2D-LC, voluit tweedimensionale vloeistofchromatografie, koppelt twee verschillende scheidingsmechanismen achter elkaar binnen één analyse. Voor complexe monsters die in een gewone HPLC-run niet volledig kunnen worden uitgesplitst, biedt deze techniek een aanzienlijk hogere piekcapaciteit en een betere scheiding van componenten die anders over elkaar heen vallen. In dit artikel komen het principe, de opbouw van een 2D-LC systeem, de modi heart-cutting en comprehensive, de modulator als verbindend element, de typische toepassingen en de praktische aandachtspunten aan bod.
Het effluent van een eerste chromatografiekolom wordt geheel of gedeeltelijk via een modulator overgebracht naar een tweede kolom met een ander scheidingsmechanisme. Componenten die op de eerste kolom samenvallen worden op de tweede kolom alsnog van elkaar gescheiden. De techniek kent twee hoofdvarianten:
Bij 2D-LC wordt het effluent van een eerste chromatografiekolom geheel of gedeeltelijk overgebracht naar een tweede kolom met een ander scheidingsmechanisme. Componenten die op de eerste kolom samenvallen, kunnen op de tweede kolom alsnog uit elkaar worden gehaald, mits beide dimensies elkaar voldoende aanvullen. De techniek wordt ook wel multidimensionale vloeistofchromatografie genoemd; de tweedimensionale variant is de meest toegepaste vorm.
De afkorting 2D verwijst hier naar de twee scheidingsdimensies, niet naar een ruimtelijke voorstelling. Conceptueel is 2D-LC vergelijkbaar met tweedimensionale dunnelaagchromatografie en tweedimensionale papierchromatografie, waarbij een plaat in twee richtingen wordt ontwikkeld. In de gaschromatografie bestaat een vergelijkbare techniek onder de naam GC×GC.
Een 2D-LC opstelling bestaat in essentie uit twee complete chromatografische subsystemen die via een modulator zijn gekoppeld. De belangrijkste onderdelen zijn:
De tweede dimensie is doorgaans korter en sneller dan de eerste. Een typische ¹D-analyse duurt 30 tot 90 minuten, terwijl elke ²D-scheiding binnen 20 tot 60 seconden moet zijn afgerond om voldoende fracties te kunnen verwerken bij comprehensive 2D-LC.
De modulator vormt de verbinding tussen beide dimensies. De meest voorkomende uitvoering is een 10-poorts klep met twee identieke monsterloops. Terwijl één loop wordt gevuld met effluent uit de eerste dimensie, wordt de andere loop leeggespoeld op de tweede dimensie. Bij de volgende schakeling wisselen de rollen om.
Een alternatief is de zogenaamde trapping-modulator, waarbij fracties op een korte tussenkolom worden vastgehouden en daarna geconcentreerd op de tweede kolom geïnjecteerd. Trapping is vooral nuttig wanneer de mobiele fasen van beide dimensies elkaar slecht verdragen, bijvoorbeeld bij koppeling van HILIC aan omgekeerde-fase chromatografie.
2D-LC kent twee hoofdmodi die zich onderscheiden in welk deel van het ¹D-effluent naar de tweede kolom wordt gestuurd:
Tussen beide uitersten bestaat ook selective comprehensive 2D-LC (sLC×LC), waarbij meerdere voorgeselecteerde retentievensters volledig op de tweede kolom worden gescheiden. Deze hybride vorm combineert gerichte selectie met de informatiedichtheid van comprehensive scheidingen.
De winst van 2D-LC valt of staat met de mate waarin beide dimensies onafhankelijke informatie leveren. Twee identieke omgekeerde-fase scheidingen achter elkaar leveren nauwelijks extra resolutie. Pas wanneer de scheidingsmechanismen orthogonaal zijn, dat wil zeggen op verschillende moleculaire eigenschappen berusten, ontstaat de typische verspreiding van pieken over het volledige 2D-vlak.
Veelvoorkomende orthogonale combinaties zijn:
De piekcapaciteit van een chromatografisch systeem geeft aan hoeveel pieken theoretisch in basislijnscheiding naast elkaar passen in een chromatogram. Bij 2D-LC met volledig orthogonale dimensies is de totale piekcapaciteit het product van beide afzonderlijke piekcapaciteiten:
ntot = n1 × n2
Een eerste dimensie met piekcapaciteit 100 en een tweede dimensie met piekcapaciteit 30 levert in theorie 3000 oplosbare componenten op. In de praktijk wordt deze waarde nooit volledig gehaald omdat de orthogonaliteit zelden honderd procent is en omdat ondersampling van de eerste dimensie verlies aan resolutie veroorzaakt. Vuistregel: per ¹D-piek zijn ten minste drie tot vier ²D-fracties nodig om de scheiding op de eerste kolom te behouden.
Aan de uitgang van de tweede kolom wordt een detector geplaatst die snel genoeg is om de smalle pieken uit ²D te volgen. UV-detectie en diode-array-detectie zijn gebruikelijk; voor identificatie van onbekende componenten wordt 2D-LC vaak gekoppeld aan LC-MS.
Het resultaat van een comprehensive 2D-LC analyse wordt meestal gepresenteerd als contour-plot of kleurenkaart, met de ¹D-retentietijd op de horizontale as en de ²D-retentietijd op de verticale as. Elke vlek vertegenwoordigt één component; de intensiteit komt overeen met de detectorrespons.
2D-LC wordt vooral ingezet wanneer een conventionele HPLC-scheiding tekortschiet. Belangrijke toepassingsgebieden zijn:
Voor een goede uitvoering van 2D-LC zijn enkele praktische punten van belang:
Ten opzichte van klassieke eendimensionale HPLC levert 2D-LC een veel hogere piekcapaciteit en daarmee betere identificatie van componenten in zeer complexe monsters. De prijs is een complexere opstelling, langere methodeontwikkeling en meer kolommen, oplosmiddelen en data-analyse.
Vergeleken met GC×GC heeft 2D-LC een breder toepassingsgebied omdat veel monsters niet vluchtig genoeg zijn voor gaschromatografie, zoals eiwitten, polymeren en niet-vluchtige metabolieten. GC×GC blijft echter superieur voor vluchtige mengsels door de zeer hoge piekcapaciteit van capillaire GC-kolommen.
Heart-cutting (ook geschreven als LC-LC) is de eenvoudigste vorm van 2D-LC, waarbij niet het volledige effluent van de eerste kolom wordt doorgegeven aan de tweede kolom, maar alleen één of enkele specifieke fracties — de "hart" van een onopgelost pieksegment. U past heart-cutting toe wanneer er in een verder goed functionerende HPLC-methode één problematisch co-elutiepunt is: twee verbindingen die op de eerste kolom niet worden gescheiden. De betrokken fractie wordt via een klep omgeleid naar een tweede kolom met een ander scheidingsmechanisme, terwijl de rest van het chromatogram gewoon doorgaat naar de detector van de eerste dimensie. Heart-cutting vereist relatief eenvoudige apparatuur — een gewone HPLC-pomp met een schakelklep — en de tweede dimensie hoeft niet snel te zijn. Het nadeel ten opzichte van comprehensive 2D-LC is dat alleen de voorgeselecteerde fracties worden onderzocht; onbekende co-eluties elders in het chromatogram worden gemist.
Orthogonaliteit beschrijft de mate waarin de twee scheidingsdimensies onafhankelijke informatie leveren. Als beide dimensies op hetzelfde moleculaire principe berusten — bijvoorbeeld twee omgekeerde-fase C18-kolommen — zullen verbindingen in beide dimensies in dezelfde relatieve volgorde elueren. De scheiding biedt dan nauwelijks meer resolutie dan één kolom. Volledig orthogonale dimensies berusten op totaal verschillende eigenschappen: polariteit versus hydrofobiciteit (HILIC × RP), lading versus hydrofobiciteit (IEX × RP) of molecuulgrootte versus hydrofobiciteit (SEC × RP). In het ideale geval is het 2D-chromagram dan gevuld over het gehele vlak, met pieken gelijkmatig verspreid, en is de effectieve piekcapaciteit het product van beide dimensies. In de praktijk is volledige orthogonaliteit moeilijk te bereiken; de mate van orthogonaliteit kan worden uitgedrukt als het percentage benut oppervlak van het 2D-vlak ten opzichte van het maximaal haalbare.
Piekcapaciteit is het aantal pieken dat theoretisch met basislijnscheiding naast elkaar past in een chromatogram onder de gegeven omstandigheden. Een typische 1D-HPLC-scheiding bereikt een piekcapaciteit van 100 tot 500, afhankelijk van kolomlengte, deeltjesgrootte en gradiëntduur. Bij 2D-LC met volledig orthogonale dimensies is de totale piekcapaciteit het product van beide: als ¹D een piekcapaciteit van 100 heeft en ²D een piekcapaciteit van 30, bedraagt de theoretische 2D-piekcapaciteit 3000. In de praktijk wordt dit getal niet volledig gehaald door gedeeltelijke orthogonaliteit en ondersampling van ¹D, maar zelfs bij 30–50% benutting is de winst ten opzichte van 1D-HPLC aanzienlijk. Voor complexe biologische monsters zoals plasma-extracten of polymeermengsels — waarbij duizenden componenten aanwezig kunnen zijn — is 2D-LC de enige vloeistofchromatografische techniek die voldoende resolutie biedt voor brede profilering.
De vuistregel is: kies voor 2D-LC wanneer een optimale 1D-HPLC-methode nog steeds niet genoeg resolutie biedt om het monster voldoende uit te splitsen. Concrete indicaties zijn: (1) co-elutieproblemen — twee of meer componenten die ondanks kolomoptimalisatie samenvallen; (2) complexe matrices — monsters met honderden of duizenden componenten, zoals plasma, urine, voedselextracten of polymeren, waarbij de piekcapaciteit van één kolom onvoldoende is; (3) onbekende verontreinigingen — wanneer spectrale bevestiging (MS) niet voldoende is en scheiding van een storend co-eluerende component noodzakelijk is; (4) chirale analyse in aanwezigheid van matrixcomponenten — een achirale voorscheiding op ¹D gevolgd door een chirale ²D verlaagt de detectiegrens en verbetert de nauwkeurigheid. 2D-LC is duurder, complexer en vereist meer methodeontwikkeling dan 1D-HPLC; het is geen standaardkeuze maar een gerichte oplossing voor scheidingsproblemen die 1D niet aankan.
LC×LC (comprehensive 2D-LC) en LC-LC (heart-cutting 2D-LC) zijn twee fundamenteel verschillende uitvoeringsvormen van 2D-LC. Bij LC-LC wordt alleen één of enkele specifieke fracties uit de eerste dimensie naar de tweede dimensie gestuurd; de rest van het chromatogram passeert de modulator ongestoord. Dit is gericht, eenvoudig en geschikt wanneer een specifiek co-elutiepunt moet worden opgelost. Bij LC×LC (uitgesproken als "LC cross LC") wordt het volledige effluent van de eerste kolom in opeenvolgende fracties naar de tweede kolom gestuurd; niets gaat verloren. Dit levert een volledig 2D-beeld van het monster op als contour-plot, maar vereist een snelle tweede kolom (typisch ²D-analysetijd van 20–60 seconden), specialistische apparatuur en een geavanceerd datasysteem. De notatie × tegenover – verwijst bewust naar het multiplicatieve effect op de piekcapaciteit bij comprehensive versus het additieve (beperkte) effect bij heart-cutting.
De modulator is de interface tussen de twee chromatografische dimensies en is het meest kritische onderdeel van een 2D-LC systeem. De meest gebruikte uitvoering is een 10-poorts rotatietafelklep met twee identieke injectielussen (loops). Terwijl lus A wordt gevuld met effluent uit de eerste dimensie gedurende één modulatieperiode (typisch 20–60 seconden), wordt lus B leeggespoeld richting de tweede kolom door de pomp van ²D. Na afloop van de modulatieperiode schakelt de klep: lus B wordt gevuld, lus A gespoeld. Door dit alternerend vullen en spoelen worden alle fracties uit ¹D sequentieel op ²D geanalyseerd zonder verlies van effluent. Een alternatieve uitvoering is de trapping-modulator: fracties worden tijdelijk vastgehouden op een korte concentreerkolom en vervolgens als geconcentreerde plug op ²D geïnjecteerd. Dit is voordelig bij grote mobiele-fasevolumediscrepanties tussen ¹D en ²D, maar vereist zorgvuldige afstemming van de trapbewaartijd om onvolledige overdracht te voorkomen.
2D-LC en GC×GC (comprehensive tweedimensionale gaschromatografie) delen het principe van twee orthogonale scheidingsdimensies, maar richten zich op fundamenteel verschillende analytklassen. GC×GC is beperkt tot vluchtige en halfvluchtige verbindingen die bij verhoogde temperatuur kunnen verdampen — zoals petrochemische mengsels, vluchtige organische stoffen, aroma's en residuele oplosmiddelen — en bereikt daarvoor een uitzonderlijk hoge piekcapaciteit (tot 10.000 of meer) en gevoeligheid door het focusserende effect van de cryogene modulator. 2D-LC is niet beperkt tot vluchtige stoffen: eiwitten, peptiden, nucleotiden, polymeren, suikers en farmaceutische werkzame stoffen — verbindingen die bij GC-temperaturen ontleden of niet verdampen — worden via 2D-LC geanalyseerd. GC×GC is sneller en efficiënter voor zijn doelklasse; 2D-LC is onvervangbaar voor niet-vluchtige en thermisch labiele matrices. In laboratoria die beide klassen analyseren worden beide technieken parallel ingezet.
De retentietijd is de tijd die een component nodig heeft om van het injectiepunt door de kolom naar de detector te reizen. Elke verbinding heeft onder vaste omstandigheden een karakteristieke retentietijd die afhangt van de wisselwerking tussen de component en de stationaire fase. Bij 2D-LC worden twee retentietijden geregistreerd: ¹D-retentietijd (uitgesplitst op de eerste kolom) en ²D-retentietijd (uitgesplitst op de tweede kolom). Samen bepalen zij de positie van een component in de tweedimensionale contourplot.
Resolutie (Rs) is een maat voor hoe goed twee aangrenzende pieken van elkaar zijn gescheiden in een chromatogram. De waarde wordt berekend uit het verschil in retentietijd tussen beide pieken gedeeld door het gemiddelde van hun piekbreedte aan de basis. Een Rs van 1,5 wordt beschouwd als basislijnscheiding. Bij 2D-LC wordt de resolutie van de eerste dimensie niet automatisch overgedragen naar de tweede: ondersampling van ¹D-fracties of onvolledige orthogonaliteit kan leiden tot resolutieverlies, ook als elke afzonderlijke dimensie op zichzelf goed presteert.
Gelchromatografie is een scheidingstechniek op basis van moleculaire grootte, ook bekend als grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) of GPC. Moleculen diffunderen in meer of mindere mate in de poriën van het kolomvulmateriaal: kleinere moleculen dringen dieper door en elueren later, grotere moleculen worden uitgestoten en elueren eerder. Bij 2D-LC wordt gelchromatografie vaak ingezet als eerste dimensie voor polymeer- of eiwitanalyse, gevolgd door een omgekeerde-fase scheiding als tweede dimensie om tegelijk informatie over molecuulmassa en chemische samenstelling te verkrijgen.
2D-LC koppelt twee orthogonale vloeistofchromatografische scheidingen binnen één analyse en levert daarmee een veel hogere piekcapaciteit dan een conventionele HPLC-run. In de heart-cutting modus wordt één onopgelost gebied gericht op een tweede kolom gescheiden; in de comprehensive modus wordt het hele eerste chromatogram in fracties opgedeeld en op de tweede kolom uitgewerkt. De modulator vormt het scharnierpunt tussen beide dimensies. Voor complexe monsters in biofarmaceutische analyse, metabolomics, polymeer- en voedingsanalyse is 2D-LC inmiddels een breed geaccepteerde techniek geworden.
Voor 2D-LC-analyses vindt u bij Labvakhandel chromatografie-accessoires, spuitfilters en vials voor de autosampler. Voor advies over kolomkeuze, monstervoorbereiding of detectie voor uw specifieke 2D-LC toepassing, neem contact op met Labvakhandel.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene technische toelichting. Canidae Seal B.V. / Labvakhandel.nl aanvaardt geen aansprakelijkheid voor de toepassing van deze informatie in specifieke analytische, klinische of industriële situaties. Raadpleeg voor uw eigen toepassing altijd de geldende normen, vakliteratuur en de documentatie van fabrikant en apparatuur.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
