2D-LC, voluit tweedimensionale vloeistofchromatografie, koppelt twee verschillende scheidingsmechanismen achter elkaar binnen één analyse. Voor complexe monsters die in een gewone HPLC-run niet volledig kunnen worden uitgesplitst, biedt deze techniek een aanzienlijk hogere piekcapaciteit en een betere scheiding van componenten die anders over elkaar heen vallen. In dit artikel komen het principe, de opbouw van een 2D-LC systeem, de modi heart-cutting en comprehensive, de modulator als verbindend element, de typische toepassingen en de praktische aandachtspunten aan bod.
Bij 2D-LC wordt het effluent van een eerste chromatografiekolom geheel of gedeeltelijk overgebracht naar een tweede kolom met een ander scheidingsmechanisme. Componenten die op de eerste kolom samenvallen, kunnen op de tweede kolom alsnog uit elkaar worden gehaald, mits beide dimensies elkaar voldoende aanvullen. De techniek wordt ook wel multidimensionale vloeistofchromatografie genoemd; de tweedimensionale variant is de meest toegepaste vorm.
De afkorting 2D verwijst hier naar de twee scheidingsdimensies, niet naar een ruimtelijke voorstelling. Conceptueel is 2D-LC vergelijkbaar met tweedimensionale dunnelaagchromatografie en tweedimensionale papierchromatografie, waarbij een plaat in twee richtingen wordt ontwikkeld. In de gaschromatografie bestaat een vergelijkbare techniek onder de naam GC×GC.
Een 2D-LC opstelling bestaat in essentie uit twee complete chromatografische subsystemen die via een modulator zijn gekoppeld. De belangrijkste onderdelen zijn:
De tweede dimensie is doorgaans korter en sneller dan de eerste. Een typische ¹D-analyse duurt 30 tot 90 minuten, terwijl elke ²D-scheiding binnen 20 tot 60 seconden moet zijn afgerond om voldoende fracties te kunnen verwerken bij comprehensive 2D-LC.
De modulator vormt de verbinding tussen beide dimensies. De meest voorkomende uitvoering is een 10-poorts klep met twee identieke monsterloops. Terwijl één loop wordt gevuld met effluent uit de eerste dimensie, wordt de andere loop leeggespoeld op de tweede dimensie. Bij de volgende schakeling wisselen de rollen om.
Een alternatief is de zogenaamde trapping-modulator, waarbij fracties op een korte tussenkolom worden vastgehouden en daarna geconcentreerd op de tweede kolom geïnjecteerd. Trapping is vooral nuttig wanneer de mobiele fasen van beide dimensies elkaar slecht verdragen, bijvoorbeeld bij koppeling van HILIC aan omgekeerde-fase chromatografie.
2D-LC kent twee hoofdmodi die zich onderscheiden in welk deel van het ¹D-effluent naar de tweede kolom wordt gestuurd:
Tussen beide uitersten bestaat ook selective comprehensive 2D-LC (sLC×LC), waarbij meerdere voorgeselecteerde retentievensters volledig op de tweede kolom worden gescheiden. Deze hybride vorm combineert gerichte selectie met de informatiedichtheid van comprehensive scheidingen.
De winst van 2D-LC valt of staat met de mate waarin beide dimensies onafhankelijke informatie leveren. Twee identieke omgekeerde-fase scheidingen achter elkaar leveren nauwelijks extra resolutie. Pas wanneer de scheidingsmechanismen orthogonaal zijn, dat wil zeggen op verschillende moleculaire eigenschappen berusten, ontstaat de typische verspreiding van pieken over het volledige 2D-vlak.
Veelvoorkomende orthogonale combinaties zijn:
De piekcapaciteit van een chromatografisch systeem geeft aan hoeveel pieken theoretisch in basislijnscheiding naast elkaar passen in een chromatogram. Bij 2D-LC met volledig orthogonale dimensies is de totale piekcapaciteit het product van beide afzonderlijke piekcapaciteiten:
ntot = n1 × n2
Een eerste dimensie met piekcapaciteit 100 en een tweede dimensie met piekcapaciteit 30 levert in theorie 3000 oplosbare componenten op. In de praktijk wordt deze waarde nooit volledig gehaald omdat de orthogonaliteit zelden honderd procent is en omdat ondersampling van de eerste dimensie verlies aan resolutie veroorzaakt. Vuistregel: per ¹D-piek zijn ten minste drie tot vier ²D-fracties nodig om de scheiding op de eerste kolom te behouden.
Aan de uitgang van de tweede kolom wordt een detector geplaatst die snel genoeg is om de smalle pieken uit ²D te volgen. UV-detectie en diode-array-detectie zijn gebruikelijk; voor identificatie van onbekende componenten wordt 2D-LC vaak gekoppeld aan LC-MS.
Het resultaat van een comprehensive 2D-LC analyse wordt meestal gepresenteerd als contour-plot of kleurenkaart, met de ¹D-retentietijd op de horizontale as en de ²D-retentietijd op de verticale as. Elke vlek vertegenwoordigt één component; de intensiteit komt overeen met de detectorrespons.
2D-LC wordt vooral ingezet wanneer een conventionele HPLC-scheiding tekortschiet. Belangrijke toepassingsgebieden zijn:
Voor een goede uitvoering van 2D-LC zijn enkele praktische punten van belang:
Ten opzichte van klassieke eendimensionale HPLC levert 2D-LC een veel hogere piekcapaciteit en daarmee betere identificatie van componenten in zeer complexe monsters. De prijs is een complexere opstelling, langere methodeontwikkeling en meer kolommen, oplosmiddelen en data-analyse.
Vergeleken met GC×GC heeft 2D-LC een breder toepassingsgebied omdat veel monsters niet vluchtig genoeg zijn voor gaschromatografie, zoals eiwitten, polymeren en niet-vluchtige metabolieten. GC×GC blijft echter superieur voor vluchtige mengsels door de zeer hoge piekcapaciteit van capillaire GC-kolommen.
2D-LC koppelt twee orthogonale vloeistofchromatografische scheidingen binnen één analyse en levert daarmee een veel hogere piekcapaciteit dan een conventionele HPLC-run. In de heart-cutting modus wordt één onopgelost gebied gericht op een tweede kolom gescheiden; in de comprehensive modus wordt het hele eerste chromatogram in fracties opgedeeld en op de tweede kolom uitgewerkt. De modulator vormt het scharnierpunt tussen beide dimensies. Voor complexe monsters in biofarmaceutische analyse, metabolomics, polymeer- en voedingsanalyse is 2D-LC inmiddels een breed geaccepteerde techniek geworden.
Voor advies over kolomkeuze, monstervoorbereiding of detectie voor uw specifieke 2D-LC toepassing, neem contact op met Labvakhandel.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
