Hydrofiele interactiechromatografie, internationaal aangeduid als HILIC (Hydrophilic Interaction Liquid Chromatography), is een vloeistofchromatografische techniek die speciaal is ontwikkeld voor de scheiding van sterk polaire en hydrofiele verbindingen. Verbindingen als aminozuren, suikers, nucleotiden en polaire geneesmiddelen vertonen op een conventionele C18-kolom weinig of geen retentie, waardoor omgekeerde-fase HPLC voor deze analytklassen tekortschiet. HILIC vult dat hiaat op en wint dan ook sterk terrein als aanvulling op — en soms als alternatief voor — omgekeerde-fase HPLC. Dit artikel beschrijft het retentiemechanisme, de kolomtypen, de mobiele fase, de koppeling aan massaspectrometrie en de belangrijkste toepassingen. Aanvullende achtergrond over de overkoepelende techniek vindt u in ons artikel over HPLC en over vloeistofchromatografie.
Het scheidingsprincipe van HILIC is in essentie omgekeerd aan dat van omgekeerde-fase chromatografie. De stationaire fase is polair — doorgaans ongemodificeerd silicagel, een diol-, amide- of zwitterionische modificatie — terwijl de mobiele fase overwegend organisch is, veelal acetonitril met een waterig aandeel van 5 tot 40 procent. Aan de polaire stationaire fase adsorbeert een dunne, waterrijke vloeistoflaag: de zogenoemde geïmmobiliseerde of geadsorbeerde waterlaag. Polaire analyt-moleculen distribueren bij voorkeur in deze waterrijke laag en worden daardoor geretineerd, terwijl apolaire verbindingen nauwelijks interactie aangaan en snel elueren. Dit partitie-mechanisme — waarbij de verdeling van de analyt tussen de organisch-rijke mobiele fase en de waterrijke geïmmobiliseerde laag bepalend is voor de retentie — wordt aangevuld door adsorptie aan de stationaire fase zelf en, bij geladen analyt-moleculen, door elektrostatische wisselwerking.
De elutievolgorde is omgekeerd ten opzichte van omgekeerde-fase: apolaire verbindingen elueren als eerste, polaire verbindingen het laatste. Elutie wordt gestimuleerd door meer water aan de mobiele fase toe te voegen: water is het sterke eluent in HILIC, acetonitril het zwakke. Dit is precies het tegenovergestelde van omgekeerde-fase HPLC, waar acetonitril de elutiekracht verhoogt.
Niet elke polaire stationaire fase gedraagt zich identiek. De keuze van de HILIC-kolom is bepalend voor selectiviteit, retentie en stabiliteit. De meest gebruikte kolomtypen zijn:
Ongemodificeerd silicagel is de eenvoudigste HILIC-fase. De vrije silanolgroepen op het silicaoppervlak zijn sterk polair en vormen gemakkelijk een waterrijke laag. Ongemodificeerd silica levert goede retentie voor basische verbindingen maar kan lijden aan piekstaartvorming door ongewenste ionenwisseling aan vrije silanolgroepen. Basische analyten worden bovendien sterk geretineerd ten opzichte van neutrale verbindingen.
Diolkolommen bevatten gebonden diol-liganden (—CH(OH)—CH(OH)—) die een waterrijke laag stabiliseren zonder de ionenwisselende eigenschappen van vrij silica. Diol-HILIC is geschikt voor een breed spectrum aan polaire analyten en biedt reproduceerbare retentie bij verschillende pH-waarden.
Amide-kolommen (met een carboxamide-functionaliteit) zijn bijzonder geschikt voor suikers en oligosachariden en geven selectief retentie voor verbindingen met veel hydroxylgroepen. Ze worden veel gebruikt in de suikeranalyse van levensmiddelen en in de farmaceutische analyse van glycosyleerde verbindingen.
Zwitterionische kolommen bevatten zowel positief als negatief geladen groepen op het oppervlak. Door de tegengestelde ladingen heffen deze elkaar op, waardoor puur hydrofiele partitie domineert en ionenwisseling minimaal is. Zwitterionische HILIC-fasen worden ingezet voor een breed bereik aan polaire verbindingen inclusief aminozuren, peptiden en nucleotiden, en zijn bijzonder stabiel over een breed pH-bereik.
Aminokolommen bevatten gebonden aminopropyl-groepen (—NH2) en zijn traditioneel gebruikt voor suikeranalyse. Ze kunnen echter irreversibel reageren met reducerende suikers (Schiff-basisvorming), wat de levensduur van de kolom beperkt. Moderne alternatieven — amide en zwitterionisch — hebben de aminokolom grotendeels verdrongen voor suikeranalyse, al zijn aminokolommen nog steeds in gebruik voor specifieke toepassingen.
Cyanokolommen (CN-fase) gedragen zich in een hoog-organische mobiele fase als HILIC-fase maar wisselen bij hogere watergehalten over naar omgekeerde-fase gedrag. Ze zijn minder selectief voor sterk polaire verbindingen maar bieden flexibiliteit in methode-ontwikkeling.
De mobiele fase in HILIC bestaat doorgaans uit acetonitril (ACN) als organisch bestanddeel en water of een waterige bufferoplossing als aquatisch bestanddeel, in een verhouding van 60:40 tot 97:3 (ACN:water). Methanol kan worden gebruikt maar heeft een sterkere elutiekracht dan acetonitril en levert doorgaans kortere retentietijden. Het watergehalte bij de start van de analyse bepaalt de dikte van de geïmmobiliseerde waterrijke laag en daarmee de retentie: minder water leidt tot meer retentie.
Een waterige buffer is in de meeste gevallen noodzakelijk om de pH te controleren en ionenwisselende bijdragen van de stationaire fase te minimaliseren. De meest gebruikte buffers voor HILIC zijn ammoniumformiaat (pH 3–5) en ammoniumacetaat (pH 4,5–7). Beide buffers zijn volledig vluchtig en daardoor uitstekend verenigbaar met massaspectrometrische detectie. Niet-vluchtige fosfaat- of sulfaatbuffers — die in omgekeerde-fase HPLC soms worden gebruikt — zijn in HILIC met MS-koppeling uit den boze.
Gradiëntelutie in HILIC verloopt van een hoog ACN-gehalte (weinig water, hoge retentie) naar een hoger watergehalte (lagere retentie, elutiestimulering). Na de gradiënt moet de kolom worden geëquilibreerd in de begincondities. Equilibratie duurt bij HILIC beduidend langer dan bij omgekeerde-fase HPLC: doorgaans 30 tot 50 kolomvolumes zijn nodig om de waterrijke laag opnieuw in evenwicht te brengen. Deze lange equilibratietijd is een van de praktische nadelen van HILIC in vergelijking met RP-HPLC.
Een van de grote voordelen van HILIC ten opzichte van ionenchromatografie — de andere techniek voor polaire verbindingen — is de uitstekende compatibiliteit met elektrospray-ionisatie massaspectrometrie (ESI-MS). De hoog-organische, vluchtige mobiele fase verdampt efficiënt in de ESI-bron, waardoor de ionisatie-efficiëntie hoog is en ionenonderdrukking door matrixcomponenten beperkt blijft. Analysemethoden die HILIC koppelen aan LC-MS/MS bieden daarmee zowel hoge gevoeligheid voor hydrofiele verbindingen als selectieve kwantificering in complexe matrices zoals plasma, urine en voedselextracten. Meer over de koppeling aan massaspectrometrie leest u in ons artikel over LC-MS en LC-MS/MS.
Een aandachtspunt bij HILIC-MS is de vorming van adducten: ammoniumadducten [M+NH₁]⁺ zijn bij ammoniumformiaat- en ammoniumacetatbuffers frequent aanwezig. Dit is overigens bij de interpretatie van spectra goed te hanteren en in veel gevallen een herkenbaar en reproduceerbaar patroon dat de identificatie juist vergemakkelijkt.
HILIC wordt steeds vaker ingezet als eerste dimensie in tweedimensionale vloeistofchromatografie, gekoppeld aan omgekeerde-fase HPLC als tweede dimensie. Omdat HILIC scheidt op polariteit en omgekeerde-fase op hydrofobiciteit, zijn beide scheidingsmechanismen nagenoeg orthogonaal: verbindingen die in één dimensie co-elueren, worden in de andere dimensie doorgaans wel gescheiden. Deze HILIC × RP-LC combinatie is breed ingezet in metabolomics en in de farmaceutische analyse van polaire verontreinigingen. De koppeling vereist speciale aandacht voor de mobiele-fase-overgang: de hoog-organische HILIC-eluens is niet direct verenigbaar met de waterige startcondities van de RP-kolom. Trapping-modulatoren houden de HILIC-fracties tijdelijk vast op een korte tussenkolom en concentreren ze opnieuw alvorens ze op de tweede dimensie te injecteren. Voor meer achtergrond over de opzet en toepassingen van 2D-LC verwijzen wij naar ons artikel over 2D-LC.
Metabolomics is het vakgebied dat het profijt het meest trekt van HILIC. Het metaboloom omvat duizenden kleine polaire moleculen — aminozuren, nucleotiden, organische zuren, suikerfosfaten — die op C18 nauwelijks retineren. HILIC-MS/MS-methoden zijn daarmee standaard geworden in de kwantificering van centrale metabolieten in plasma, cerebrospinaalvloeistof en celextracten.
Suikeranalyse en koolhydraatchemie profiteren van de hoge selectiviteit van amide- en diolkolommen voor hydroxylgroep-rijke verbindingen. Mono- en disachariden, oligosachariden en suikeralcoholen worden gescheiden in levensmiddelenanalyse, biotechnologische procesbewaking en farmaceutische formuleringsanalyse.
Aminozuuranalyse zonder voorafgaande derivatisering is mogelijk via HILIC in combinatie met MS-detectie. Dit biedt een snellere en goedkopere workflow dan de traditionele derivatisatiemethoden die voor UV-detectie noodzakelijk zijn. Zwitterionische HILIC-kolommen zijn hiervoor bij uitstek geschikt.
Farmaceutische analyse van hydrofiele werkzame stoffen: geneesmiddelen met meerdere polaire functionele groepen — aminoglycosiden, bisfosfonaten, sommige antivirale middelen — zijn op RP-HPLC slecht analyseerbaar. HILIC biedt hier een directe oplossing zonder de ionenpaarreagentia die anders nodig zijn en die de MS-detectie compliceren.
Lipidanalyse (lipidomics): polaire lipidekoppen van fosfolipiden zoals fosfatidylcholine, fosfatidylethanolamine en sfingomyeline worden in HILIC gescheiden op basis van de koploopgroep, terwijl vetzuurstaarten secundair de scheiding bepalen. Deze aanpak wordt gecombineerd met hoge-resolutie-MS voor volledige lipidprofilering.
Nucleotiden en nucleosiden: ATP, ADP, AMP, NAD⁺, NADH en verwante co-enzymen zijn essentiële polaire metabolieten. HILIC-MS/MS is de gevestigde methode voor de gelijktijdige kwantificering van deze verbindingen in biologische matrices.
Wateroplosbare vitaminen (vitamine B-complex, vitamine C) worden op RP-HPLC onvoldoende geretineerd en vereisen ionenpaarreagentia of lange looptijden. HILIC biedt een elegantere oplossing met vluchtige buffers en goede MS-compatibiliteit.
HILIC, omgekeerde-fase HPLC en ionenchromatografie vullen elkaar aan voor de analyse van verbindingen over het gehele polariteitsspectrum. De keuze tussen de technieken hangt af van de aard van de analyt, de gewenste detectiemethode en de beschikbare apparatuur.
Het verschil tussen HILIC en normale-fase chromatografie (NP-HPLC) is subtiel maar wezenlijk: bij NP-HPLC wordt de polaire stationaire fase gebruikt met apolaire organische oplosmiddelen (hexaan, heptaan) als mobiele fase, zonder waterige component. HILIC gebruikt juist een waterige component als essentieel bestanddeel van de mobiele fase en is daarmee directe analyse van waterige monsters mogelijk — een groot praktisch voordeel ten opzichte van NP-HPLC.
Startpunt mobiele fase: begin met 80–90 procent acetonitril en 10–20 procent waterige buffer (ammoniumacetaat of ammoniumformiaat, 10–20 mmol/L, pH 4,5–6,5). Pas het watergehalte aan op basis van de retentietijden: minder water geeft meer retentie, meer water werkt eluërend.
Equilibratie: voorzie voldoende equilibratietijd na de gradiënt. Onvoldoende equilibratie van de waterrijke laag geeft irreproduceerbare retentietijden van run naar run. Gebruik minimaal 30 kolomvolumes bij de begincondities als wasvolume.
Monsteroplossingsmiddel: los monsters bij voorkeur op in het begineluens (hoog ACN-gehalte) of in puur acetonitril. Waterige monsteroplossingen kunnen leiden tot piekvervorming doordat het water plaatselijk de waterrijke laag verstoort. Verdun waterige monsters met acetonitril voor injectie, of gebruik een klein injectievolume.
Kolomconditioning: spoel een nieuwe HILIC-kolom eerst door met 20–30 kolomvolumes water en vervolgens met de begincondities van de mobiele fase. Hierdoor wordt de waterrijke laag opgebouwd en gestabiliseerd voor reproduceerbare analyses.
Temperatuureffect: de dikte en stabiliteit van de geadsorbeerde waterrijke laag zijn temperatuurafhankelijk. Voer HILIC-analyses altijd bij een gecontroleerde, thermostaat-geregelde kolomtemperatuur (doorgaans 25–40 °C) uit.
Kolomselectie: begin met een zwitterionische kolom voor onbekende polaire monsters; schakel naar amide voor suikers en oligosachariden, naar silica voor basische verbindingen wanneer ionenwisseling de selectiviteit verbetert.
Voor monstervoorbereiding vóór HILIC-analyse is solid-phase-extractie (SPE) een effectieve methode om matrixcomponenten te verwijderen en de analyt op te concentreren. Bij biologische matrices (plasma, urine) wordt eiwitprecipitatie met acetonitril vaak gebruikt als snelle eerste opwerkingsstap, waarbij het eiwitvrije supernatant direct kan worden geïnjecteerd in het HILIC-systeem.
Wat is het verschil tussen HILIC en normale-fase chromatografie? Beide technieken gebruiken een polaire stationaire fase, maar verschillen fundamenteel in de mobiele fase. NP-HPLC werkt met apolaire organische oplosmiddelen (hexaan, heptaan) en is niet geschikt voor waterige monsters. HILIC gebruikt acetonitril/water-mengsels met een waterige buffercomponent en kan waterige monsters direct analyseren. Bovendien is het retentiemechanisme in HILIC primair partitie (verdeling tussen organisch-rijke mobiele fase en waterrijke geïmmobiliseerde laag), terwijl NP-HPLC voornamelijk op adsorptie berust.
Waarom elueren stoffen in HILIC in omgekeerde volgorde ten opzichte van RP-HPLC? In RP-HPLC retineren apolaire verbindingen het sterkst op de apolaire C18-fase; polaire verbindingen elueren het eerst. In HILIC retineren polaire verbindingen het sterkst in de waterrijke laag op de polaire stationaire fase; apolaire verbindingen hebben weinig affiniteit voor de waterlaag en elueren vroeg.
Kan ik mijn bestaande HPLC-apparatuur gebruiken voor HILIC? Ja, HILIC is volledig uitvoerbaar op standaard HPLC- en UHPLC-apparatuur. U heeft uitsluitend een HILIC-kolom en compatibele mobiele fase nodig. Controleer wel of de slangen en fittingen bestand zijn tegen hoog acetonitrilgehalte, en zorg voor lage dode volumes om extra-kolom-verbreding te minimaliseren — met name bij de smalle pieken die UHPLC-kolommen genereren.
Is HILIC geschikt voor alle polaire verbindingen? HILIC is het meest geschikt voor neutrale tot zwak ionische polaire verbindingen. Voor sterk ionische verbindingen — kleine anionen en kationen zoals chloride, nitraat, natrium en kalium — is ionenchromatografie de aangewezen methode, omdat IC hogere selectiviteit biedt voor ladingsverschillen en geoptimaliseerde suppressor-detectie inzet.
Hoe los ik pieksymmetrieproblemen op bij HILIC? Piekstaartvorming wordt bij silica-HILIC vaak veroorzaakt door ionenwisseling aan vrije silanolgroepen. Voeg een lage concentratie ammoniumzout toe aan de mobiele fase (5–20 mmol/L) om de silanolactiviteit te onderdrukken. Overweeg ook een overschakeling naar een zwitterionische of amide-kolom, die minder silanolactiviteit vertonen. Controleer tevens of het monsteroplossingsmiddel compatibel is met de HILIC-begincondities.
Wat zijn de nadelen van hydrofobe interactiechromatografie ten opzichte van HILIC? Hydrofobe interactiechromatografie (HIC) — een andere techniek — werkt met hoge zoutconcentraties als bindende conditie en wordt uitsluitend ingezet voor eiwitten en biologische macromoleculen. HIC is niet compatibel met MS-detectie door de niet-vluchtige zouten. HILIC is breder inzetbaar, MS-compatibel en geschikt voor zowel kleine moleculen als grotere polaire verbindingen.
HILIC-analyses worden uitgevoerd op standaard analytische HPLC- of UHPLC-systemen. De kritische onderdelen zijn:
De HILIC-kolom met een polaire stationaire fase (silica, amide, diol of zwitterionisch) in de gewenste kolomdimensies. Standaard analytische kolommen hebben een inwendige diameter van 2,1 of 4,6 mm en een lengte van 50–150 mm. Voor gebruik met UHPLC zijn kolommen met deeltjesgrootten van 1,7–1,8 μm beschikbaar die ook bij hoge druk stabiel zijn. Core-shell deeltjes in HILIC-modificatie combineren hoge efficiëntie met lagere tegendruk en zijn een populaire keuze voor snelle methoden.
De pomp moet nauwkeurige gradiëntprogrammering mogelijk maken voor het water/acetonitril-mengsel. Quaternaire pompen bieden de meeste flexibiliteit maar binaire pompen volstaan voor de meeste HILIC-methoden.
De detector: bij verbindingen met een chromofoor kan een UV-detector of diode-array detector (DAD) worden gebruikt. Veel HILIC-analyt-klassen — suikers, aminozuren zonder aromatische ring, nucleosiden — zijn UV-transparant of absorberen slecht. Voor deze verbindingen is een ELSD (evaporative light scattering detector), CAD (charged aerosol detector) of massaspectrometer noodzakelijk. De MS-detector is veruit het meest gevoelig en selectief en is de standaard in metabolomics en farmaceutisch onderzoek.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische achtergrond voor laboratoriumgebruikers. Raadpleeg altijd de specificaties van fabrikant en kolom voor uw specifieke toepassing. Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor analytische resultaten op basis van de hier beschreven methoden.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
