Chirale chromatografie is een bijzondere vorm van hogedruk vloeistofchromatografie (HPLC) waarbij enantiomeren — moleculen die elkaars spiegelbeeld zijn maar niet op elkaar gelegd kunnen worden — van elkaar worden gescheiden. Omdat enantiomeren identieke fysische eigenschappen bezitten (smeltpunt, kookpunt, UV-absorptie), zijn zij met een gewone niet-chirale HPLC-kolom niet te scheiden. Een chirale stationaire fase (CSP) maakt het verschil: door stereospecifieke interacties worden de twee spiegelbeeldvormen op verschillende tijdstippen van de kolom geëlueerd. De techniek is onmisbaar geworden in de farmaceutische industrie, de agrochemie en de voedingsanalyse, overal waar de biologische activiteit van een verbinding afhankelijk is van haar driedimensionale configuratie.
Een molecuul is chiraal wanneer het niet samenvalt met zijn spiegelbeeld. De meest voorkomende oorzaak is een asymmetrisch koolstofatoom (koolstof met vier verschillende substituenten), maar chiraliteit kan ook ontstaan door axiale, planaire of helicoïdale asymmetrie. De twee spiegelbeeldisomeren van een chiraal molecuul worden enantiomeren genoemd. Mengsels die gelijke hoeveelheden van beide enantiomeren bevatten heten racematen of racemische mengsels; een mengsel met een overmaat van één enantiomeer heeft een enantiomere overmaat (ee).
Enantiomeren draaien gepolariseerd licht in tegengestelde richting: het rechtsdraaiende enantiomeer wordt aangeduid met (+) of d, het linksdraaiende met (−) of l. De absolute configuratie rond het chiraal centrum wordt beschreven met de R/S-nomenclatuur (Cahn-Ingold-Prelog-regels). In de biologie wordt de D/L-nomenclatuur veel gebruikt: vrijwel alle natuurlijk voorkomende aminozuren zijn L-aminozuren, terwijl glucose als D-glucose voorkomt.
Wat chiraliteit biologisch belangrijk maakt, is dat enzymen, receptoren en andere biologische macromoleculen zelf chiraal zijn. Het receptor-ligand contact is stereospecifiek: een receptor past precies op één enantiomeer, maar niet op zijn spiegelbeeld. Dit is de reden dat de twee enantiomeren van een farmaceutische werkzame stof drastisch verschillende werking kunnen hebben — van dezelfde effectiviteit via geen werking tot zelfs tegengesteld of toxisch effect.
De scheiding berust op het beginsel van de drievoudige herkenning van Dalgliesh (drie-punt-interactiemodel): om twee enantiomeren te kunnen onderscheiden, moeten er gelijktijdig ten minste drie stereospecifieke interacties optreden tussen het analytmolecuul en de chirale selector. Gebruikelijke interacties zijn waterstofbruggen, elektrostatische aantrekking, π-π-stapeling, inclusievorming en sterische passing. Het ene enantiomeer past geometrisch beter op de actieve groep van de selector dan het andere; daardoor verschilt de bindingsaffiniteit en daarmee de retentietijd.
De chirale selector is gefixeerd op of in het dragermateriaal — doorgaans poreus silica — en vormt zo de chirale stationaire fase (CSP). De mobiele fase is niet chiraal en draagt bij aan de algehele elutiekracht. De elutievolgorde (welk enantiomeer eerst eluiert) is afhankelijk van de selector, de mobiele fase, de temperatuur en de structuur van het analysemolecuul. Omgekeerde elutievolgorde kan worden bereikt door de enantiomere tegenhanger van de selector te gebruiken, door de mobiele fase te wijzigen of door de temperatuur aan te passen.
De scheidingskwaliteit van een chirale scheiding wordt uitgedrukt in de chirale resolutie Rs:
Rs = 2 × (t₂ − t₁) / (w₁ + w₂)
Hierin zijn t₁ en t₂ de retentietijden van de twee enantiomeerpieken en w₁ en w₂ de piekbreedten op de basislijn. Een Rs van 1,5 geeft basislijnscheiding (piekoverlap < 1 procent); Rs ≥ 1,5 wordt doorgaans geëist voor kwantitatieve farmacopeiësche analyses. Bij Rs = 1,0 is de overlap ongeveer 2 procent, voldoende voor kwalitatieve scheiding maar onvoldoende voor nauwkeurige kwantificering van een spiegelenantiomeer op laag niveau. De resolutie is afhankelijk van de selectiviteitsfactor α (ook wel scheidingsfactor of chirale herkenningsfactor), het aantal theoretische platen N van de kolom, en de retentiefactor k van het tweede enantiomeer.
De enantiomere overmaat (ee) is de parameter die in syntheseonderzoek en kwaliteitscontrole de stereochemische zuiverheid uitdrukt:
ee (%) = (R − S) / (R + S) × 100
Een product van 99 % ee bevat 99,5 % van het gewenste enantiomeer en 0,5 % van het andere. Farmaceutische richtlijnen (ICH Q6A) schrijven voor dat chirale zuiverheid voor geneesmiddelen wordt bepaald en gespecificeerd.
Naast chromatografische scheiding bestaat de klassieke chemische methode voor het scheiden van enantiomeren: kinetische of klassieke chirale resolutie. Bij klassieke resolutie wordt een racemisch mengsel omgezet in twee diastereomeren door reactie met een chirale hulpstof (resolutiemiddel). Diastereomeren hebben wél verschillende fysische eigenschappen (smeltpunt, oplosbaarheid) en kunnen dus met kristallisatie of gewone chromatografie worden gescheiden. Na scheiding wordt de chirale hulpstof verwijderd en de gewenste enantiomeer teruggewonnen. Klassieke resolutie levert maximaal 50 procent rendement op het gewenste enantiomeer; de andere helft gaat verloren of wordt geracemiseerd en opnieuw aangeboden. Bij kinetische resolutie reageert één enantiomeer selectief sneller dan het andere met een chiraal reagens; dit benut inherente snelheidsverschillen in asymmetrische reacties. Chirale chromatografie omzeilt deze rendementsbeperking: het hele racemaat wordt geanalyseerd en de twee enantiomeren worden zonder chemische modificatie van elkaar onderscheiden.
De keuze van de chirale selector is de meest bepalende factor voor succes of falen van een chirale scheiding. De vijf meest gebruikte klassen zijn:
Polysaccharide-derivaten zijn tegenwoordig de meest gebruikte chirale stationaire fasen voor HPLC. Ze zijn beschikbaar als gecoate kolommen (selectorpolymeer gecoat op silica) of gebonden kolommen (selector covalent gebonden, toleranter voor een breder oplosmiddelbereik). Gecoate polysaccharidekolommen leveren uitstekende chirale herkenning voor een groot aantal verbindingen, maar zijn gevoeliger voor oplosmiddelincompatibiliteit: bepaalde organische oplosmiddelen kunnen de coating van het silicaoppervlak wassen.
Chirale gaschromatografie (chirale GC) past dezelfde drievoudige-herkenningprincipes toe, maar dan bij hoge temperatuur met een gasvormige mobiele fase. De chirale selector is opgelost in of verbonden aan een vloeibare stationaire fase die als dunne film is aangebracht op de binnenwand van een capillaire kolom. De meest gebruikte chirale GC-selectoren zijn cyclodextrine-derivaten (β-cyclodextrine, pergealkyleerde cyclodextrines) die zijn opgelost in een apolaire polysiloxanematrix. Chirale GC is bij uitstek geschikt voor vluchtige en thermisch stabiele chirale verbindingen: aroma’s (terpenen, esters, alcoholen), vluchtige farmaceutische verontreinigingen, pesticiden en derivaten van aminozuren na voorafgaande derivatisering. De chirale herkenning berust op inclusievorming in de cyclodextrineholte en verschil in enthalpie van het inclusiecomplex voor de twee enantiomeren. De selectiviteit in chirale GC is sterk temperatuurafhankelijk: lagere temperatuur geeft doorgaans meer chirale herkenning, maar ook langere analysetijden.
De keuze van de mobiele fase is bij chirale HPLC minstens zo kritisch als bij conventionele HPLC, maar met een bijzondere complicerende factor: het oplosmiddel moet enerzijds voldoende elutiekracht bieden om een acceptabele retentietijd te geven, en anderzijds mag het de chirale selector niet zodanig solvateren dat de stereospecifieke interactie verloren gaat.
Bij normaal-fase chirale HPLC (NP-CSP) wordt een combinatie van apolaire oplosmiddelen (hexaan, heptaan) met een kleine hoeveelheid polaire modifier (ethanol, isopropanol, methanol) gebruikt. De polaire modifier moduleert de retentie via competitie met de analyt voor de H-brugbindingsplaatsen op de selector. Polysaccharide-gecoate kolommen worden traditioneel in NP-modus gebruikt met hexaan/alcohol-mengsels. Protocollen starten vaak met hexaan/ethanol of hexaan/isopropanol in de verhouding 90:10 v/v en passen de verhouding aan op basis van de resulterende retentietijden.
Bij omgekeerde-fase chirale HPLC (RP-CSP) worden waterige buffers gecombineerd met acetonitril of methanol, analoog aan de gebruikelijke omgekeerde-fase HPLC. Macrocyclische antibiotica, cyclodextrines en proteïne-CSP’s worden overwegend in RP-modus gebruikt. Polysaccharide-gecoate kolommen zijn in RP-modus bruikbaar mits de oplosmiddelkeuze de coating niet aantast; covalent gebonden polysaccharidekolommen bieden hier een grotere veiligheidsmarge.
Bij superkritisch vloeistofchromatografie (SFC) wordt superkritisch CO₂ als hoofdcomponent van de mobiele fase gebruikt, aangevuld met een polaire modifier (methanol, ethanol, isopropanol). SFC combineert de snelheid en lage viscositeit van een gas met de oplossingskracht van een vloeistof. Voor chirale scheidingen heeft SFC grote opgang gemaakt: de korte analysetijden, het lage oplosmiddelverbruik en de goede chirale herkenning op polysaccharidekolommen maken SFC de techniek van voorkeur in de farmaceutische industrie voor snelle chirale screening en productieanalyse. Zie het artikel over superkritische vloeistofchromatografie (SFC) voor een uitgebreide behandeling van het principe, de systeemopbouw en de toepassingen. Zie ook het artikel over superkritische CO₂-extractie voor achtergrondinformatie over het superkritische punt van CO₂.
Voor de scheiding van twee niet-chirale componenten met sterk overlappende pieken in complexe monsters — waarbij chirale en achirale scheiding nodig zijn in één analyse — kan tweedimensionale vloeistofchromatografie (2D-LC) worden ingezet: een achirale eerste dimensie (gericht op de stofklassenscheiding) gevolgd door een chirale tweede dimensie (enantiomeerscheiding). Voor chirale analyses op kleine schaal met beperkte instrumentkosten is chirale capillaire elektroforese een bewezen alternatief.
De farmaceutische industrie is de grootste gebruiker van chirale chromatografie. De achtergrond: veel geneesmiddelen bevatten een chiraal centrum, en de twee enantiomeren kunnen drastisch verschillende farmacologische profielen hebben. Het geval van thalidomide (Softenon) is een veelaangehaald voorbeeld: het (R)-enantiomeer had de beoogde sedatieve werking, terwijl het (S)-enantiomeer teratogeen bleek. In vivo treedt overigens snelle racemisatie op, waardoor enantiomeerzuivere toediening in dit specifieke geval geen praktische bescherming biedt; het voorbeeld blijft niettemin een didactisch ijkpunt voor het belang van stereo-onderzoek. Regulatoire richtlijnen (FDA 1992, ICH Q6A) verlangen sindsdien dat bij chirale werkzame stoffen de chirale zuiverheid wordt bepaald en gespecificeerd, en dat de farmacologische en toxicologische profielen van beide enantiomeren zijn onderzocht.
In de praktijk wordt chirale HPLC of SFC ingezet voor:
HPLC en SFC worden in de farmaceutische kwaliteitscontrole uitgevoerd conform richtlijnen van de Europese Farmacopee (Ph. Eur.) of de USP. Methoden worden gevalideerd conform ICH Q2(R1).
Ook in de agrochemie zijn chirale werkzame stoffen gemeengoed: herbiciden (fenoxyzuurderivaten zoals mecoprop, 2,4-DP), fungiciden (triazolen, imidazolen) en insecticiden (pyrethroïden) bevatten dikwijls chirale centra. Het biologisch actieve enantiomeer kan bij gelijke effectiviteit in halve dosering worden toegepast, wat de milieubelasting vermindert. Chirale GC en chirale HPLC worden ingezet om de enantiomere samenstelling van agrarische producten en milieumonsters (grond, water) te bepalen.
Terpenen, esters en andere aromacomponenten zijn chirale verbindingen waarvan de geur en smaak enantiomeerspecifiek is: R-(+)-carvon ruikt naar spearmint, S-(−)-carvon naar karwij; R-limoneen heeft een andere geur dan S-limoneen. Chirale GC is de meest gebruikte methode voor de verificatie van de natuurlijke enantiomeerverhouding van aromacomponenten — een maat voor authenticiteit die bij opsporing van vervalsing van essentiële oliën en smaakstoffen onmisbaar is.
Aminozuuranalyse via chirale HPLC bepaalt de D/L-verhouding van aminozuren in eiwithydrolysaten, biologisch materiaal en geneesmiddelen. D-aminozuren komen in de natuur voor in bacteriële celwanden en in de hersenen, maar hun concentratie is normaal gesproken laag; verhoogde D-aminozuurspiegels worden onderzocht als biomarker bij neurologische aandoeningen. Chirale LC-MS — chirale vloeistofchromatografie gekoppeld aan een massaspectrometer (zie LC-MS en LC-MS/MS) — maakt bepaling van D-aminozuren op pmol-niveau in hersenvocht en plasma mogelijk.
Chiraliteit is overal in de natuur aanwezig en bepaalt de biologische werking van talloze stoffen. Enzymen in ons lichaam zijn opgebouwd uit L-aminozuren en katalyseren reacties stereospecifiek: ze herkennen en verwerken alleen het juiste enantiomeer van een substraat. DNA is opgebouwd uit D-suikers. Vrijwel alle signaalstof-receptor interacties — van hormonen via neurotransmitters tot reuk- en smaakstoffen — zijn stereospecifiek. Geneesmiddelen werken via diezelfde chirale receptoren: het “verkeerde” enantiomeer kan onwerkzaam zijn, maar ook ongewenste bijwerkingen veroorzaken. In de voeding is de chirale samenstelling van aroma’s een indicatie voor de echtheid van een product. Chirale chromatografie is daarmee geen exotische academische methode, maar een onmisbaar analytisch instrument in de moderne chemie en biologie.
De kolomselectie begint met de moleculaire structuur van de te scheiden verbinding. Polysaccharide-CSP’s zijn de meest universele eerste keuze vanwege hun brede toepasbaarheid; typisch worden cellulose- en amylosekolommen parallel gescreend. Kolommen zijn verkrijgbaar in analytisch formaat (4,6 mm × 250 mm, 5 µm deeltjesgrootte) voor kwalitatief onderzoek, en in preparatief formaat (10, 20, 50 mm i.d.) voor fractionering op gramschaal. UHPLC-chirale kolommen met sub-3 µm deeltjes of core-shell deeltjes leveren scherpe pieken bij kortere analysetijden.
Bij normaal-fase CSP wordt gestart met een breed solventsysteem (hexaan/isopropanol 90:10) en wordt de modifier-concentratie gevarieerd om de retentietijd op k = 2–10 te brengen. Additieven (diethylamine voor basische analyten, azijnzuur voor zure analyten) verbeteren de piekvormen door ionische interacties te onderdrukken. Bij RP-CSP wordt gestart met typische RP-condities (water/acetonitril of water/methanol) en worden pH en zoutconcentratie geoptimaliseerd. Temperatuurverlaging verbetert in veel gevallen de chirale herkenning, maar verlengt ook de analysetijd.
Monsters voor chirale HPLC worden voorbereid met dezelfde technieken als voor reguliere HPLC: filtratie over een 0,22 of 0,45 µm membraanfilter, en bij complexe matrices een solid-phase extractie (SPE)-stap voor matrixverwijdering. Bij chirale analyse is het vermijden van racemisatie tijdens de monstervoorbereiding cruciaal: hoge temperatuur, extreme pH en langdurige bewaring kunnen de chirale zuiverheid aantasten. Monsters worden bij voorkeur koud bereid en direct geanalyseerd of ingevroren bewaard.
UV-detectie via een diode-array detector (DAD) is de meest gebruikte detectiemethode bij chirale HPLC. Voor verbindingen zonder UV-absorptie worden alternatieve detectoren ingezet: een evaporatieve lichtverstrooiingsdetector (ELSD, evaporative light scattering detector), een corona charged aerosol detector (CAD) of koppeling aan een massaspectrometer (LC-MS). Polarimetrische en chiroptische detectoren — die de rotatie van gepolariseerd licht meten — zijn specifiek voor chirale verbindingen en geven informatie over de absolute configuratie, maar zijn minder gevoelig dan UV-detectie.
Een gewone RP-HPLC-kolom heeft een achirale stationaire fase (doorgaans C18 of C8 op silica) en scheidt verbindingen op basis van polariteit en hydrofobiciteit. Enantiomeren zijn even polair en hydrofob; zij elueren dus gelijktijdig en zijn op een achirale kolom niet te onderscheiden. Een chirale HPLC-kolom bevat een selector die stereospecifieke interacties aangaat: de twee enantiomeren beleven een andere affiniteit voor de selector en elueren met een meetbaar tijdverschil.
Ja, chirale TLC-platen met cellulose of andere chirale stationaire fasen zijn beschikbaar voor enantiomeerscreening. Dunnelaagchromatografie (TLC) op chirale platen is snel en goedkoop als oriënterende methode. De resolutie is echter aanzienlijk lager dan bij chirale HPLC, en kwantitatieve analyse is minder nauwkeurig. Chirale TLC wordt daarom voornamelijk gebruikt als snelle screeningsmethode in syntheselaboratoria, niet voor regulatoire kwaliteitscontrole.
De term chirale chromatografie verwijst naar elke chromatografische scheidingsmethode — HPLC, GC, SFC of CE — waarbij een chirale stationaire of mobiele fase wordt gebruikt om enantiomeren van elkaar te scheiden. In engere zin wordt vaak uitsluitend chirale HPLC bedoeld, omdat dit de meest gebruikte methode is voor farmaceutische kwaliteitscontrole. De essentie is altijd dezelfde: stereospecifieke interactie tussen de chirale selector en de te scheiden enantiomeren zorgt voor een meetbaar retentietijdverschil.
Een chirale scheiding is nodig wanneer men enantiomeren kwalitatief of kwantitatief wil onderscheiden. Typische situaties zijn: (1) kwaliteitscontrole van een enantiomeerzuiver geneesmiddel op aanwezigheid van het spiegelenantiomeer; (2) bepaling van de ee bij asymmetrische synthese; (3) verificatie van de enantiomeerverhouding in een racemisch mengsel; (4) chirale bioanalyse in plasma of urine voor farmacokinetisch onderzoek; (5) authenticiteitscontrole van aroma’s en essentiële oliën. Een vooraf uitgevoerde achirale HPLC-scheiding waarbij alleen één onopgeloste piek wordt gezien, geeft geen informatie over de chirale zuiverheid.
Voor chirale HPLC in normaal-fase modus worden hexaan en heptaan van “voor vloeistofchromatografie”-kwaliteit aanbevolen. Isopropanol en ethanol dienen eveneens in HPLC-grade kwaliteit te worden gebruikt. Bij chirale SFC geldt dat het CO₂ vrij moet zijn van water en organische verontreinigingen. Voor chirale HPLC in omgekeerde-fase modus gelden dezelfde waterkwaliteitseisen als voor reguliere RP-HPLC: ultrapuur water met een lage organische koolstofbelasting. Zie het artikel over zuiverheidsgraden van chemicaliën voor een overzicht van de gangbare HPLC-solventsspecificaties.
Een HPLC-systeem voor chirale analyse bestaat uit dezelfde bouwblokken als een conventioneel systeem: een solventlevering met ontgassing, een binaire of ternaire gradiëntpomp, een geautomatiseerde injector, een kolom in een kolomoven, een detector en chromatografiesoftware. De aanvullende eisen zijn specifiek voor chirale werk:
Voor chirale UHPLC gelden de algemene eisen aan UHPLC-systemen: minimaal extra-kolomvolume, sub-2 µm of core-shell chirale kolommen, en een acquisitiecyclus die snel genoeg is voor de smalle pieken.
Bekijk het assortiment chromatografiebenodigdheden van Labvakhandel of neem contact op voor advies over de juiste chirale kolom en mobiele fase voor uw toepassing.
Disclaimer: De informatie in dit artikel is bedoeld als algemene kennisoverdracht voor professionele gebruikers. Raadpleeg bij twijfel over methodekeuze, veiligheid of regelgeving altijd een gekwalificeerde expert en de relevante farmacopeïsche of regulatoire richtlijnen.
Inloggen
Wachtwoord vergeten
Account aanmaken
Uw winkelwagen is leeg.
