Proximity ligation assays zijn moleculaire technieken waarmee de driedimensionale organisatie van het genoom in de celkern wordt onderzocht. De bekendste vertegenwoordigers zijn 3C (Chromosome Conformation Capture), Hi-C en een reeks afgeleide methoden die samen het veld van de chromosoomconformatiebepaling vormen. In tegenstelling tot sequencingmethoden die de lineaire volgorde van het DNA bepalen, brengen proximity ligation assays in kaart welke genomische regio's fysiek nabij elkaar zijn in de celkern — ook al liggen ze ver van elkaar verwijderd op het chromosoom.
De techniek combineert formaldehyde-crosslinking, enzymatische restrictie-digestie, intramoleculaire ligation en sequencing via next-generation sequencing (NGS) om paargewijze contacten tussen chromatinesegmenten te detecteren. De resulterende contactmatrices geven inzicht in chromatinecompartimenten, topologisch geassocieerde domeinen (TADs), enhancer-promotorcontacten en de organisatie van chromosomen in chromosoomgebieden (chromosome territories).
Het menselijk genoom bestaat uit ongeveer 3 miljard basenparen en moet worden gecompacteerd in een celkern van enkele micrometers doorsnede. Deze compactie is niet willekeurig: het genoom is hiërarchisch georganiseerd op meerdere schaalniveaus. DNA is gewikkeld rond histonoctameren tot nucleosomen, nucleosomen zijn gecondenseerd tot chromatinefilamenten, en chromatinefilamenten zijn verder gevouwen tot grotere structuren zoals loops, TADs en chromosoomgebieden.
Deze driedimensionale architectuur is functioneel relevant. Enhancers — regulatoire DNA-sequenties die de activiteit van genen beïnvloeden — werken vaak over grote afstanden en vereisen fysiek contact met de promotor van het doelgen. Fouten in deze contacten, bijvoorbeeld door mutaties in bindingsplaatsen voor het structurele eiwit CTCF of door chromosomale herrangschikkingen, zijn geassocieerd met ziekten zoals kanker en aangeboren afwijkingen. Proximity ligation assays bieden de meest directe manier om dergelijke contacten in bulk of op celniveau te meten.
De 3C-methode, in 2002 gepubliceerd door Dekker en collega's, vormt de basis voor alle afgeleide technieken. De workflow bestaat uit vier kernstappen.
Cellen worden behandeld met formaldehyde (doorgaans 1–2% gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur). Formaldehyde vormt covalente bindingen tussen eiwitten onderling en tussen eiwitten en DNA, waardoor fysieke contacten in de celkern worden gefixeerd. Na quenching met glycine wordt het chromatine geïsoleerd.
Het gecrosslinkte chromatine wordt onder denaturing-condities (lysaat) gedigereerd met een frequent-snijdend restrictie-enzym, zoals HindIII, DpnII of MboI. Dit genereert kortere chromatinefragmenten terwijl de fysieke contacten door crosslinking behouden blijven.
Onder sterk verdunde condities worden de gefragmenteerde, maar nog crossgelinkte chromatine-uiteinden met T4-DNA-ligase samengevoegd (ligation). Door de sterke verdunning is intramoleculaire ligation — dat wil zeggen ligation tussen twee fragmenten die door crosslinking in elkaars nabijheid zijn gebracht — statistisch begunstigd boven intermoleculaire ligation van willekeurige fragmenten. Zo worden ligation-producten gevormd die de genomische contacten representeren.
Na omzetting van de crosslinks (proteinase K en warmtebehandeling) en zuivering van het DNA worden de ligatiepunten gedetecteerd. In de originele 3C-methode gebeurt dit met locus-specifieke PCR: twee primers op aparte loci amplificeren alleen als die loci zijn geligeerd, wat een kwalitatief contact aantoont. In 4C, 5C en Hi-C wordt dit uitgebreid naar genoom-brede detectie.
Het onderscheidende kenmerk van Hi-C ten opzichte van de originele 3C-methode is de introductie van een biotine-gelabeld nucleotide tijdens de fill-in van de restrictie-uiteinden. Na ligation zijn de ligation-juncties daardoor biotine-gelabeld. Door streptavidine-magnetische beads te gebruiken wordt deze subset van DNA-moleculen selectief opgewerkt, wat de achtergrond van niet-ligeerde fragmenten drastisch reduceert.
Na sequencing (paired-end, zodat beide zijden van het ligation-product worden bepaald) worden de reads gemapt op het referentiegenoom. Elk goed gemapt paar wordt vertaald naar een contacten-paar: genomisch locus A in contact met genomisch locus B. Door alle paren samen te voegen ontstaat een contactmatrix — een symmetrische N×N-matrix waarbij N het aantal genomische intervallen (bins) is en de waarde in elke cel het aantal gedetecteerde contacten vertegenwoordigt.
Normalisatie van de contactmatrix is essentieel omdat schijnbare verschillen in contactfrequentie kunnen ontstaan door GC-gehalte, mappabiliteit en lokale chromatinebeschikbaarheid. Veelgebruikte normalisatiemethoden zijn ICE (Iterative Correction and Eigenvector decomposition) en KR (Knight-Ruiz).
Op megabase-schaal splitst het genoom in twee compartimenten: compartiment A (transcriptioneel actief, euchromatine, hoog H3K27ac) en compartiment B (transcriptioneel inactief, heterochromatin). In de contactmatrix zijn A-A- en B-B-contacten verrijkt; A-B-contacten zijn verarmd. Compartiment-identiteit is celtype-specifiek en verandert bij differentiatie en bij ziekte.
Op een schaal van honderd kilobasen tot enkele megabasen zijn regio's zichtbaar met sterk verhoogde intra-domein-contactfrequentie: de TADs. TAD-grenzen worden veelal afgebakend door het CTCF-eiwit en cohesinecomplexen, die via een mechanisme van loop extrusion de grenzen actief handhaven. TADs zijn evolutionair geconserveerd en structureren de regulatoire landschappen van genen: enhancers en genen in hetzelfde TAD interacteren preferentieel, terwijl contacten over TAD-grenzen heen zijn onderdrukt.
Binnen TADs zijn discrete loops zichtbaar als verhoogde contactfrequentie tussen twee specifieke loci — zichtbaar als puntachtige verrijkingen (dots) in de Hi-C-matrix. Veel van deze lussen verbinden een enhancer met een promotor en zijn afhankelijk van CTCF en cohesinebinding aan de ankerpunten. Verstoring van ankerpunten door mutatie of deletie kan leiden tot ectopische enhancer-promotorcontacten en activering van proto-oncogenen.
Op de hoogste schaalniveaus occupeert elk chromosoom een voorkeurspositie in de celkern (chromosome territory). Transcriptioneel actieve chromosomen bevinden zich doorgaans centraal; inactieve chromosomen zijn perifeer. Hi-C bevestigt deze organisatie door lage interchromosomale contactfrequentie en hoge intrachromosomale contactfrequentie.
Een Hi-C-experiment vereist specifieke apparatuur en verbruiksartikelen die gedeeltelijk overlappen met die van andere epigenomische technieken zoals chromatine-immunoprecipitatie (ChIP).
Voor de formaldehyde-crosslinking stap zijn roterende incubatoren of schudders bij kamertemperatuur nodig. De reactie wordt gestopt met glycine; vervolgens worden cellen door centrifugatie geoogst. Efficiënte cellysis vereist een Dounce-homogenisator of vergelijkbaar mechanisch lysisinstrument. Magnetische bead-werkstations (voor streptavidine-pulldown in Hi-C) zijn essentieel in latere stappen.
Frequent-snijdende restrictie-enzymen (HindIII, MboI, DpnII) zijn de meest gebruikte. Bij Micro-C wordt micrococcale nuclease (MNase) gebruikt voor digestie tot mononucleosomen. Waterbaden met nauwkeurige temperatuurregeling (37 °C) zijn vereist voor consistente digestie-efficiëntie.
Na ligation en crosslink-omzetting worden de DNA-libraries gezuiverd via AMPure XP-beads (of equivalenten). Kwaliteitscontrole van de fragmentverdeling geschiedt via gelelectroforese (agarosegel voor grovere controle) of via geautomatiseerde elektroforese (Bioanalyzer/TapeStation). Kwantificering van de bibliotheek voorafgaand aan sequencing vereist fluorimetrische methoden (Qubit) of qPCR met sequencing-adaptorspecifieke primers.
Hi-C vereist paired-end sequencing met voldoende leeslengte (doorgaans 2 × 50 bp volstaat; grotere leeslengten verbeteren mappabiliteit in repetitieve regio's) via next-generation sequencing (NGS). De vereiste sequencingdiepte is aanzienlijk: voor 1 kb-resolutie zijn typisch 4–6 miljard gemapt uniek contactpaar nodig; voor 10 kb-resolutie volstaat 200–500 miljoen paren.
Hi-C-data-analyse vereist gespecialiseerde pipeline-stappen die verder gaan dan standaard NGS-analyse. Na kwaliteitscontrole (FastQC) en trimming worden reads afzonderlijk gemapt op het referentiegenoom. Contactparen worden gefilterd op PCR-duplicaten en on-geldig gemapt reads. Veelgebruikte tools zijn HiC-Pro, Juicer, distiller-nf (4DN-standaard) en pairtools. Contactmatrices worden opgeslagen in .hic- of .cool-formaat en gevisualiseerd via Juicebox, HiGlass of cooltools.
Voor TAD-calling worden methoden zoals directionality index (DI), insulation score en HiCExplorer gebruikt. Voor loop-calling zijn HiCCUPS (onderdeel van Juicer) en Mustache ingeburgerd. Compartiment-analyse gebeurt door eigenvector-decompositie van de genormaliseerde contactmatrix.
Bulk Hi-C gemiddelt over miljoenen cellen en verliest celtype-specifieke heterogeniteit. Single-cell Hi-C (scHi-C) en daarvan afgeleide methoden (Dip-C, sn-m3C-seq) lossen contactmatrices op per cel. Omdat elke cel slechts een beperkt aantal contactparen genereert (typisch 10.000–200.000), vereist scHi-C gespecialiseerde imputation- en clusteringmethoden. In combinatie met FISH-validatie kunnen voorspelde chromatinelussen en compartimenten op celniveau worden bevestigd.
Multiome-protocollen combineren Hi-C met RNA-expressie (snRNA-seq) of chromatinetoegankelijkheid (ATAC-seq) uit dezelfde cel, wat directe koppeling van 3D-genoomstructuur aan genexpressie mogelijk maakt. Proximity ligation assays sluiten zo aan op het bredere ecosysteem van epigenomische en transcriptomische methoden, vergelijkbaar met de relatie tussen ChIP en andere epigenomische profieleringstechnieken.
Een van de meest directe toepassingen van proximity ligation assays is het in kaart brengen van fysieke contacten tussen enhancers en hun doelpromotoren. Hi-C en HiChIP (met antilichamen tegen het actieve enhancermark H3K27ac) worden gebruikt om enhancercontactomen te bepalen en te correleren met expressieprofielen uit RNA-seq.
Structurele varianten — translocaties, inversies, amplificaties — herschikken de 3D-genoomarchitectuur. Hi-C kan dergelijke varianten detecteren en de functionele gevolgen ervan voor TAD-integriteit en enhancer-hijacking in kaart brengen. Fusiegenen die voortkomen uit translocaties (BCR-ABL, ETV6-RUNX1) resulteren in aantoonbaar verhoogde interchromosomale contactfrequenties in Hi-C-data.
Gedurende differentiatie en embryonale ontwikkeling ondergaat de 3D-genoomarchitectuur dramatische herorganisatie. In zygoten na de bevruchting is het genoom aanvankelijk relatief gedestructureerd — TADs en compartimenten zijn zwak gedefinieerd — en acquireert de karakteristieke structuur pas geleidelijk tijdens embryonale ontwikkeling. Proximity ligation assays zijn onmisbaar voor het begrijpen van deze processen.
Recente bevindingen suggereren dat transcriptionele activatie en heterochromatinevorming worden gefaciliteerd door biomoleculaire fase-scheiding: eiwitten met intrinsiek gestructureerde domeinen condenseren in druppels die genomische elementen concentreren. Hi-C en zijn varianten worden gebruikt om te onderzoeken hoe condensaatvorming de 3D-genoomorganisatie beïnvloedt.
Proximity ligation assays kennen een aantal inherente beperkingen die de interpretatie van resultaten beïnvloeden. Ten eerste meten zij gemiddelde contactfrequenties over een grote celpopulatie: een contactfrequentie van 5% betekent niet dat de lus in 5% van de cellen aanwezig is, maar dat de gemiddelde populatie-brede kans op contact 5% is — de werkelijke distributie over cellen kan sterk van het gemiddelde afwijken. Ten tweede zijn formaldehyde-crosslinking en de daarmee samenhangende verwerkingsstappen bronnen van variabiliteit en technische artefacten.
De sequencingdiepte die vereist is voor hoge resolutie is substantieel en daarmee kostenintensief. Bovendien is de bioinformatische analyse niet triviaal en vereist aanzienlijke rekencapaciteit (RAM voor het inladen van contactmatrices). Ten slotte correleert de contactfrequentie niet direct met de frequentie van fysieke nabijheid in de celkern — correlatieanalyse met FISH-gebaseerde afstandsmetingen is aanbevolen voor validatie van specifieke contacten.
Voor het uitvoeren van proximity ligation assays zijn de volgende categorieën laboratoriumbenodigdheden essentieel: centrifuges voor celoogsting en DNA-zuivering; schudders en roterende wielen voor crosslinking en incubatiestappen; thermomixers of waterbaden voor enzymatische reacties bij gecontroleerde temperatuur; magnetische bead-stations (magneetracks) voor beadgebaseerde selectie en zuivering; gelelectroforese-apparatuur voor kwaliteitscontrole van chromatinefragmenten en library-product; pipetten en laagbindende microtubes (LoBind-kwaliteit) om verlies van gering materiaal te beperken; PCR-apparatuur voor library-amplificatie en voor 3C-gebaseerde PCR-detectie. Labvakhandel levert diverse van deze producten; neemt u contact op voor beschikbaarheid en advies.
3C (Chromosome Conformation Capture) is de basisversie van de techniek en detecteert contacten tussen twee specifieke loci via locus-specifieke PCR. Hi-C breidt dit uit naar het volledige genoom door biotine-markering van ligation-juncties en paired-end sequencing. Hi-C genereert een genoom-brede contactmatrix, terwijl 3C slechts gerichte vragen kan beantwoorden.
Topologisch geassocieerde domeinen (TADs) zijn genomische regio's met sterk verhoogde intra-domein-contactfrequentie, doorgaans 100 kb tot enkele Mb groot. Ze fungeren als regulatoire eenheden: enhancers en genen in hetzelfde TAD interacteren preferentieel. Verstoring van TAD-grenzen — bijvoorbeeld door mutaties in CTCF-bindingsplaatsen of door chromosomale deleties — kan ectopische enhancer-promotorcontacten veroorzaken en bijdragen aan ziekte.
Traditionele Hi-C-protocollen vereisen 1–10 miljoen cellen per conditie. Recente ontwikkelingen in low-input Hi-C (zoals Micro-C, sn-Hi-C en Dip-C) maken experimenten mogelijk met duizenden tot honderden cellen. Single-cell Hi-C werkt met individuele cellen, maar levert slechts 10.000–200.000 contactparen per cel, wat speciale analysemethoden vereist.
Hi-C meet alle chromatinecontacten zonder selectie op een specifiek eiwit. HiChIP voegt na de ligation-stap een immunoprecipitatiestap toe met een eiwit-specifiek antilichaam (zoals anti-H3K27ac of anti-CTCF), waardoor alleen contacten worden gedetecteerd die via dat specifieke eiwit worden gemedieerd. HiChIP vereist minder celmateriaal dan Hi-C voor vergelijkbare resolutie van eiwitgemedieerde lussen.
Ja. Multiome-protocollen combineren Hi-C met RNA-seq of ATAC-seq uit dezelfde cel of hetzelfde monster. Methoden zoals SPRITE en GRID-seq detecteren simultaan RNA-DNA-DNA-contacten. Deze gecombineerde benaderingen maken directe koppeling van 3D-genoomstructuur aan genexpressie en chromatinetoegankelijkheid mogelijk.
Proximity ligation assays sluiten nauw aan bij andere epigenomische en moleculaire technieken in de Labvakhandel-kennisbank. Voor de detectie van eiwit-DNA-bindingslocaties en histonmodificaties, zie het artikel over chromatine-immunoprecipitatie (ChIP). Voor de sequencinganalyse van Hi-C-libraries en verwante NGS-toepassingen, zie het artikel over next-generation sequencing (NGS). Voor de visuele validatie van chromosomale locaties in intacte cellen, zie het artikel over FISH — fluorescentie-in-situ-hybridisatie. Voor kwaliteitscontrole van chromatinefragmenten en library-producten, zie het artikel over gelelectroforese. Voor kwantificering en verificatie van specifieke loci na 3C, zie het artikel over qPCR / real-time PCR. Voor de fragmentatie van chromatine via sonicatie als alternatief voor enzymatische digestie, zie het artikel over sonicatie in het laboratorium.
Disclaimer: de informatie op deze pagina is bedoeld voor educatieve doeleinden en geeft een overzicht van proximity ligation assays op basis van geldende vakliteratuur en gangbare labpraktijken. Raadpleeg voor specifieke toepassingen altijd de meest recente wetenschappelijke literatuur, de documentatie van de gebruikte kitsupplier en de voorschriften van uw instelling. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl is niet aansprakelijk voor de toepassing van deze informatie in specifieke onderzoeks- of diagnostische situaties.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
