chromatografiemateriaal zoals kolommen, silicagel en het bijbehorende glaswerk vindt u in de categorie chromatografie in ons assortiment.
Klassieke kolomchromatografie is eenvoudig, goedkoop en schaalbaar, maar heeft ook beperkingen: de resolutie is lager dan bij HPLC, de looptijd is lang en het oplosmiddelverbruik is hoog. Vergeleken met papierchromatografie biedt kolomchromatografie een aanzienlijk hogere capaciteit en resolutie; papierchromatografie is geschikt voor oriënterende analyses in het onderwijs, maar niet voor preparatieve zuivering. Voor analytische doeleinden is HPLC vrijwel altijd de betere keuze.
Wanneer preparatieve zuivering op grotere schaal nodig is dan grammen — bijvoorbeeld in de farmaceutische industrie voor de zuivering van kilogrammen API (werkzame stof) — wordt preparatieve HPLC of semi-preparatieve HPLC ingezet. Voor analytische toepassingen waarbij hoge doorvoer gecombineerd moet worden met lage tegendruk zijn monolietkolommen een alternatief voor deeltjesgevulde kolommen. Hierbij worden brede, zwaarbeladen kolommen gebruikt in combinatie met geautomatiseerde fractionering. Semi-preparatieve HPLC (typisch kolommen van 10–30 mm diameter) is geschikt voor milligrammen tot enkele grammen per injectie; preparatieve HPLC (kolommen van 50–300 mm en meer) voor grammen tot kilogrammen. De basisprincipes zijn dezelfde als bij klassieke kolomchromatografie, maar de scheidingskracht, snelheid en reproduceerbaarheid zijn veel hoger.
Voor preparatieve zuivering op kleine schaal biedt klassieke kolomchromatografie — of flash-chromatografie — echter nog steeds een uitstekende prijs-kwaliteitverhouding, zonder de aanschaf van dure apparatuur. Voor de definitieve zuivering van vaste syntheseproducten na kolomchromatografie is kristallisatie als zuiveringstechniek de aangewezen vervolgstap.
Kolomchromatografie wordt gebruikt om de componenten van een mengsel van elkaar te scheiden op basis van hun chemische affiniteit voor een vaste stof (de stationaire fase). In de organische chemie is de meest voorkomende toepassing de zuivering van syntheseproducten: na een reactie bevat het mengsel het gewenste product samen met bijproducten, niet-omgezet uitgangsmateriaal en reagens-resten. Via kolomchromatografie isoleert u het doelproduct in hoge zuiverheid. Andere toepassingen zijn de isolatie van werkzame stoffen uit plantextracten en fermentatieproducten, de verwijdering van kleuringen of katalysatorresten, en de fractionering van complexe mengsels voor verdere analyse. Klassieke open-kolomchromatografie is daarmee een van de weinige preparatieve scheidingstechnieken die op gramschaal toegankelijk zijn zonder kostbare instrumentatie.
In de analytische en preparatieve chemie worden diverse scheidingsmethoden ingezet, elk gebaseerd op een ander fysisch of chemisch principe. De meest gangbare zijn: chromatografie (scheiding op affiniteit voor een stationaire fase — kolomchromatografie, TLC, HPLC, GC), destillatie (scheiding op kookpunt, zie ook destillatie in het laboratorium), extractie (scheiding op verdeling over twee fasen, zoals vloeistof-vloeistofextractie), precipitatie of neerslaan (scheiding door een opgeloste stof onoplosbaar te maken), kristallisatie (scheiding via selectieve kristalgroei), filtratie (scheiding op deeltjesgrootte via een poreus medium) en centrifugatie (scheiding op dichtheidsverschil onder centrifugaalkracht). Welke methode het meest geschikt is hangt af van de aard van het mengsel, de gewenste zuiverheid en de beschikbare hoeveelheid. In de praktijk worden meerdere methoden gecombineerd: kolomchromatografie voor ruwe zuivering gevolgd door kristallisatie voor de eindzuivering is een klassieke combinatie in de organische synthese.
Ja. HPLC (High Performance Liquid Chromatography) is een verfijnde variant van kolomchromatografie. Het basisprincipe — verdeling van componenten over een stationaire fase en een vloeibare mobiele fase — is identiek aan klassieke kolomchromatografie. Het verschil zit in de uitvoering: bij HPLC wordt de mobiele fase met hoge druk (200–1500 bar) door een kolom gepompt die gevuld is met zeer fijne deeltjes (1,7–5 µm). Dit geeft een aanzienlijk hogere resolutie, kortere analysetijden en betere reproduceerbaarheid dan open-kolomchromatografie. HPLC is daarmee de analytische en semi-preparatieve opvolger van klassieke kolomchromatografie, maar deelt er het fundamentele scheidingsprincipe mee. Andere verwante chromatografische technieken zijn gaschromatografie (GC, met een gas als mobiele fase), dunnelaagchromatografie (TLC) en papierchromatografie.
C4, C8 en C18 zijn verschillende varianten van reversed-phase stationaire fasen: silicageldeeltjes waarop apolaire alkylketens zijn gebonden. Het getal verwijst naar het aantal koolstofatomen in die keten. Hoe langer de keten, hoe sterker het hydrofoob karakter van het kolomoppervlak en hoe sterker apolaire verbindingen worden geretineerd. C18 (octadecyl, 18 koolstofatomen) is de meest universele keuze voor de scheiding van apolaire tot matig polaire verbindingen en daarmee veruit het meest toegepast in HPLC en reversed-phase kolomchromatografie. C8 (octyl, 8 koolstofatomen) geeft minder retentie dan C18 en is nuttig wanneer verbindingen op C18 te sterk worden vastgehouden of wanneer kortere analysetijden gewenst zijn. C4 (butyl, 4 koolstofatomen) heeft het minst hydrofoob oppervlak van de drie en is bij uitstek geschikt voor grote biomoleculen zoals eiwitten en peptiden: op C18 of C8 zouden deze te sterk adsorberen en denatureren, terwijl C4 een mildere interactie biedt die elutie bij lagere percentage organisch oplosmiddel mogelijk maakt.
Een C18-kolom — of C18-sorbens in open-kolomformaat — moet vóór gebruik worden geconditioneerd om reproduceerbare resultaten te garanderen. De standaardprocedure verloopt in twee stappen. Eerst spoelt u de kolom door met een sterk organisch oplosmiddel, doorgaans puur methanol of acetonitril (minimaal 5 kolomvolumes). Dit bevochtigt de hydrofobe C18-laag, verwijdert eventuele luchtbellen en lost resten van het droogoplosmiddel op. Daarna equilibreert u met het startmengsel van de mobiele fase — bijvoorbeeld 30% acetonitril in water — totdat de efflux stabiel is in samenstelling en de basislijn van de UV-detector vlak is (ook minimaal 5–10 kolomvolumes). Een niet-geconditioneerde C18-kolom geeft onbetrouwbare retentietijden, slechte piekvormen en niet-reproduceerbare resultaten. Bij SPE-cartridges met C18-sorbens is dezelfde conditionering van toepassing; zie het artikel over solid-phase extractie (SPE) voor de volledige protocol-details.
Semi-preparatieve HPLC is een HPLC-uitvoering met bredere kolommen (typisch 10–30 mm inwendige diameter, tegenover 4,6 mm bij analytische HPLC) en hogere flowsnelheden, waardoor per injectie milligrammen tot enkele grammen van een doelstof kunnen worden geïsoleerd. Het werkt op hetzelfde principe als analytische HPLC — scheiding op basis van affiniteit voor de stationaire fase bij hoge druk — maar het opvangen en isoleren van fracties staat centraal in plaats van detectie en kwantificering. U kiest semi-preparatieve HPLC wanneer de gewenste hoeveelheid product te groot is voor klassieke kolomchromatografie (doorgaans meer dan enkele grammen per dag) of wanneer de vereiste zuiverheid hoger is dan met flash-chromatografie haalbaar is, maar de schaal te klein is voor volledig preparatieve HPLC-kolommen (50 mm en groter). Typische toepassingen zijn de isolatie van referentiestandaarden, zuivering van farmaceutische intermediates en isolatie van enkelvoudige componenten uit complexe natuurproductenextracten. De gecollecteerde fracties worden na de scheiding ingedampt — via rotatieverdamping of lyofylisatie — om het oplosmiddel te verwijderen.
HPLC werkt op hetzelfde principe als klassieke kolomchromatografie, maar dan met veel hogere druk en fijnere deeltjes. U pompt een vloeibaar oplosmiddel (de mobiele fase) met hoge druk door een kolom die gevuld is met heel fijne deeltjes van een vaste stof (de stationaire fase). Het monster — het mengsel dat u wilt scheiden — wordt in de vloeistofstroom geïnjecteerd. Elk component in het monster heeft een andere affiniteit voor de stationaire fase: stoffen die sterk aan de vaste stof hechten, worden langer vastgehouden en verlaten de kolom later; stoffen met weinig affiniteit lopen er snel doorheen. Aan het einde van de kolom zit een detector die de stoffen registreert op het moment dat ze de kolom verlaten. Het resultaat is een chromatogram: een grafiek met op de x-as de tijd en op de y-as het detectorsignaal, met een piek voor elke gescheiden component. De positie van de piek (retentietijd) identificeert de stof; de oppervlakte eronder is een maat voor de hoeveelheid. Voor een uitgebreide technische behandeling van HPLC, inclusief kolomtypen, detectoren en methode-ontwikkeling, verwijzen wij naar ons artikel over HPLC.
Gewone dunnelaagchromatografie (TLC) is een analytische techniek: u brengt een kleine hoeveelheid monster aan op een TLC-plaat en bepaalt op basis van de Rf-waarden welke componenten aanwezig zijn en hoe goed ze te scheiden zijn. Er wordt niets geïsoleerd; de techniek dient als diagnose-instrument. Preparatieve TLC werkt op hetzelfde principe, maar gebruikt bredere platen met een dikkere laag stationaire fase (doorgaans 0,5 tot 2 mm silicagel in plaats van 0,25 mm). U brengt het monster als een doorlopende band aan over de breedte van de plaat en schaaft na ontwikkeling de zone van het gewenste product weg. Het silicagel wordt daarna gespoeld met een sterk oplosmiddel om het product te elueren. Preparatieve TLC is geschikt voor de isolatie van milligrammen product en is een eenvoudig alternatief voor kolomchromatografie bij kleine hoeveelheden, maar het is bewerkelijker en minder geschikt voor grotere hoeveelheden dan een open kolom. Zie ook ons artikel over dunnelaagchromatografie (TLC) voor meer achtergrond bij de analytische variant.
Een HPLC-systeem bestaat in essentie uit vier hoofdcomponenten die achtereenvolgens samenwerken. De pomp transporteert de mobiele fase onder hoge druk (200–1500 bar) door het systeem; bij gradiëntanalyses mengt een tweede pomp of een mengventiel twee oplosmiddelen in een variabele verhouding. De injector (of autosampler) brengt een nauwkeurig afgemeten volume monster in de vloeistofstroom. De kolom bevat de stationaire fase en is de plek waar de daadwerkelijke scheiding plaatsvindt; de kolomkeuze bepaalt de selectiviteit. De detector registreert de componenten zodra ze de kolom verlaten; gangbare detectoren zijn UV/Vis, diode-array en massaspectrometrie. Een datasysteem verwerkt het detectorsignaal tot een chromatogram. Dit basisprincipe is identiek aan dat van klassieke kolomchromatografie, maar dan geautomatiseerd en onder hoge druk. Voor een uitgebreid overzicht van kolomtypen, detectoren en methode-ontwikkeling, zie ons artikel over HPLC.
Een HPLC-chromatogram is een grafiek met op de horizontale as de tijd (in minuten) en op de verticale as het detectorsignaal (bijvoorbeeld absorptie bij een bepaalde golflengte). Elke component die de kolom verlaat, veroorzaakt een piek. De retentietijd — het tijdstip waarop de piek zijn maximum bereikt — is karakteristiek voor de stof onder de gegeven omstandigheden en dient voor identificatie door vergelijking met een referentiestandaard. De piekoppervlakte (of piekhoogte) is evenredig met de hoeveelheid stof en wordt gebruikt voor kwantificering. De piekbreedte geeft informatie over de kolomefficiëntie: smalle, symmetrische pieken duiden op een goed functionerende kolom; brede of asymmetrische pieken wijzen op band-verbreding door een te groot extracolumn-volume, overbelading of onvolledige equilibratie. De basislijn — het signaal tussen de pieken — dient vlak en stabiel te zijn; een stijgende of ruisige basislijn wijst doorgaans op een vervuild oplosmiddel, een luchtbel in de pomp of een niet-geëquilibreerde kolom.
Bij Labvakhandel vindt u chromatografie-verbruiksmaterialen, erlenmeyers voor de opvang en statiefmateriaal voor de opstelling. Wilt u advies, neem contact op met ons voor advies.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
