Kolomchromatografie is een van de meest gebruikte scheidingstechnieken in het laboratorium. Bij klassieke kolomchromatografie — ook wel gravity column chromatography of open-kolomchromatografie genoemd — stroomt een vloeibaar oplosmiddel onder invloed van de zwaartekracht door een glazen kolom gevuld met een vaste stof. Componenten in een mengsel scheiden omdat ze zich in verschillende mate hechten aan die vaste stof. Het resultaat: zuivere fracties die u afzonderlijk opvangt en verder analyseert of gebruikt.
De techniek is eenvoudig op te zetten, vereist geen pompen of druk, en is geschikt voor zowel analytische doeleinden als preparatieve zuivering op gramschaal. Klassieke kolomchromatografie vormt daarmee de basis waarop modernere varianten zoals HPLC en vloeistofchromatografie zijn gebouwd. Verderop in dit artikel leest u ook hoe kolomchromatografie zich verhoudt tot andere chromatografische technieken zoals papierchromatografie, en wat begrippen als dode tijd en resolutie precies betekenen.
Het scheidingsprincipe van kolomchromatografie berust op de wisselwerking tussen twee fasen: de stationaire fase (het vulmateriaal in de kolom) en de mobiele fase (het oplosmiddel dat door de kolom stroomt). Componenten verdelen zich continu over beide fasen op basis van hun chemische affiniteit. Een stof die sterk aan de stationaire fase hecht, beweegt langzaam mee met de mobiele fase; een stof met weinig affiniteit passeert snel.
Dit evenwicht wordt beschreven door de distributieverhouding K: de verhouding van de concentratie van een stof in de stationaire fase ten opzichte van de mobiele fase. Hoe groter het verschil in K-waarden tussen twee componenten, hoe beter ze van elkaar te scheiden zijn.
Een klassieke chromatografiekolom bestaat uit een glazen buis met onderaan een kraantje of glazen filter (fritta). De kolom wordt gevuld met de stationaire fase, die op de fritta rust. Bovenaan brengt u het te scheiden mengsel aan, waarna u het eluens — het oplosmiddel of oplosmiddelgemengsel dat als mobiele fase dient — toevoegt. Door de zwaartekracht stroomt het eluens door de kolom en verlaat de kolom onderaan als efflux, die u in fracties opvangt.
De kolomdiameter en -hoogte bepalen de capaciteit en scheidingskracht. Een langere kolom geeft meer scheidingsplaten en daarmee een hogere resolutie, maar verlengt ook de looptijd. Voor preparatieve zuivering kiest u een bredere kolom; voor analytische doeleinden volstaat een smallere.
De keuze van de stationaire fase is bepalend voor de scheiding. De meest gebruikte materialen zijn:
Silicagel is veruit het meest toegepaste vulmateriaal. Het heeft een polair oppervlak met vrije silanol-groepen (-Si-OH) die polaire verbindingen sterk adsorberen. Silicagel is geschikt voor de scheiding van de meeste organische verbindingen en wordt standaard aangeboden in korrelmaten van 40–63 µm (voor normale chromatografie) tot 15–40 µm (voor flash-chromatografie).
Aluminiumoxide (Al₂O₃) is verkrijgbaar in zure, neutrale en basische uitvoering. Het is minder universeel dan silicagel, maar bijzonder geschikt voor verbindingen die op silicagel ontleden of te sterk adsorberen, zoals basische stikstofhoudende verbindingen.
Reversed-phase materialen zijn silicageldeeltjes waarvan het oppervlak chemisch is gemodificeerd met apolaire alkylketens. De meest gebruikte varianten zijn C18 (octadecyl, 18 koolstofatomen), C8 (octyl, 8 koolstofatomen) en C4 (butyl, 4 koolstofatomen). Hoe langer de keten, hoe meer hydrofoob het oppervlak en hoe sterker apolaire verbindingen worden geretineerd. C18 is de meest universele keuze voor apolaire tot matig polaire verbindingen; C8 wordt ingezet wanneer een iets kortere retentietijd gewenst is; C4 is met name geschikt voor grote biomoleculen zoals eiwitten en peptiden, die op C18 te sterk zouden adsorberen. Reversed-phase kolomchromatografie werkt met waterige oplosmiddelmengsels als mobiele fase.
Vóór gebruik moet een reversed-phase kolom worden geconditioneerd. Bij een C18-kolom in open-kolomformaat spoelt u de kolom eerst door met puur methanol of acetonitril om het droge sorbens te bevochtigen en luchtbellen te verwijderen. Daarna equilibreert u met het startmengsel van de mobiele fase — doorgaans een water/methanol- of water/acetonitrilmengsel in de gewenste startverhouding — totdat de kolom stabiel is. Sla deze stap niet over: een niet-geëquilibreerde kolom geeft onreproduceerbare retentietijden en slechte piekvormen. Bij SPE-cartridges met C18-sorbens geldt hetzelfde principe; meer daarover leest u in ons artikel over Solid Phase Extraction (SPE).
Ionenwisselaars (kationisch of anionisch) zijn stationaire fasen voor de scheiding op basis van lading. Ze worden ingezet in biochemische toepassingen voor de zuivering van eiwitten, aminozuren en nucleotiden.
Grootte-exclusiemateriaal (zoals Sephadex) scheidt op molecuulgrootte: kleinere moleculen dringen dieper in de poriën en elueren later. Dit is de basis van grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC).
Chromatografie is een verzamelnaam voor een grote groep scheidingstechnieken. Alle varianten delen hetzelfde basisprincipe — een mobiele fase beweegt langs een stationaire fase — maar verschillen in de aard van die fasen, het aandrijvingsmechanisme en de toepassing. Een overzicht van de belangrijkste varianten:
Kolomchromatografie (dit artikel) gebruikt een gevulde kolom als stationaire fase en een vloeibaar oplosmiddel als mobiele fase. De scheiding verloopt via adsorptie, verdeling, ionenwisseling of grootte-exclusie, afhankelijk van het vulmateriaal.
Dunnelaagchromatografie (TLC) werkt op hetzelfde adsorptieprincipe als kolomchromatografie met silicagel, maar de stationaire fase is aangebracht als dunne laag op een aluminium- of glasplaat. TLC is snel en goedkoop, en wordt vooral gebruikt als analysetool — ook als voorbereiding op kolomchromatografie. Lees meer in ons artikel over dunnelaagchromatografie (TLC).
Papierchromatografie is de eenvoudigste chromatografische techniek en werkt met chromatografiepapier als drager. De stationaire fase is het gebonden water in het papier; de mobiele fase is een oplosmiddel dat via capillaire werking opstijgt. Papierchromatografie scheidt op basis van verdeling (partitie) tussen de waterige stationaire fase en de organische mobiele fase — niet primair via adsorptie zoals bij silicagelchromatografie. De techniek is laagdrempelig en wordt veel gebruikt in het onderwijs, maar geeft een lagere resolutie dan TLC of kolomchromatografie.
Gaschromatografie (GC) gebruikt een gas als mobiele fase en scheidt vluchtige verbindingen op basis van dampdruk en interactie met de stationaire fase in een capillaire kolom. Meer hierover leest u in ons artikel over gaschromatografie (GC).
HPLC is in essentie kolomchromatografie waarbij het eluens onder hoge druk door een kolom met zeer fijn vulmateriaal wordt gepompt. Dit geeft een veel hogere resolutie en snelheid dan klassieke kolomchromatografie. Zie ons artikel over HPLC voor een uitgebreide behandeling.
Het verschil tussen analytische en preparatieve chromatografie loopt dwars door alle bovenstaande technieken heen: analytisch betekent dat u meet en identificeert in kleine hoeveelheden; preparatief betekent dat u zuivert en isoleert in grotere hoeveelheden. Klassieke open-kolomchromatografie is vrijwel de enige chromatografietechniek die ook preparatief op gramschaal wordt ingezet zonder gespecialiseerde apparatuur.
Het eluens bepaalt mede de selectiviteit van de scheiding. Bij normale-fase kolomchromatografie (NP) met silicagel als stationaire fase gebruikt u apolaire tot matig polaire oplosmiddelen: hexaan, petroleumether, dichloormethaan, ethylacetaat of mengsels daarvan. De polariteit verhoogt u stapsgewijs of via een gradiënt om sterkere adsorberende componenten te elueren.
Bij reversed-phase chromatografie (RP) werkt u juist met waterige oplosmiddelen (water, methanol, acetonitril), waarbij u de organische fractie verhoogt om sterkere adsorbenten te elueren.
Een praktische hulpregel bij normale-fase chromatografie is de eluotrope reeks: de rangschikking van oplosmiddelen op toenemende elutiekracht ten opzichte van polaire adsorbenten. Hoe hoger in de reeks, hoe sneller componenten elueren.
De stationaire fase brengt u op twee manieren in de kolom aan:
Natte belading (wet packing): u maakt een suspensie van het vulmateriaal in het starteluens en giet deze in de kolom. Het vulmateriaal zakt gelijkmatig neer terwijl het oplosmiddel afloopt. Dit is de meest gebruikte methode en geeft een homogeen, luchtbelvrij kolombed.
Droge belading (dry packing): u brengt het droge vulmateriaal in de kolom aan en laat daarna het eluens inlopen. Dit werkt sneller maar geeft vaker een onregelmatig kolombed met luchtbellen, wat de scheidingskracht vermindert.
Het te scheiden monster brengt u bij voorkeur opgelost in een zo klein mogelijk volume van het starteluens aan. Een geconcentreerde, smalle monsterband aan het begin van de kolom leidt tot scherpe, goed gescheiden fracties.
Bij analytische kolomchromatografie is het doel het identificeren en kwantificeren van componenten in kleine hoeveelheden. De kolom is smal, het monstervolume klein en het vulmateriaal fijn. Analytische kolomchromatografie wordt tegenwoordig vrijwel uitsluitend uitgevoerd als HPLC of andere instrumentele variant.
Bij preparatieve kolomchromatografie is het doel de zuivering van een voldoende hoeveelheid product voor verdere bewerking — van milligram- tot gramschaal. Klassieke open-kolomchromatografie is hiervoor nog steeds zeer relevant. De verhouding vulmateriaal tot monster ligt typisch tussen 20:1 en 100:1 (gewicht/gewicht), afhankelijk van de moeilijkheidsgraad van de scheiding.
Een tussenvorm is flash-chromatografie: kolomchromatografie waarbij via een kleine overdruk (handpomp of stikstofleiding) het eluens sneller door de kolom wordt gedrukt. Met fijner silicagel (40–63 µm) en hogere doorstroomsnelheid bereikt u in kortere tijd een minstens vergelijkbare resolutie als bij klassieke gravitatiekolomchromatografie. Flash-chromatografie is tegenwoordig de standaard voor preparatieve zuivering in de organische synthese.
Vóór een preparatieve kolomchromatografie voert u vrijwel altijd een dunnelaagchromatografie (TLC)-analyse uit op hetzelfde vulmateriaal en met hetzelfde eluens. De Rf-waarde (retentiefactor) die u op de TLC-plaat meet, geeft een goede indicatie van het gedrag op de kolom:
Rf = afstand afgelegd door de vlek / afstand afgelegd door het oplosmiddelfront
Een Rf-waarde van 0,2–0,3 voor het gewenste product in het starteluens is ideaal: de stof hecht voldoende aan de stationaire fase om niet direct door te lopen, maar is wel te elueren met een redelijk volume oplosmiddel. Componenten met sterk verschillende Rf-waarden (verschil > 0,15) zijn doorgaans goed te scheiden op de kolom.
Bij instrumentele chromatografie (HPLC, GC) worden de scheidingseigenschappen van een kolom uitgedrukt in kwantitatieve grootheden. Ook bij klassieke kolomchromatografie zijn deze begrippen relevant om de kwaliteit van een scheiding te beoordelen.
De dode tijd (t₀, ook wel holtetijd of void time) is de tijd die een niet-retinerende stof — een stof die geen affiniteit heeft voor de stationaire fase — nodig heeft om de kolom te passeren. De dode tijd weerspiegelt het volume van de mobiele fase in de kolom (het holte-volume). Elke stof die wél met de stationaire fase wisselwerkt, verblijft langer in de kolom dan de dode tijd.
De retentietijd (tR) is de totale tijd die een component nodig heeft om de kolom te verlaten, gemeten vanaf het moment van injectie. De gecorrigeerde retentietijd (t'R = tR − t₀) geeft de extra tijd weer die de component in de stationaire fase heeft doorgebracht. Bij klassieke kolomchromatografie werkt u met volumes in plaats van tijden (retentievolume, dood volume), maar het principe is identiek.
De resolutie (R) beschrijft hoe goed twee aangrenzende pieken van elkaar gescheiden zijn. De formule is:
R = 2 × (tR2 − tR1) / (w1 + w2)
waarbij tR1 en tR2 de retentietijden zijn van de twee componenten en w1 en w2 de piekbreedten aan de basis. Een resolutie van 1,0 betekent dat de pieken raken; een resolutie van 1,5 of hoger duidt op een basislijnscheiding. Bij klassieke kolomchromatografie streeft u naar een resolutie waarbij de fracties van de twee componenten niet of nauwelijks overlappen, wat overeenkomt met een verschil in Rf-waarden van minimaal 0,15 op TLC.
De resolutie is te verhogen door de kolomlengte te vergroten (meer theoretische platen), de korrelmaat van het vulmateriaal te verkleinen (meer platen per lengte-eenheid) of de selectiviteit van het systeem te verbeteren via een andere eluenssamenstelling of stationaire fase.
Bij klassieke kolomchromatografie verlaat de kolom het efflux zichtbaar of onzichtbaar, afhankelijk van de verbindingen. Gekleurde verbindingen zijn direct te volgen; kleurloze verbindingen vereisen andere detectiemethoden:
De eenvoudigste methode is het analyseren van elke fractie via TLC met UV-licht (bij 254 nm of 366 nm) of een kleurreagens (zoals KMnO₄-oplossing of ninhydrine voor aminozuren). Fracties met hetzelfde chromatografische patroon worden samengevoegd.
In meer geavanceerde opstellingen gebruikt men een UV-detector in de effluxlijn, die continu de absorptie bij een bepaalde golflengte meet en een chromatogram genereert. Dit is gangbaar bij flash-chromatografiesystemen en vormt de brug naar volledig geautomatiseerde vloeistofchromatografie.
Klassieke kolomchromatografie wordt breed ingezet in de organische chemie, farmaceutische industrie, voedingsmiddelenanalyse en biochemie. Typische toepassingen zijn:
De zuivering van syntheseproducten: na een organische reactie bevat het ruwe product bijproducten, niet-omgezet uitgangsmateriaal en restanten van het reagens. Kolomchromatografie isoleert het gewenste product in hoge zuiverheid. Meer over zuiverheidsgraden leest u in ons artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën.
De isolatie van natuurstoffen: plantextracten, fermentatieproducten en andere complexe mengsels worden gefractioneerd om werkzame stoffen te isoleren. Hierbij worden soms ook Solid Phase Extraction (SPE)-cartridges ingezet als sneller alternatief voor kleine volumes.
De verwijdering van verontreinigingen: ongewenste kleuringen, restanten van katalysatoren of polaire bijproducten worden selectief op de kolom gehouden terwijl het gewenste product doorloopt.
De fractionering van complexe mengsels voor verdere analyse, waarbij de fracties vervolgens worden geanalyseerd via HPLC of gaschromatografie (GC).
Voor een klassieke kolomchromatografie heeft u het volgende nodig: een glazen chromatografiekolom met kraantje of fritta, een statief met klem om de kolom te bevestigen, passend glaswerk voor het opvangen van fracties (maatcilinders, erlenmeyers of reageerbuisjes in een rek), de stationaire fase, het eluens en het te scheiden monster. Voor TLC-controle heeft u een TLC-plaat en een UV-lamp of kleurreagens nodig. Een overzicht van het benodigde glaswerk en de bijbehorende filtratietechnieken vindt u in de kennisbank.
Chromatografiemateriaal zoals kolommen, silicagel en het bijbehorende glaswerk vindt u in de categorie chromatografie in ons assortiment.
Klassieke kolomchromatografie is eenvoudig, goedkoop en schaalbaar, maar heeft ook beperkingen: de resolutie is lager dan bij HPLC, de looptijd is lang en het oplosmiddelverbruik is hoog. Vergeleken met papierchromatografie biedt kolomchromatografie een aanzienlijk hogere capaciteit en resolutie; papierchromatografie is geschikt voor oriënterende analyses in het onderwijs, maar niet voor preparatieve zuivering. Voor analytische doeleinden is HPLC vrijwel altijd de betere keuze.
Wanneer preparatieve zuivering op grotere schaal nodig is dan grammen — bijvoorbeeld in de farmaceutische industrie voor de zuivering van kilogrammen API (werkzame stof) — wordt preparatieve HPLC of semi-preparatieve HPLC ingezet. Hierbij worden brede, zwaarbeladen kolommen gebruikt in combinatie met geautomatiseerde fractionering. Semi-preparatieve HPLC (typisch kolommen van 10–30 mm diameter) is geschikt voor milligrammen tot enkele grammen per injectie; preparatieve HPLC (kolommen van 50–300 mm en meer) voor grammen tot kilogrammen. De basisprincipes zijn dezelfde als bij klassieke kolomchromatografie, maar de scheidingskracht, snelheid en reproduceerbaarheid zijn veel hoger.
Voor preparatieve zuivering op kleine schaal biedt klassieke kolomchromatografie — of flash-chromatografie — echter nog steeds een uitstekende prijs-kwaliteitverhouding, zonder de aanschaf van dure apparatuur.
Wilt u weten welk type chromatografie het beste past bij uw toepassing? Neem contact op met onze specialisten voor advies.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
