UHPLC staat voor Ultra-High Performance Liquid Chromatography. Het is een doorontwikkeling van klassieke HPLC waarbij stationaire-fasedeeltjes met een diameter kleiner dan 2 µm worden gebruikt, in combinatie met pompen die druk tot ongeveer 1500 bar kunnen leveren. Door deze combinatie levert UHPLC dezelfde of betere scheidingsefficiëntie als HPLC in een fractie van de analysetijd, met smallere chromatografische pieken en lager oplosmiddelverbruik.
Waar HPLC sinds de jaren zeventig de standaard is voor vloeistofchromatografie, werd UHPLC in 2004 commercieel geïntroduceerd door Waters Corporation onder de handelsnaam UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography). UPLC is dus een merkgebonden term — andere fabrikanten brachten vergelijkbare systemen onder eigen handelsnamen op de markt, en de overkoepelende, leveranciersonafhankelijke aanduiding daarvoor werd UHPLC. In de praktijk worden beide termen vaak door elkaar gebruikt; technisch wijzen ze op hetzelfde principe.
Een UHPLC-systeem is functioneel identiek aan een HPLC-systeem en bestaat uit dezelfde vier hoofdonderdelen, maar elk onderdeel is uitgevoerd in een drukbestendigere en preciezere variant:
De mobiele fase stroomt continu vanuit twee of meer oplosmiddelreservoirs door de pomp, neemt het geïnjecteerde monster mee, en draagt de componenten door de kolom naar de detector. De tijd waarin een component niet wordt vastgehouden door de stationaire fase — de tijd voor het oplosmiddel zelf om door het systeem te stromen — heet de dode tijd (t₀). De totale tijd dat een component erover doet om geëlueerd te worden, heet de retentietijd (tR). Het verschil tussen beide bepaalt de retentiefactor en is een maat voor de interactie met de stationaire fase.
De prestaties van een chromatografische scheiding worden beschreven door de Van Deemter-vergelijking H = A + B/u + Cu, waarbij H de plaathoogte is en u de lineaire flowsnelheid. Hoe kleiner de plaathoogte, hoe efficiënter de scheiding. Bij conventionele HPLC met deeltjes van 3–5 µm ligt het optimum van deze curve relatief laag, en stijgt H bij hogere flowsnelheden snel. Bij sub-2-µm deeltjes zijn alle drie de termen kleiner:
De A-term (Eddy-diffusie) daalt omdat de stromingskanalen uniformer zijn. De B-term (longitudinale diffusie) is vergelijkbaar. De C-term (massaoverdrachtsweerstand) daalt sterk doordat de diffusieafstand binnen de kleinere deeltjes korter is. Het resultaat: een vlakkere Van Deemter-curve met een lager minimum, waardoor de scheiding niet alleen efficiënter is, maar ook bij veel hogere flowsnelheden zonder kwaliteitsverlies kan worden uitgevoerd. Dat is de kern van UHPLC.
Deze efficiëntiewinst heeft echter een prijs: de tegendruk neemt kwadratisch toe naarmate de deeltjes kleiner worden. Een conventioneel HPLC-systeem met een drukbereik tot 400 bar kan sub-2-µm deeltjes niet aansturen bij praktisch bruikbare flowsnelheden. Daarom werken UHPLC-systemen met pompen die tot 1300–1500 bar leveren, met aangepaste leidingen, fittingen en injectoren die deze drukken zonder lekkage of vervorming aankunnen.
De overstap van HPLC naar UHPLC is niet alleen een kwestie van een snellere methode kunnen draaien — het verandert hoe de hele scheiding wordt opgezet. De voornaamste verschillen op een rij:
De vraag “is UHPLC duurder dan HPLC?” hangt sterk af van wat in de berekening wordt meegenomen. De aanschafprijs van een UHPLC-systeem ligt hoger dan die van een conventioneel HPLC-systeem, en sub-2-µm kolommen kosten meer per stuk. Daar staat tegenover dat het verbruik aan acetonitril en andere oplosmiddelen aanzienlijk lager ligt en dat de monsterdoorvoer een veelvoud is. Voor laboratoria met hoge monsterdoorvoer is de totale kostprijs per monster bij UHPLC vaak lager dan bij HPLC.
De combinatie van snelheid, resolutie en gevoeligheid maakt UHPLC inzetbaar in vrijwel elk veld waar HPLC ook wordt gebruikt — met name daar waar doorloop of detectielimiet kritisch zijn:
Een van de belangrijkste drijfveren achter de opmars van UHPLC is de koppeling met massaspectrometrie. De smalle pieken van UHPLC passen bijzonder goed bij de hoge meetfrequentie van moderne massaspectrometers. Een veelgebruikte configuratie is UHPLC-Q-TOF MS: een UHPLC-systeem gekoppeld aan een quadrupool-time-of-flight massaspectrometer. De quadrupool fungeert als massafilter en de time-of-flight-analyser meet de uitgefilterde of gefragmenteerde ionen met hoge massanauwkeurigheid. Deze opstelling wordt veel gebruikt voor non-target screening, identificatie van onbekende verbindingen en exacte-massa-analyse.
Voor de gerichte kwantificering op spoorniveau is UHPLC-MS/MS met een triple-quadrupool massaspectrometer de standaard. Lees meer over deze koppelingstechnieken in het artikel over LC-MS en LC-MS/MS.
Een chirale (chiral) UHPLC-scheiding is een UHPLC-methode waarbij de stationaire fase een chirale selector bevat, zoals derivaten van polysacchariden (cellulose, amylose), cyclodextrines of macrocyclische antibiotica. Hiermee worden enantiomeren — moleculen die spiegelbeelden van elkaar zijn — van elkaar gescheiden. Dit is van bijzonder belang in de farmaceutische industrie, waar beide enantiomeren van eenzelfde werkzame stof drastisch verschillende biologische effecten kunnen hebben. UHPLC heeft de chirale scheiding versneld van vaak meer dan een half uur naar enkele minuten, met scherpe piekvormen die de scheiding ook bij lage enantiomeerverhoudingen mogelijk maken. Lees meer over het volledige principe en de kolomkeuze in het artikel over chirale chromatografie.
UHPLC stelt strengere eisen aan de zuiverheid van de mobiele fase dan HPLC. Door de hogere gevoeligheid en smalle pieken veroorzaakt elke verontreiniging zichtbare achtergrondsignalen of fantoompieken. Het water in de mobiele fase moet daarom van UHPLC-kwaliteit zijn (of beter): ultrazuiver, met een lage organische koolstofbelasting (TOC < 5 ppb) en lage ionenbelasting. Dit type water wordt doorgaans bereid via een combinatie van omgekeerde osmose, ionenwisseling en UV-oxidatie. Voor de organische component (acetonitril, methanol) geldt minimaal de specificatie “LC-MS grade” of “UHPLC grade” — zie ook het artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën. Onvoldoende zuivere oplosmiddelen veroorzaken bij UHPLC sneller drukvariaties, kolomverstopping en achtergrondruis.
De stationaire fase voor UHPLC bestaat doorgaans uit poreuze silicadeeltjes van 1,7–1,8 µm met C18- of C8-modificatie voor omgekeerde-fase scheiding. Naast volledig poreuze deeltjes worden ook core-shell-deeltjes (SPP, superficially porous particles) gebruikt: deze hebben een dichte kern met een dunne poreuze schil. Core-shell-deeltjes leveren UHPLC-achtige efficiëntie bij iets lagere tegendruk, en zijn daardoor ook bruikbaar in conventionele HPLC-apparatuur (tot 400 bar) en in UHPLC. Een andere alternatieve stationaire fase zijn monolietkolommen, die met hun open structuur zeer lage tegendrukken combineren met hoge flowsnelheden.
UHPLC-kolommen zijn typisch 50 tot 150 mm lang met een interne diameter van 2,1 mm. De combinatie van korte lengte en kleine deeltjes geeft de gewenste hoge plaatcapaciteit per minuut. Voor analyses met extreem hoge gevoeligheid worden ook smallere kolommen (1,0 mm i.d.) of capillaire en nano-LC ingezet.
Bij het werken met UHPLC zijn enkele aspecten kritisch voor consistente prestaties. Het extra-kolomvolume (dwell volume en de volumes van leidingen, injector en detectorcel) moet zo klein mogelijk zijn — anders gaat de winst in piekbreedte verloren door verbreding buiten de kolom. Gebruik altijd de fabrikantsfittingen en goed gesneden capillaire leidingen met de juiste binnendiameter. Filter elke mobiele fase door een 0,22 µm membraanfilter en ontgas voor gebruik om gasbellen te voorkomen die bij hoge druk vooral problematisch zijn.
Monstervoorbereiding is bij UHPLC belangrijker dan bij HPLC: deeltjes > 0,2 µm in het monster verstoppen de kolominlaat. Filter monsters altijd door een 0,2 µm spuitfilter, of pas solid-phase-extractie (SPE) toe voor matrixzuivering. Spoel de kolom na gebruik volgens fabrikantsprotocol en sla deze op in het aanbevolen bewaaroplosmiddel.
Het fundamentele verschil is de deeltjesgrootte van de stationaire fase en de bijbehorende systeemdruk. HPLC werkt met deeltjes van 3–5 µm bij drukken tot circa 400 bar; UHPLC gebruikt sub-2-µm deeltjes (typisch 1,7–1,8 µm) bij drukken tot 1300–1500 bar. Door de kleinere deeltjes zijn de chromatografische pieken smaller, de resolutie hoger en de analysetijden korter — bij gelijkblijvende of betere scheidingskwaliteit. In de praktijk betekent dit dat een HPLC-analyse van 20 minuten op UHPLC teruggebracht kan worden naar 2–4 minuten. De keerzijde is dat UHPLC-apparatuur en -kolommen duurder zijn en dat de methode-overdracht van HPLC naar UHPLC zorgvuldige optimalisatie vereist. Voor laboratoria met hoge monsterdoorvoer wegen de snelheids- en oplosmiddelbesparingen doorgaans op tegen de hogere investering.
UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography) is een geregistreerde handelsnaam van Waters Corporation, geïntroduceerd in 2004 bij de lancering van het Acquity UPLC-systeem. Het was de eerste commercieel beschikbare vloeistofchromatograaf die routinematig met sub-2-µm deeltjes en drukken boven 600 bar kon werken. Andere fabrikanten — zoals Agilent (Infinity), Shimadzu (Nexera) en Thermo Fisher (Vanquish) — brachten later vergelijkbare systemen op de markt onder eigen namen. De merkneutrale, overkoepelende term voor al deze systemen is UHPLC. Technisch zijn UPLC en UHPLC identiek: beide verwijzen naar het principe van sub-2-µm deeltjes bij hoge druk. In wetenschappelijke literatuur wordt de term UHPLC doorgaans gebruikt om leveranciersonafhankelijkheid te benadrukken; in commerciële contexten blijft UPLC de Waters-specifieke aanduiding.
De Van Deemter-vergelijking beschrijft de kolomefficiëntie als functie van de flowsnelheid: H = A + B/u + C·u, waarbij H de plaathoogte is (maat voor piekbreedte) en u de lineaire stroomsnelheid van de mobiele fase. Een lagere plaathoogte betekent een scherpere piek en een betere scheiding. De drie termen vertegenwoordigen respectievelijk Eddy-diffusie (A), longitudinale diffusie (B/u) en massaoverdrachtsweerstand (C·u). Bij grotere deeltjes domineert de C-term bij hoge flowsnelheden, waardoor de efficiëntie snel afneemt als de snelheid toeneemt. Bij sub-2-µm deeltjes — zoals gebruikt in UHPLC — is de C-term aanzienlijk kleiner doordat de analytmoleculen minder ver hoeven te diffunderen om de stationaire fase te bereiken. Dit verplaatst het optimum van de Van Deemter-curve naar hogere flowsnelheden en maakt tegelijkertijd de curve vlakker. Concreet: UHPLC kan bij twee tot vijf keer hogere stroomsnelheid worden uitgevoerd zonder verlies van resolutie, wat de analysetijd met diezelfde factor verkort.
Ja, maar het vereist aanpassing van de methode — u kunt een bestaande HPLC-methode niet één-op-één op een UHPLC-systeem draaien. De voornaamste aandachtspunten bij de overdracht zijn: (1) kolomdimensies — een UHPLC-kolom is korter en smaller dan de HPLC-kolom; om eenzelfde resolutie te behalen berekent u de equivalente lengte op basis van de deeltjesgrootteverhouding; (2) flowsnelheid — de optimale flowsnelheid verandert bij kleinere deeltjes; schaal de flow aan op de kolomdiameter (flow ∝ d²); (3) gradiëntprogramma — de kortere kolomlengte en hogere flowsnelheid comprimeren de gradiënt; pas de tijdas proportioneel aan; (4) injectievolume — door smallere pieken is het maximale injectievolume lager; gebruik typisch 1–5 µl bij een 2,1 mm kolom; (5) dwell volume — het dwell volume van het UHPLC-systeem kan de gradiëntstart vertragen; meet dit na en corrigeer zo nodig in het programma. Fabrikanten als Waters, Agilent en Thermo Fisher bieden conversieprogramma's en rekenhulpmiddelen aan die de omrekening stap voor stap begeleiden. Valideer de methode conform ICH Q2(R1) na de overdracht.
De meest gebruikte UHPLC-kolom is een C18-fase op volledig poreus silica met een deeltjesgrootte van 1,7–1,8 µm, in een dimensie van 50–150 mm × 2,1 mm i.d. Dit is de directe equivalent van de klassieke C18-kolom in HPLC en geschikt voor het overgrote deel van omgekeerde-fase toepassingen. Naast de volledig poreuze variant zijn er core-shell deeltjes (SPP) met vergelijkbare efficiëntie maar iets lagere tegendruk — bruikbaar op zowel HPLC als UHPLC. Voor polaire verbindingen die op C18 niet retineren, zijn UHPLC-kolommen met HILIC-modificatie (zwitterionisch, amide, diol) beschikbaar. Voor chirale scheidingen bestaan UHPLC-compatibele chirale kolommen op polysaccharide- of macrocyclische antibioticarichtlijnen. Bij de keuze spelen naast de chemie ook de drukbestendigheid (minimaal 1000 bar voor echte UHPLC-toepassingen) en de kolom-thermostat-compatibiliteit een rol.
Extra-kolomvolume is het totale volume buiten de kolom zelf — de volumes in de injectieringlus, verbindingskapillaren, detectorcel en eventuele schakelaars — waardoorheen het monster passeert voor en na de kolom. In een conventioneel HPLC-systeem is dit volume (typisch 50–200 µl) klein ten opzichte van de brede pieken die de kolom produceert. Bij UHPLC zijn de pieken echter slechts enkele microliters breed aan de basis. Eenzelfde extra-kolomvolume veroorzaakt dan een relatief grote piekverbreding die de efficiëntiewinst van de sub-2-µm deeltjes tenietdoet. Dwell volume — het volume tussen de mengpomp en de kolomkop — veroorzaakt een vertraging bij het starten van een gradiënt, wat leidt tot verschuiving van retentietijden bij de methodeoverdracht van HPLC naar UHPLC. UHPLC-systemen zijn dan ook specifiek ontworpen met minimale interne volumes: korte, smalle verbindingskapillaren (typisch 0,075–0,13 mm i.d.), kleine injectielusen en compacte detectorcellen. Gebruik uitsluitend de door de fabrikant aanbevolen fittingen en leidingen; het zelf vervangen door een te ruime leiding vernietigt de piekscherpte.
UHPLC is het meest voordelig bij toepassingen met hoge monsterdoorvoer, lage detectielimieten of complexe mengsels waarbij hoge resolutie vereist is. Voor eenvoudige routinemetingen met beperkte monsteraantallen biedt een conventioneel HPLC-systeem een lagere drempel in aanschaf en onderhoud. Verbindingen met een lage stabiliteit bij hoge druk — sommige biologische macromoleculen — kunnen bij UHPLC-drukken ontaarden of aggregeren; hier kan een langzamere HPLC-methode of een systeem met lagere maximumdruk de voorkeur hebben. Voor sterk polaire verbindingen die op C18 niet retineren, is UHPLC met een HILIC-kolom de aangewezen keuze. Voor molecuulgewichtskarakterisering van polymeren en eiwitten is grootte-exclusiechromatografie (SEC/GPC) de aanvulling, eventueel ook in UHPLC-uitvoering.
In de klinische hematologie is HPLC de standaardmethode voor de analyse van hemoglobine-varianten in bloed. De meest uitgevoerde test is de bepaling van HbA1c — het geglycosyleerde hemoglobine dat als maat voor de langetermijnbloedsuikerregulatie bij diabetespatiënten wordt gebruikt. Naast HbA1c-meting wordt HPLC gebruikt voor de detectie en kwantificering van abnormale hemoglobinevormen zoals HbS (sikkelcelziekte), HbC en HbE, en voor de diagnostiek van thalassemie. Bij thalassemie is de verhouding tussen de hemoglobine-subtypen HbA, HbA2 en HbF verstoord; HPLC-analyse van een bloedmonster scheidt deze fracties snel en nauwkeurig op basis van hun ladingsverschillen via kationenuitwisselingschromatografie. Het resultaat is een chromatogram met karakteristieke pieken waarvan de oppervlakte de procentuele samenstelling weergeeft. Deze klinische toepassing heeft niets te maken met omgekeerde-fase HPLC of sub-2-µm deeltjes — het is een ionenwisselingstechniek op geautomatiseerde hematologie-analysatoren — maar valt technisch wel onder de brede categorie vloeistofchromatografie. Zie ook het overzichtsartikel over vloeistofchromatografie voor een breder perspectief op de verschillende scheidingsmechanismen.
De bediening van een HPLC- of UHPLC-systeem verloopt doorgaans via de bijbehorende software (zoals Empower, OpenLAB of MassLynx), maar de praktische stappen zijn voor de meeste systemen vergelijkbaar. Vóór de eerste injectie spoelt u de mobiele-faselijnen door om luchtbellen te verwijderen, equilibreert u de kolom met de startsamenstelling van de mobiele fase (minimaal 5–10 kolomvolumes) en controleert u of de druk stabiel is en de basislijn vlak. Stel de juiste methode in: kolomtemperatuur, flowsnelheid, gradiëntprogramma en detectorgolflengte. Bij UHPLC is het extra-kolomvolume kritisch — gebruik uitsluitend de door de fabrikant meegeleverde fittingen en verbindingskapillaren om piekverbreding buiten de kolom te voorkomen. Bereid het monster voor (filtreer door 0,2 µm spuitfilter), stel het injectievolume in (typisch 1–5 µl bij een 2,1 mm UHPLC-kolom) en start de reeks via de autosampler. Controleer tijdens de run de systeemdruk: een geleidelijk stijgende druk wijst op kolomvervuiling of filterverstoppingen; een abrupte drukstijging kan duiden op een luchtbel of een geblokkeerde frit. Spoel de kolom na afloop van de reeks met het door de fabrikant aanbevolen bewaaroplosmiddel en leg eventuele afwijkingen in het systeemlogboek vast. Raadpleeg voor specifieke instructies altijd de handleiding van uw systeem en de kolomdocumentatie van de fabrikant.
UHPLC biedt aanzienlijke voordelen in snelheid en resolutie, maar kent ook beperkingen die relevant zijn bij de keuze voor deze techniek. De aanschafprijs van een UHPLC-systeem ligt hoger dan die van een conventioneel HPLC-systeem, en sub-2-µm kolommen kosten meer per stuk en hebben een kortere levensduur bij vuile matrices. De methode-overdracht van een bestaande HPLC-methode naar UHPLC vereist zorgvuldige herberekening van kolomdimensies, flowsnelheid, gradiëntprogramma en injectievolume — een één-op-één overdracht is niet mogelijk. Het extra-kolomvolume van leidingen, injector en detectorcel moet minimaal zijn, wat hogere eisen stelt aan installatie en onderhoud. Monstervoorbereiding is strikter: deeltjes groter dan 0,2 µm verstoppen de kolominlaat sneller dan bij HPLC. Tot slot zijn sommige biologische macromoleculen gevoelig voor de hoge drukken die UHPLC genereert, waardoor een lagere drukvariant de voorkeur kan verdienen.
Omgekeerde-fase HPLC en UHPLC zijn geen alternatieven voor elkaar — het zijn twee verschillende begrippen die elkaar overlappen. Omgekeerde-fase (RP-HPLC) verwijst naar het scheidingsmechanisme: een apolaire stationaire fase (doorgaans C18 of C8) in combinatie met een polaire waterige mobiele fase, waarbij hydrofobe verbindingen langer worden vastgehouden. UHPLC verwijst naar de technische uitvoering: sub-2-µm deeltjes bij hoge systeemdruk voor snellere en scherpere scheidingen. Een UHPLC-systeem wordt in de meeste gevallen juist ingezet met een omgekeerde-fase C18-kolom: de combinatie RP-UHPLC is daarmee de meest voorkomende opstelling in de praktijk. Naast omgekeerde fase zijn ook andere scheidingsmechanismen beschikbaar in UHPLC-uitvoering, zoals HILIC voor polaire verbindingen en chirale kolommen voor enantiomeerscreiding.
UHPLC vormt samen met conventionele HPLC, capillaire LC en nano-LC een continuüm aan vloeistofchromatografische technieken die zich onderscheiden in deeltjesgrootte, kolomdimensies en flowbereik. Voor een breder overzicht van het vakgebied, zie het artikel over vloeistofchromatografie. Wie de techniek vanaf de basis wil leren begrijpen, vindt de fundamenten terug in de klassieke kolomchromatografie — alle moderne vormen van LC bouwen voort op hetzelfde scheidingsprincipe.
Bekijk het assortiment chromatografiebenodigdheden of neem contact op voor advies over de juiste opstelling voor uw toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
